一種堿蓬篩選制備耐堿性木聚糖酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種堿蓬篩選制備耐堿性木聚糖酶的制備方法，屬于耐堿性木聚糖酶制備技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明取葡萄糖、纖維素等混合，經(jīng)高溫滅菌制得細(xì)菌培養(yǎng)基，接種短小芽孢桿菌M?26，培養(yǎng)得短小芽孢桿菌菌落備用，收集堿蓬莖葉碾磨后，與硫酸鉀、硫酸鎂混合滅菌制得空白堿蓬培養(yǎng)基，接種短小芽孢桿菌菌落，重復(fù)培養(yǎng)篩選得耐堿短小芽孢桿菌菌落，過濾得濾液，離心得上清液，與硫酸銨混合，并冰水浴處理，離心得下層沉淀，冷凍干燥制得耐堿性木聚糖酶。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明制備步驟簡單，生產(chǎn)周期縮短了11.2%，產(chǎn)率提高了25.6%以上；所得產(chǎn)品耐高溫性好，耐堿性和酶活性均提高了28～30%，使用效果佳。
【專利說明】
一種堿蓬篩選制備耐堿性木聚糖酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種堿蓬篩選制備耐堿性木聚糖酶的制備方法，屬于耐堿性木聚糖酶制備技術(shù)領(lǐng)域?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]木聚糖酶在自然界分布廣泛，可從動(dòng)物、植物和微生物中獲得。例如，海洋及陸地細(xì)菌、海洋藻類、真菌、酵母菌、瘤胃和反芻動(dòng)物細(xì)菌、蝸牛、甲殼動(dòng)物、陸地植物組織和各種無脊椎動(dòng)物中都有木聚糖酶存在。微生物來源的木聚糖酶普遍存在于自然界中，且種類繁多，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，因此對(duì)微生物木聚糖酶的研究報(bào)道很多。日前研究和應(yīng)用得最多的是細(xì)菌和真菌來源的木聚糖酶，其中，細(xì)菌可以產(chǎn)生堿性和酸性木聚糖酶，而真菌只可產(chǎn)生堿性木聚糖酶。真菌中以絲狀真菌分泌的胞外酶最高。目前，木聚糖酶主要利用真菌和細(xì)菌等微生物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。木聚糖酶可以應(yīng)用在釀造、飼料工業(yè)中。木聚糖酶可以分解釀造或飼料工業(yè)中的原料細(xì)胞壁以及￠-葡聚糖，降低釀造中物料的粘度，促進(jìn)有效物質(zhì)的釋放，以及降低飼料用糧中的非淀粉多糖，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，并因而更易取可溶性脂類成分。堿性木聚糖酶是在堿性條件下具有較高酶活的木聚糖酶。產(chǎn)生的微生物種類較多，主要是細(xì)菌產(chǎn)生，真菌也能產(chǎn)生但較少。堿性木聚糖酶主要用于造紙工業(yè)。造紙常規(guī)漂白是采用次氯酸鹽法，該方法向環(huán)境中排放大量的氯氣，從而污染了環(huán)境。采用堿性木聚糖酶可以代替次氯酸的漂白，從而起到環(huán)境保護(hù)的作用。但目前生產(chǎn)的堿性木聚糖酶生產(chǎn)周期長，產(chǎn)率低， 所得產(chǎn)品耐高溫性差，耐堿性和酶活性低，使用效果差。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題:針對(duì)目前生產(chǎn)的堿性木聚糖酶生產(chǎn)周期長，產(chǎn)率低， 所得產(chǎn)品耐高溫性差，耐堿性和酶活性低，使用效果差的弊端，提供了一種取葡萄糖、纖維素等混合，經(jīng)高溫滅菌制得細(xì)菌培養(yǎng)基，接種短小芽孢桿菌M-26，培養(yǎng)得短小芽孢桿菌菌落備用，收集堿蓬莖葉碾磨后，與硫酸鉀、硫酸鎂混合滅菌制得空白堿蓬培養(yǎng)基，接種短小芽孢桿菌菌落，重復(fù)培養(yǎng)篩選得耐堿短小芽孢桿菌菌落，過濾得濾液，離心得上清液，與硫酸銨混合，并冰水浴處理，離心得下層沉淀，冷凍干燥制得耐堿性木聚糖酶的方法。本發(fā)明通過耐堿植物堿蓬漿液作為發(fā)酵碳源，由于其組織液含堿量較高，進(jìn)行篩選制備耐堿性木聚糖酶，同時(shí)制備步驟簡單，產(chǎn)率高，所得產(chǎn)品耐高溫性好，耐堿性和酶活性高。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下所述的技術(shù)方案是:(1)按重量份數(shù)計(jì)，分別稱量55?75份去離子水、10?20份葡萄糖、5?10份纖維素和5 ?10份硫酸鎂置于培養(yǎng)皿中，攪拌混合并置于l〇〇°C下高溫滅菌處理10?15min，靜置冷卻制備得細(xì)菌培養(yǎng)基，再按接種量10%，將短小芽孢桿菌M-26接種至上述制備的細(xì)菌培養(yǎng)基中，將其置于37°C下，按200?220r/min搖床振蕩培養(yǎng)2?3天，培養(yǎng)得短小芽孢桿菌菌落，備用；(2)收集堿蓬莖葉，對(duì)其洗凈并碾磨成堿蓬漿液，隨后按重量份數(shù)計(jì)，分別稱量55?75份堿蓬漿液、5?10份磷酸鉀和5?10份硫酸鎂攪拌混合并置于培養(yǎng)皿中，在紫外燈下滅菌處理15?20min后，制備得空白堿蓬培養(yǎng)基；(3)按接種量10%，分別將步驟(1)培養(yǎng)的短小芽孢桿菌菌落接種至5份相同質(zhì)量上述制備的空白堿蓬培養(yǎng)基上，控制培養(yǎng)溫度為37°C，在200?220r/min下分別搖床振蕩培養(yǎng)2?3 天；(4)待培養(yǎng)完成后，選取菌絲生長最茂盛的菌落，再按接種量10%，分別接種至5份相同質(zhì)量、步驟(2)制備的空白堿蓬培養(yǎng)基上，保持培養(yǎng)條件不變，繼續(xù)篩選得生長最茂盛的菌落，隨后重復(fù)上述步驟，篩選3?5代，篩選得耐堿短小芽孢桿菌菌落；(5)對(duì)上述制備的耐堿短小芽孢桿菌菌落過濾并收集濾液，將濾液置于7500?8000r/ min下離心分離10?15min，收集上層清液，再按固液比1:5,將硫酸銨添加至上層清液中，攪拌混合并至于0?5 °C下冰水浴處理1?2h，待處理完成后，將其置于8800?10000r/min下離心分離10?15min，收集下層沉淀并對(duì)其真空冷凍干燥，即可制備得一種耐堿性木聚糖酶。
[0005]本發(fā)明的應(yīng)用方法:將本發(fā)明制得的耐堿性木聚糖酶添加至質(zhì)量濃度為7?8%紙漿中，添加量為42?46g/T，控制溫度為50?55°C，紙漿pH為7.5?8.5，在80以1^11下攪拌均勻，靜置50?60min，即可。該耐堿性木聚糖酶耐堿性和酶活性高，耐高溫性好，使用后可有效提高紙漿的漂白率，減少化學(xué)漂白劑的用量，值得推廣與使用。
[0006]本發(fā)明與其他方法相比，有益技術(shù)效果是:(1)本發(fā)明制備步驟簡單，生產(chǎn)周期縮短了 11.2%，產(chǎn)率提高了 25.6%以上；(2)所得產(chǎn)品耐高溫性好，耐堿性和酶活性均提高了 28?30%，使用效果佳?！揪唧w實(shí)施方式】
[0007]首先按重量份數(shù)計(jì)，分別稱量55?75份去離子水、10?20份葡萄糖、5?10份纖維素和5?10份硫酸鎂置于培養(yǎng)皿中，攪拌混合并置于100°C下高溫滅菌處理10?15min，靜置冷卻制備得細(xì)菌培養(yǎng)基，再按接種量10%，將短小芽孢桿菌M-26接種至上述制備的細(xì)菌培養(yǎng)基中，將其置于37°C下，按200?220r/min搖床振蕩培養(yǎng)2?3天，培養(yǎng)得短小芽孢桿菌菌落， 備用；然后收集堿蓬莖葉，對(duì)其洗凈并碾磨成堿蓬漿液，隨后按重量份數(shù)計(jì)，分別稱量55? 75份堿蓬漿液、5?10份磷酸鉀和5?10份硫酸鎂攪拌混合并置于培養(yǎng)皿中，在紫外燈下滅菌處理15?20min后，制備得空白堿蓬培養(yǎng)基;再按接種量10%，分別將培養(yǎng)的短小芽孢桿菌菌落接種至5份相同質(zhì)量上述制備的空白堿蓬培養(yǎng)基上，控制培養(yǎng)溫度為37°C，在200? 220r/min下分別搖床振蕩培養(yǎng)2?3天;待培養(yǎng)完成后，選取菌絲生長最茂盛的菌落，再按接種量10%，分別接種至5份相同質(zhì)量、制備的空白堿蓬培養(yǎng)基上，保持培養(yǎng)條件不變，繼續(xù)篩選得生長最茂盛的菌落，隨后重復(fù)上述步驟，篩選3?5代，篩選得耐堿短小芽孢桿菌菌落； 最后對(duì)上述制備的耐堿短小芽孢桿菌菌落過濾并收集濾液，將濾液置于7500?8000r/min 下離心分離10?15min，收集上層清液，再按固液比1:5,將硫酸銨添加至上層清液中，攪拌混合并至于〇?5°C下冰水浴處理1?2h，待處理完成后，將其置于8800?10000r/min下離心分離10?15min，收集下層沉淀并對(duì)其真空冷凍干燥，即可制備得一種耐堿性木聚糖酶。
[0008]實(shí)例 1首先按重量份數(shù)計(jì)，分別稱量55份去離子水、20份葡萄糖、10份纖維素和10份硫酸鎂置于培養(yǎng)皿中，攪拌混合并置于100°C下高溫滅菌處理10min，靜置冷卻制備得細(xì)菌培養(yǎng)基，再按接種量10%，將短小芽孢桿菌M-26接種至上述制備的細(xì)菌培養(yǎng)基中，將其置于37°C下，按 200r/min搖床振蕩培養(yǎng)2天，培養(yǎng)得短小芽孢桿菌菌落，備用;然后收集堿蓬莖葉，對(duì)其洗凈并碾磨成堿蓬漿液，隨后按重量份數(shù)計(jì)，分別稱量55份堿蓬漿液、5份磷酸鉀和5份硫酸鎂攪拌混合并置于培養(yǎng)皿中，在紫外燈下滅菌處理15min后，制備得空白堿蓬培養(yǎng)基;再按接種量10%，分別將培養(yǎng)的短小芽孢桿菌菌落接種至5份相同質(zhì)量上述制備的空白堿蓬培養(yǎng)基上，控制培養(yǎng)溫度為37°C，在200r/min下分別搖床振蕩培養(yǎng)2天;待培養(yǎng)完成后，選取菌絲生長最茂盛的菌落，再按接種量10%，分別接種至5份相同質(zhì)量、制備的空白堿蓬培養(yǎng)基上，保持培養(yǎng)條件不變，繼續(xù)篩選得生長最茂盛的菌落，隨后重復(fù)上述步驟，篩選3代，篩選得耐堿短小芽孢桿菌菌落;最后對(duì)上述制備的耐堿短小芽孢桿菌菌落過濾并收集濾液，將濾液置于7500r/min下離心分離lOmin，收集上層清液，再按固液比1:5,將硫酸銨添加至上層清液中，攪拌混合并至于〇°C下冰水浴處理lh，待處理完成后，將其置于8800r/min下離心分離 lOmin，收集下層沉淀并對(duì)其真空冷凍干燥，即可制備得一種耐堿性木聚糖酶。
[0009]將本發(fā)明制得的耐堿性木聚糖酶添加至粘度為7%紙漿中，添加量為42g/T，控制溫度為50°C，紙漿pH為7.5,在80r/min下攪拌均勻，靜置50min，即可。該耐堿性木聚糖酶耐堿性和酶活性高，耐高溫性好，使用后可有效提高紙漿的漂白率，減少化學(xué)漂白劑的用量，值得推廣與使用。
[0010]實(shí)例2首先按重量份數(shù)計(jì)，分別稱量65份去離子水、15份葡萄糖、8份纖維素和8份硫酸鎂置于培養(yǎng)皿中，攪拌混合并置于l〇〇°C下高溫滅菌處理13min，靜置冷卻制備得細(xì)菌培養(yǎng)基，再按接種量10%，將短小芽孢桿菌M-26接種至上述制備的細(xì)菌培養(yǎng)基中，將其置于37°C下，按 210r/min搖床振蕩培養(yǎng)3天，培養(yǎng)得短小芽孢桿菌菌落，備用;然后收集堿蓬莖葉，對(duì)其洗凈并碾磨成堿蓬漿液，隨后按重量份數(shù)計(jì)，分別稱量65份堿蓬漿液、8份磷酸鉀和7份硫酸鎂攪拌混合并置于培養(yǎng)皿中，在紫外燈下滅菌處理18min后，制備得空白堿蓬培養(yǎng)基;再按接種量10%，分別將培養(yǎng)的短小芽孢桿菌菌落接種至5份相同質(zhì)量上述制備的空白堿蓬培養(yǎng)基上，控制培養(yǎng)溫度為37°C，在210r/min下分別搖床振蕩培養(yǎng)3天;待培養(yǎng)完成后，選取菌絲生長最茂盛的菌落，再按接種量10%，分別接種至5份相同質(zhì)量、制備的空白堿蓬培養(yǎng)基上，保持培養(yǎng)條件不變，繼續(xù)篩選得生長最茂盛的菌落，隨后重復(fù)上述步驟，篩選4代，篩選得耐堿短小芽孢桿菌菌落;最后對(duì)上述制備的耐堿短小芽孢桿菌菌落過濾并收集濾液，將濾液置于7750r/min下離心分離13min，收集上層清液，再按固液比1:5,將硫酸銨添加至上層清液中，攪拌混合并至于3°C下冰水浴處理2h，待處理完成后，將其置于8900r/min下離心分離 13min，收集下層沉淀并對(duì)其真空冷凍干燥，即可制備得一種耐堿性木聚糖酶。
[0011]將本發(fā)明制得的耐堿性木聚糖酶添加至粘度為8%紙漿中，添加量為44g/T，控制溫度為53°C，紙漿pH為8.0,在80r/min下攪拌均勻，靜置55min，即可。該耐堿性木聚糖酶耐堿性和酶活性高，耐高溫性好，使用后可有效提高紙漿的漂白率，減少化學(xué)漂白劑的用量，值得推廣與使用。
[0012]實(shí)例3首先按重量份數(shù)計(jì)，分別稱量75份去離子水、10份葡萄糖、5份纖維素和5份硫酸鎂置于培養(yǎng)皿中，攪拌混合并置于l〇〇°C下高溫滅菌處理15min，靜置冷卻制備得細(xì)菌培養(yǎng)基，再按接種量10%，將短小芽孢桿菌M-26接種至上述制備的細(xì)菌培養(yǎng)基中，將其置于37°C下，按220r/min搖床振蕩培養(yǎng)3天，培養(yǎng)得短小芽孢桿菌菌落，備用;然后收集堿蓬莖葉，對(duì)其洗凈并碾磨成堿蓬漿液，隨后按重量份數(shù)計(jì)，分別稱量75份堿蓬漿液、10份磷酸鉀和10份硫酸鎂攪拌混合并置于培養(yǎng)皿中，在紫外燈下滅菌處理20min后，制備得空白堿蓬培養(yǎng)基;再按接種量10%，分別將培養(yǎng)的短小芽孢桿菌菌落接種至5份相同質(zhì)量上述制備的空白堿蓬培養(yǎng)基上，控制培養(yǎng)溫度為37°C，在220r/min下分別搖床振蕩培養(yǎng)3天;待培養(yǎng)完成后，選取菌絲生長最茂盛的菌落，再按接種量10%，分別接種至5份相同質(zhì)量、制備的空白堿蓬培養(yǎng)基上，保持培養(yǎng)條件不變，繼續(xù)篩選得生長最茂盛的菌落，隨后重復(fù)上述步驟，篩選5代，篩選得耐堿短小芽孢桿菌菌落;最后對(duì)上述制備的耐堿短小芽孢桿菌菌落過濾并收集濾液，將濾液置于8000r/min下離心分離15min，收集上層清液，再按固液比1:5，將硫酸銨添加至上層清液中，攪拌混合并至于5°C下冰水浴處理2h，待處理完成后，將其置于lOOOOr/min下離心分離 15min，收集下層沉淀并對(duì)其真空冷凍干燥，即可制備得一種耐堿性木聚糖酶。[〇〇13]將本發(fā)明制得的耐堿性木聚糖酶添加至粘度為8%紙漿中，添加量為46g/T，控制溫度為55°C，紙漿pH為8.5,在80r/min下攪拌均勻，靜置60min，即可。該耐堿性木聚糖酶耐堿性和酶活性高，耐高溫性好，使用后可有效提高紙漿的漂白率，減少化學(xué)漂白劑的用量，值得推廣與使用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種堿蓬篩選制備耐堿性木聚糖酶的制備方法，其特征在于具體制備步驟為:(1)按重量份數(shù)計(jì)，分別稱量55?75份去離子水、10?20份葡萄糖、5?10份纖維素和5 ?10份硫酸鎂置于培養(yǎng)皿中，攪拌混合并置于l〇〇°C下高溫滅菌處理10?15min，靜置冷卻 制備得細(xì)菌培養(yǎng)基，再按接種量10%，將短小芽孢桿菌M-26接種至上述制備的細(xì)菌培養(yǎng)基 中，將其置于37°C下，按200?220r/min搖床振蕩培養(yǎng)2?3天，培養(yǎng)得短小芽孢桿菌菌落，備 用；(2)收集堿蓬莖葉，對(duì)其洗凈并碾磨成堿蓬漿液，隨后按重量份數(shù)計(jì)，分別稱量55?75 份堿蓬漿液、5?10份磷酸鉀和5?10份硫酸鎂攪拌混合并置于培養(yǎng)皿中，在紫外燈下滅菌 處理15?20min后，制備得空白堿蓬培養(yǎng)基；(3)按接種量10%，分別將步驟(1)培養(yǎng)的短小芽孢桿菌菌落接種至5份相同質(zhì)量上述制 備的空白堿蓬培養(yǎng)基上，控制培養(yǎng)溫度為37°C，在200?220r/min下分別搖床振蕩培養(yǎng)2?3 天；(4)待培養(yǎng)完成后，選取菌絲生長最茂盛的菌落，再按接種量10%，分別接種至5份相同 質(zhì)量、步驟(2)制備的空白堿蓬培養(yǎng)基上，保持培養(yǎng)條件不變，繼續(xù)篩選得生長最茂盛的菌 落，隨后重復(fù)上述步驟，篩選3?5代，篩選得耐堿短小芽孢桿菌菌落；(5)對(duì)上述制備的耐堿短小芽孢桿菌菌落過濾并收集濾液，將濾液置于7500?8000r/ min下離心分離10?15min，收集上層清液，再按固液比1:5,將硫酸銨添加至上層清液中，攪 拌混合并至于0?5 °C下冰水浴處理1?2h，待處理完成后，將其置于8800?10000r/min下離 心分離10?15min，收集下層沉淀并對(duì)其真空冷凍干燥，即可制備得一種耐堿性木聚糖酶。
【文檔編號(hào)】C12R1/08GK105969752SQ201610484353
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】郭迎慶, 盛海豐, 高玉剛
【申請(qǐng)人】郭迎慶