控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子及其獲得方法和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)，所述啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。還提供了一種控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方法，以及控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子或根據(jù)控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方法獲得的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子在控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)中的應(yīng)用。本發(fā)明的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子能夠控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)，為研究基因在玉米籽粒中的特異表達(dá)情況奠定良好的基礎(chǔ)，促進(jìn)玉米籽粒中基因表達(dá)研究的進(jìn)展，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子及其獲得方法和 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及控制基因特異表達(dá)的啟動(dòng)子技 術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子及其獲得方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]基因表達(dá)（gene expression)是指細(xì)胞在生命過(guò)程中，把儲(chǔ)存在脫氧核糖核酸 (DNA)序列中的遺傳信息經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。該過(guò)程決定 了細(xì)胞的分化及形態(tài)的發(fā)生。每個(gè)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生信使核糖核酸(mRNA)的量，受到多種因素 的調(diào)控，最終影響個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能?；蛘{(diào)控是現(xiàn)代分子生物學(xué)研 究的中心課題之一。
[0003] 啟動(dòng)子(Promoters)是RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn) 錄)的起始時(shí)間和表達(dá)的程度，就像"開(kāi)關(guān)"一樣決定基因的活動(dòng)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄模式及功能，啟 動(dòng)子可分為三類(lèi):組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。目前，在植物 基因工程中使用的大多數(shù)為組成型啟動(dòng)子，在所有組織或器官中都起作用，使得外源基因 在植物的所有組織或器官中都表達(dá)。這類(lèi)啟動(dòng)子不能控制基因的專(zhuān)化性表達(dá)，并且過(guò)度消 耗細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量，造成不必要的能源浪費(fèi)。
[0004] 玉米作為我國(guó)第一大作物，是不可或缺的重要糧食及飼料來(lái)源，對(duì)其產(chǎn)量的研究 一直是重中之重。玉米籽粒是決定產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，玉米籽粒中基因的表達(dá)模式?jīng)Q定了各 個(gè)籽粒性狀并影響到最終產(chǎn)量。已經(jīng)有越來(lái)越多的研究人員通過(guò)轉(zhuǎn)基因或其他手段分析基 因在玉米籽粒中的特異表達(dá)情況。但由于缺乏能夠控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng) 子，嚴(yán)重影響了玉米籽粒中基因表達(dá)研究的進(jìn)展。
[0005 ]因此，需要提供一種控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子，從而能夠控制基 因在玉米籽粒中特異表達(dá)，為研究基因在玉米籽粒中的特異表達(dá)情況奠定良好的基礎(chǔ)，促 進(jìn)玉米籽粒中基因表達(dá)研究的進(jìn)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種控制基因在玉 米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子，其能夠控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)，為研究基因在玉米 籽粒中的特異表達(dá)情況奠定良好的基礎(chǔ)，促進(jìn)玉米籽粒中基因表達(dá)研究的進(jìn)展，適于大規(guī) 模推廣應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲 得方法，通過(guò)該方法能夠獲得控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子，而且操作簡(jiǎn)單方 便，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的應(yīng) 用，從而控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)，為研究基因在玉米籽粒中的特異表達(dá)情況奠定 良好的基礎(chǔ)，促進(jìn)玉米籽粒中基因表達(dá)研究的進(jìn)展，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0009] 為達(dá)到以上目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種控制基因在玉米籽粒中特異 表達(dá)的啟動(dòng)子，其特點(diǎn)是，所述啟動(dòng)子控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)，所述啟動(dòng)子的核苷 酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0010] 上述基因既包括所述玉米籽粒中原本存在的基因，也包括外源基因。
[0011] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲 得方法，其特點(diǎn)是，所述獲得方法包括以下步驟：
[0012] (1)選擇至少2個(gè)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)，所述高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)采用在 不同發(fā)育時(shí)期的玉米不同組織進(jìn)行構(gòu)建，所述不同組織包括玉米籽粒，將所述高通量轉(zhuǎn)錄 組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA序列錨定到玉米自交系B73V2版參考基因組上，獲得在所述玉米自交 系B73V2版參考基因組中具有單一錨定位點(diǎn)的待選RNA序列，根據(jù)所述待選RNA序列獲得其 錨定的所述玉米自交系B73V2版參考基因組中的待選基因；
[0013] (2)計(jì)算各所述待選基因的各轉(zhuǎn)錄本的FPKM值，計(jì)算所述轉(zhuǎn)錄本在所述不同組織 中表達(dá)的表達(dá)特異性SPM值，篩選在所述至少2個(gè)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中在所述玉米籽 粒中所述表達(dá)特異性SPM值均達(dá)到最高5%且大于0.9、在所述不同組織的除所述玉米籽粒 以外的其它組織中所述FPKM值小于20的候選轉(zhuǎn)錄本，獲得所述候選轉(zhuǎn)錄本對(duì)應(yīng)的候選基 因；
[0014] (3)選取其中一個(gè)所述候選基因作為目標(biāo)基因，根據(jù)所述玉米自交系B73V2版參考 基因組的序列信息，利用生物信息學(xué)方法定位所述目標(biāo)基因并預(yù)測(cè)所述目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)；
[0015] (4)獲取所述目標(biāo)基因的起始密碼子的上游序列并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)所述 目標(biāo)基因的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子即為所述的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0016] 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)是指采用高通量測(cè)序技術(shù)例如Illumina/Solexa技術(shù)、Roche/ LS454技術(shù)、ABI/S0LID技術(shù)以及HELI⑶S單分子測(cè)序技術(shù)測(cè)量得到的基因組和轉(zhuǎn)錄組高通 量數(shù)據(jù)。例如NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心）的SRA(Sequen Ce Read Achive)數(shù)據(jù)庫(kù)用 于存儲(chǔ)、顯示、提取和分析高通量測(cè)序數(shù)據(jù)。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)是在轉(zhuǎn)錄組水平上進(jìn) 行的高通量測(cè)序。
[0017] "所述高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)采用在不同發(fā)育時(shí)期的玉米不同組織進(jìn)行構(gòu)建" 意思是采用玉米的多個(gè)不同組織，且在多個(gè)不同發(fā)育時(shí)期分別采集玉米的多個(gè)不同組織， 然后對(duì)其轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測(cè)序來(lái)進(jìn)行構(gòu)建。
[0018] 所述高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)目可以根據(jù)需要確定，較佳地，所述高通量轉(zhuǎn) 錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)目為3個(gè)。
[0019] 所述高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)可以是任何的高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)，只要其采 用在不同發(fā)育時(shí)期的玉米的不同組織進(jìn)行構(gòu)建即可，較佳地，所述高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù) 庫(kù)分別為NCBI的SRP006463數(shù)據(jù)庫(kù)、SRP010680數(shù)據(jù)庫(kù)和SRP014652數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0020] 所述玉米不同組織可以采用任何合適的組織，較佳地，所述玉米不同組織還包括 選自根、葉、穗軸、穗絲和花藥中的至少一種。
[0021] 所述不同發(fā)育時(shí)期可以是任何合適的發(fā)育時(shí)期，較佳地，所述不同發(fā)育時(shí)期包括 抽穗期和灌漿期。
[0022] 為了減少結(jié)合特異性太低導(dǎo)致的繁重的運(yùn)算量，較佳地，在所述錨定之前，將長(zhǎng)度 小于20bp的所述RNA序列去掉。當(dāng)然，這個(gè)具體長(zhǎng)度可以根據(jù)需要確定，例如可以將長(zhǎng)度小 于25bp的所述RNA序列去掉，或是將長(zhǎng)度小于15bp的所述RNA序列去掉。
[0023]為了減少背景干擾，較佳地，在計(jì)算所述SPM值之前，將所述FPKM值小于10的所述 轉(zhuǎn)錄本去掉。當(dāng)然，這個(gè)具體所述FPKM值可以根據(jù)需要確定，例如所述FPKM值小于15的所述 轉(zhuǎn)錄本去掉，或是所述FPKM值小于5的所述轉(zhuǎn)錄本去掉。
[0024]所述目標(biāo)基因可以是任何合適的候選基因，只要其在所述至少2個(gè)高通量轉(zhuǎn)錄組 測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中均出現(xiàn)即可，較佳地，所述目標(biāo)基因?yàn)镚RMZM2G044625基因。
[0025]在本發(fā)明的第三方面，提供了上述的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子或 根據(jù)上述的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方法獲得的控制基因在玉米 籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子在控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)中的應(yīng)用。
[0026]本發(fā)明的有益效果在于：
[0027] a.本發(fā)明的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子控制基因在玉米籽粒中特 異表達(dá)，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，因此，采用該啟動(dòng)子能夠控制基因在玉米籽粒 中特異表達(dá)，為研究基因在玉米籽粒中的特異表達(dá)情況奠定良好的基礎(chǔ)，促進(jìn)玉米籽粒中 基因表達(dá)研究的進(jìn)展，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0028] b.本發(fā)明的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方法通過(guò)選擇至少2 個(gè)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得在玉米自交系B73V2版參考基因組中具有單一錨定位點(diǎn) 的待選RNA序列，進(jìn)而獲得其對(duì)應(yīng)的待選基因；計(jì)算各待選基因的各轉(zhuǎn)錄本的FPKM值和在不 同組織中表達(dá)的表達(dá)特異性SPM值，篩選在至少2個(gè)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中在玉米籽粒 中表達(dá)特異性SPM值均達(dá)到最高5%且大于0.9、在不同組織的除玉米籽粒以外的其它組織 中FPKM值小于20的候選轉(zhuǎn)錄本，獲得候選轉(zhuǎn)錄本對(duì)應(yīng)的候選基因；選取其中一個(gè)候選基因 作為目標(biāo)基因，根據(jù)玉米自交系B73V2版參考基因組的序列信息，利用生物信息學(xué)方法定位 目標(biāo)基因并預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu);獲取目標(biāo)基因的起始密碼子的上游序列并利用生物信息學(xué)方法預(yù) 測(cè)目標(biāo)基因的啟動(dòng)子，得到控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子，因此，通過(guò)該方法能 夠獲得控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子，而且操作簡(jiǎn)單方便，適于大規(guī)模推廣應(yīng) 用。
[0029] c .本發(fā)明的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子或根據(jù)上述的控制基因在 玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方法獲得的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng) 子在控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)中的應(yīng)用，使得控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)成為 可能，為研究基因在玉米籽粒中的特異表達(dá)情況奠定良好的基礎(chǔ)，促進(jìn)玉米籽粒中基因表 達(dá)研究的進(jìn)展，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0030] 本發(fā)明的這些和其它目的、特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，通過(guò)下述的詳細(xì)說(shuō)明，附圖和權(quán)利要求得 以充分體現(xiàn)，并可通過(guò)所附權(quán)利要求中特地指出的手段、裝置和它們的組合得以實(shí)現(xiàn)。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1是采用本發(fā)明的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子融合紅色熒光蛋白 質(zhì)(RFP)基因轉(zhuǎn)基因玉米獲得的轉(zhuǎn)基因玉米的玉米籽粒的照片，其中RFP基因得到表達(dá)的玉 米籽粒呈紅色(見(jiàn)箭頭所示）。
[0032]圖2是圖1的玉米籽粒中熒光所在位置(見(jiàn)箭頭所示)的照片。
[0033]圖3是使用共聚焦顯微鏡觀測(cè)圖1的玉米籽粒從而觀測(cè)到的紅色熒光（見(jiàn)箭頭所 示）的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0034]本發(fā)明的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子可以控制基因在玉米籽粒中 特異表達(dá)，所述啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0035]該啟動(dòng)子可以通過(guò)以下方法獲得：
[0036] (1)選擇多個(gè)源于玉米不同組織、不同發(fā)育時(shí)期構(gòu)建的高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA- seq)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用SolexaQA軟件將RNA-seq的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，除去長(zhǎng)度低于20bp的序列，以 避免結(jié)合特異性太低。利用Bowtie軟件將得到的序列錨定到玉米自交系B73V2版參考基因 組上，當(dāng)一個(gè)序列能夠錨定到基因組上的不同位點(diǎn)，則除去該序列，只選擇在基因組中有單 一位點(diǎn)的序列，稱(chēng)為待選RNA序列，進(jìn)而獲得其對(duì)應(yīng)的待選基因；
[0037] (2)使用Cuff links軟件計(jì)算各待選基因的各轉(zhuǎn)錄本的FPKM值（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)，去掉FPKM小于 10的轉(zhuǎn)錄本，余下 的轉(zhuǎn)錄本用于后續(xù)分析，計(jì)算轉(zhuǎn)錄本在不同組織中表達(dá)的表達(dá)特異性SPM值(表達(dá)特異性系 數(shù)），篩選在上述多個(gè)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中在所述玉米籽粒中表達(dá)特異性SPM值均達(dá) 到最高5%且大于0.9、在所述不同組織的除所述玉米籽粒以外的其它組織中所述FPKM值小 于20的轉(zhuǎn)錄本，稱(chēng)為候選轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而獲得對(duì)應(yīng)的候選基因；
[0038] (3)選取其中一個(gè)候選基因作為目標(biāo)基因，利用玉米品種B73的V2版基因組序列信 息，利用生物信息學(xué)方法定位該目標(biāo)基因并預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)。
[0039] (4)搜索該目標(biāo)基因的起始密碼子ATG的上游序列，使用TSSP軟件預(yù)測(cè)其啟動(dòng)子。
[0040] (5)克隆其啟動(dòng)子序列，與紅色熒光蛋白質(zhì)(RFP)融合。轉(zhuǎn)入玉米品種中，檢測(cè)該整 合蛋白在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況。
[0041]為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明。
[0042] 實(shí)施例1:
[0043] 從玉米R(shí)NA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)（http: //trace .ncbi .nlm.nih. gov/Traces/sra/sra. cgi? study = SRP006463；http://trace .ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?study = SRP010680;http://trace.ncbi.nl m.nih·gov/Traces/sra/sra.cgi?study = SRP014652) 中下載不同組織(根、葉、穗軸、穗絲、花藥和籽粒）、不同發(fā)育時(shí)期（抽穗期、灌漿期)測(cè)得的 RNA-seq 數(shù)據(jù)。
[0044] 首先使用 SolexaQA (Cox，Μ·Ρ·，Peters on, D.A.&Biggs，P.J. SolexaQA: A t_a_ glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data.BMC bioinformatics 11,485(2010))對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，除去質(zhì)量比較差的數(shù)據(jù)，只留下長(zhǎng) 度超過(guò)20bp的序列。
[0045] 通過(guò) Bowtie2v2 · 1 · 0(Langmead B et al · Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.Genome Biol 2009,10:R25) 將上述序列錨定到玉米參考基因組B73v2 (http : //www · maizegdb · org/data_center/ sequence)的序列上。當(dāng)一個(gè)序列能夠錨定到基因組上的不同位點(diǎn)，則除去該序列，只選擇 在基因組中有單一位點(diǎn)的序列，稱(chēng)為待選RNA序列，進(jìn)而獲得對(duì)應(yīng)的待選基因。
[0046]然后利用Cuffl inks(v2 · 1 · 1) (Trapnell，C · et al · Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.Nature biotechnology 2010,28,511-515)計(jì) 算各候選基因的各轉(zhuǎn)錄本的FPKM值（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)來(lái)反映各候選基因的表達(dá)水平。去掉FPKM值小于10的轉(zhuǎn)錄本，余下 的轉(zhuǎn)錄本用于后續(xù)分析。
[0047]計(jì)算各轉(zhuǎn)錄本在不同組織中表達(dá)的表達(dá)特異性SPM值(表達(dá)特異性系數(shù)）（Xiao S-J et al.TiSGeD:a database for tissue-specific genes Bioinformatics 2010 26: 1273-1275)，SPM值(0~1)越大表明轉(zhuǎn)錄本在該組織中表達(dá)的特異性越強(qiáng)。篩選不同數(shù)據(jù)庫(kù) 中在籽粒中的SPM值都達(dá)到前5 %且大于0.9，而且在其它組織中的表達(dá)量FPKM值小于20的 轉(zhuǎn)錄本，稱(chēng)為候選轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而獲得對(duì)應(yīng)的候選基因。發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)候選基因 GRMZM2G044625基因在三個(gè)不同RNA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)中的表達(dá)特異性都達(dá)到發(fā)明人期望的標(biāo)準(zhǔn) (請(qǐng)參見(jiàn)表1和表2)，且在三個(gè)不同1^^- 8叫數(shù)據(jù)庫(kù)中在籽粒中的5?1值都達(dá)到前5%。該基因 在玉米籽粒中特異表達(dá)，可能是由其啟動(dòng)子調(diào)控的。
[0048] 表1籽粒特異性表達(dá)基因 GRMZM2G044625在三個(gè)不同數(shù)據(jù)庫(kù)中不同組織中的表達(dá) 特異性SPM值
[0050] 表2籽粒特異性表達(dá)基因 GRMZM2G044625在三個(gè)不同數(shù)據(jù)庫(kù)中不同組織中的平均 表達(dá)量(FPKM)
[0052] 根據(jù)玉米品種B73的V2版基因組序列信息，利用生物信息學(xué)方法定位 GRMZM2G044625并預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)。其位于玉米第4染色體5，117，781-5，118，581，含有267個(gè)氨 基酸，無(wú)內(nèi)含子。搜索該基因起始密碼子ATG的上游序列，使用TSSP軟件預(yù)測(cè)其啟動(dòng)子，結(jié)果 表明該啟動(dòng)子的所有元件都包括在其上游1 〇〇〇bp范圍內(nèi)。
[0053] 克隆GRMZM2G044625起始密碼子ATG上游1000bp的啟動(dòng)子序列（如SEQ ID N0:1所 示），將其與紅色熒光蛋白質(zhì)(RFP)基因融合。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入玉米品種H99中，檢測(cè) 該整合基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示該融合基因只在玉米籽粒中表達(dá)，而在 玉米的其他組織中監(jiān)測(cè)不到任何熒光信號(hào)（請(qǐng)參見(jiàn)圖1-圖3)。表明該啟動(dòng)子能夠控制基因 在玉米籽粒中的特異表達(dá)。
[0054] 本發(fā)明通過(guò)本發(fā)明的上述的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方 法獲得了控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子，通過(guò)構(gòu)建融合基因并轉(zhuǎn)基因玉米，鑒 定該啟動(dòng)子可以控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)。
[0055] 綜上所述，本發(fā)明的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子能夠控制基因在玉 米籽粒中特異表達(dá)，為研究基因在玉米籽粒中的特異表達(dá)情況奠定良好的基礎(chǔ)，促進(jìn)玉米 籽粒中基因表達(dá)研究的進(jìn)展，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0056]在此說(shuō)明書(shū)中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出 各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說(shuō)明書(shū)和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說(shuō)明性的 而非限制性的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子，其特征在于，所述啟動(dòng)子控制基因 在玉米籽粒中特異表達(dá)，所述啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -種控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方法，其特征在于，所述獲得 方法包括以下步驟： (1) 選擇至少2個(gè)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)，所述高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)采用在不同 發(fā)育時(shí)期的玉米不同組織進(jìn)行構(gòu)建，所述不同組織包括玉米籽粒，將所述高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè) 序數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA序列錨定到玉米自交系B73V2版參考基因組上，獲得在所述玉米自交系 B73V2版參考基因組中具有單一錨定位點(diǎn)的待選RNA序列，根據(jù)所述待選RNA序列獲得其錨 定的所述玉米自交系B73V2版參考基因組中的待選基因； (2) 計(jì)算各所述待選基因的各轉(zhuǎn)錄本的FPKM值，計(jì)算所述轉(zhuǎn)錄本在所述不同組織中表 達(dá)的表達(dá)特異性SPM值，篩選在所述至少2個(gè)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中在所述玉米籽粒中 所述表達(dá)特異性SPM值均達(dá)到最高5%且大于0.9、在所述不同組織的除所述玉米籽粒以外 的其它組織中所述FPKM值小于20的候選轉(zhuǎn)錄本，獲得所述候選轉(zhuǎn)錄本對(duì)應(yīng)的候選基因； (3) 選取其中一個(gè)所述候選基因作為目標(biāo)基因，根據(jù)所述玉米自交系B73V2版參考基因 組的序列信息，利用生物信息學(xué)方法定位所述目標(biāo)基因并預(yù)測(cè)所述目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)； (4) 獲取所述目標(biāo)基因的起始密碼子的上游序列并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)所述目標(biāo) 基因的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子即為所述的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方法，其特 征在于，所述高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)目為3個(gè)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方法，其特 征在于，所述高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)分別為NCBI的SRP006463數(shù)據(jù)庫(kù)、SRP010680數(shù)據(jù)庫(kù) 和SRP014652數(shù)據(jù)庫(kù)。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方法，其特 征在于，所述玉米不同組織還包括選自根、葉、穗軸、穗絲和花藥中的至少一種。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方法，其特 征在于，所述不同發(fā)育時(shí)期包括抽穗期和灌漿期。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方法，其特 征在于，在所述錨定之前，將長(zhǎng)度小于20bp的所述RNA序列去掉。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方法，其特 征在于，在計(jì)算所述SPM值之前，將所述FPKM值小于10的所述轉(zhuǎn)錄本去掉。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方法，其特 征在于，所述目標(biāo)基因?yàn)镚RMZM2G044625基因。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子或根據(jù)權(quán)利要求 2-9任一項(xiàng)所述的控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子的獲得方法獲得的控制基因在 玉米籽粒中特異表達(dá)的啟動(dòng)子在控制基因在玉米籽粒中特異表達(dá)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK105969769SQ201610320065
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月13日
【發(fā)明人】林峰, 趙涵
【申請(qǐng)人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院