葉綠體自發(fā)熒光相關(guān)小分子rna及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)以及植物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種植物光響應(yīng)小分子RNA及其應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，miR408可作為作用靶點用于調(diào)控植物光合作用過程中自發(fā)熒光量、自發(fā)熒光的最大熒光值以及自發(fā)熒光在目標(biāo)區(qū)域的平均輻射率。本發(fā)明為運用轉(zhuǎn)基因等分子育種技術(shù)培育能夠改變植株光合作用最大熒光值能力以及耐低銅生長環(huán)境及銅高效循環(huán)利用的農(nóng)作物新品種，提供非常有價值的基因資源。
【專利說明】
葉綠體自發(fā)熒光相關(guān)小分子RNA及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)以及植物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種植物光響應(yīng)小分子RNA及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)是一類廣泛存在于多種生物體中，不編碼蛋 白質(zhì)的RNA分子。真核生物中存在多種非編碼RNA，轉(zhuǎn)運RNA(tRNAs)、siRNA、microRNA及長鏈 非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNAs)等。它們直接以RNA分子的形式在植物體內(nèi)發(fā) 揮重要的調(diào)節(jié)功能，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控或者轉(zhuǎn)錄抑制等方式調(diào)控靶基因的表達，從而影響細 胞分化、個體發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物及非生物抗性等。其中，miRNA以其在多種植物多個基因 中的調(diào)控作用以及對mi RNA自身調(diào)控中的作用成為目前小分子RNA的研究熱點。Mi RNA是一 類內(nèi)源性、長度在19-25個堿基的小分子非編碼RNA，在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控或轉(zhuǎn)錄抑制中發(fā)揮 重要功能。MiRNA在細胞核內(nèi)由RNA聚合酶II(pol II)轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生miRNA前體(pri-miRNA)，通 過其自身包含的互補結(jié)構(gòu)折疊形成具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)卡型雙鏈RNA，由DCL1酶兩次切割并在 HYL1、SE等精確切割輔助蛋白的作用下形成21nt的miRNA:miRNA*結(jié)構(gòu)的雙鏈小RNA，并在 HASTY蛋白的協(xié)助下由核內(nèi)運輸?shù)郊毎|(zhì)。在細胞質(zhì)中AG01蛋白結(jié)合形成基因沉默復(fù)合物 RISC，其中一條單鏈保留在這一復(fù)合體中，指導(dǎo)祀mRNA的降解或轉(zhuǎn)錄抑制，另一條單鏈可能 與21nt的雙鏈小RNA的再次切割形成有關(guān)。目前植物miRNA的生物途徑、克隆及功能分析已 經(jīng)在許多植物中展開，功能分析的關(guān)注點集中于植物生長發(fā)育及逆境脅迫兩個方面。
[0003] 植物miRNA-直是研究的熱點，目前已經(jīng)確定miRNA與植物的生長發(fā)育、植物生理、 抗性等方面有著密切的聯(lián)系。其中，調(diào)控植株生長發(fā)育是miRNA最關(guān)鍵的作用之一，主要包 括調(diào)控植株的形態(tài)建成、開花、結(jié)果、衰老等關(guān)鍵的植物生長發(fā)育階段。針對植株光響應(yīng)相 關(guān)基因、成花相關(guān)基因被miRNA所調(diào)控的研究已經(jīng)很多，而AGO蛋白（miRNA途徑中的關(guān)鍵中 心蛋白）的缺失突變體研究也發(fā)現(xiàn)其可以影響到植株的光響應(yīng)導(dǎo)致畸形花的發(fā)生。對花發(fā) 育過程中的關(guān)鍵基因的研究也顯示miR172可以通過控制AP2基因的表達影響植株開花早 晚，同時也可以造成花發(fā)育畸形。也用研究表明過表達miR159能夠延長開花等。這一系列的 研究都證實miRNA與植物生長發(fā)育及開花相關(guān)，miRNA參與光響應(yīng)途徑。而到目前為止還沒 有miR408與參與光合途徑的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種植物光響應(yīng)小分 子RNA及其應(yīng)用。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供miR408作為作用靶點用于調(diào)控植物光合作用過程中自發(fā) 熒光量的用途。
[0007] 所述調(diào)控包括正向調(diào)控和負向調(diào)控。
[0008] 進一步地，miR408作為作用靶點用于調(diào)控植物光合作用過程中自發(fā)熒光量包括兩 方面的內(nèi)容:其一，將miR408作為作用對象，降低miR408表達從而對植物光合作用過程中自 發(fā)熒光量進行負向調(diào)控;將miR408作為作用對象，提高mi R408表達從而對植物光合作用過 程中自發(fā)熒光量進行正向調(diào)控。
[0009] 進一步地，所述自發(fā)熒光量為葉綠素自發(fā)熒光量或葉綠體自發(fā)熒光量。
[0010]本發(fā)明還提供，miR408作為作用靶點用于調(diào)控植物光合作用過程中自發(fā)熒光的最 大熒光值。
[0011] 本發(fā)明還提供，miR408作為作用靶點用于調(diào)控植物光合作用過程中自發(fā)熒光在目 標(biāo)區(qū)域的平均輻射率。
[0012] 本發(fā)明的第二方面，提供miR408作為作用靶點用于篩選調(diào)控植物光合作用過程中 自發(fā)熒光量的物質(zhì)的用途。
[0013] 所述調(diào)控包括正向調(diào)控和負向調(diào)控。
[0014] 進一步地，miR408作為作用靶點用于篩選調(diào)控植物光合作用過程中自發(fā)熒光量的 物質(zhì)包括兩方面的內(nèi)容:其一，將miR408作為物質(zhì)針對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量的 作用靶標(biāo)應(yīng)用于植物光合作用過程中自發(fā)熒光量抑制劑的篩選;將miR408作為物質(zhì)針對植 物光合作用過程中自發(fā)熒光量的作用靶標(biāo)應(yīng)用于植物光合作用過程中自發(fā)熒光量促進劑 的篩選。
[0015] 所述將miR408作為物質(zhì)針對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量的作用靶標(biāo)應(yīng)用于 植物光合作用過程中自發(fā)熒光量抑制劑的篩選具體是指，將miR408作為作用對象，對物質(zhì) 進行篩選，以找到可以降低miR408表達從而發(fā)揮對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量的負向 調(diào)控的物質(zhì)作為植物光合作用過程中自發(fā)熒光量抑制劑。
[0016] 所述將miR408作為物質(zhì)針對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量的作用靶標(biāo)應(yīng)用于 植物光合作用過程中自發(fā)熒光量促進劑的篩選具體是指，將miR408作為作用對象，對物質(zhì) 進行篩選，以找到可以提高miR408表達從而發(fā)揮對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量的正向 調(diào)控的物質(zhì)作為植物光合作用過程中自發(fā)熒光量促進劑。
[0017]進一步地，所述自發(fā)熒光量為葉綠素自發(fā)熒光量或葉綠體自發(fā)熒光量。
[0018]本發(fā)明還提供，miR408作為作用靶點用于篩選調(diào)控植物光合作用過程中自發(fā)熒光 的最大熒光值的物質(zhì)。
[0019] 本發(fā)明還提供，miR408作為作用靶點用于篩選調(diào)控植物光合作用過程中自發(fā)熒光 在目標(biāo)區(qū)域的平均輻射率的物質(zhì)。
[0020] 本發(fā)明的第三方面，提供miR408在制備植物光合作用過程中自發(fā)熒光量促進劑中 的用途。
[0021] 所述促進劑還能提高植物光合作用過程中自發(fā)熒光的最大熒光值。
[0022] 所述促進劑還能提高植物光合作用過程中自發(fā)熒光在目標(biāo)區(qū)域的平均輻射率。
[0023] 本發(fā)明的第四方面，提供一種用于調(diào)控植物光合作用過程中自發(fā)熒光量的方法， 該方法包括:調(diào)控植物中miR408的表達或活性。
[0024] 所述調(diào)控包括正向調(diào)控和負向調(diào)控。
[0025]所述方法包括兩方面的內(nèi)容:其一，提高miR408的表達或活性，從而對植物光合作 用過程中自發(fā)熒光量進行正向調(diào)控;其二，降低miR408表達或活性，從而對植物光合作用過 程中自發(fā)熒光量進行負向調(diào)控。
[0026]在本發(fā)明一優(yōu)選例中，提高miR408的表達或活性，從而對植物光合作用過程中自 發(fā)熒光量進行正向調(diào)控，包括:將miR408基因轉(zhuǎn)入到植物基因組中，提高植物中miR408的表 達或活性。
[0027]進一步地，提高miR408的表達或活性，從而對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量進 行正向調(diào)控，包括：
[0028] (1)提供攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，所述的表達載體含有miR408的DNA序列；
[0029] (2)將植物細胞或組織或器官與步驟（1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使該miR408的DNA 序列轉(zhuǎn)入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上。
[0030] 進一步地，提高miR408的表達或活性，從而對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量進 行正向調(diào)控，還包括：
[0031] (3)選擇出轉(zhuǎn)入所述miR408的DNA序列的植物細胞、組織或器官；
[0032] (4)將步驟(3)中的植物細胞、組織或器官再生成植株。
[0033]提高miR408的表達或活性，從而對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量進行正向調(diào) 控，還能提高植物光合作用過程中自發(fā)熒光的最大熒光值。
[0034]提高miR408的表達或活性，從而對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量進行正向調(diào) 控，還能提高植物光合作用過程中自發(fā)熒光在目標(biāo)區(qū)域的平均輻射率。
[0035]本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，降低miR408表達或活性，從而對植物光合作用過程中自 發(fā)熒光量進行負向調(diào)控，包括:將植物基因組中的miR408基因進行突變，降低植物中miR408 表達或活性。
[0036]降低miR408表達或活性，從而對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量進行負向調(diào)控， 還能降低植物光合作用過程中自發(fā)熒光的最大熒光值。
[0037]降低miR408表達或活性，從而對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量進行負向調(diào)控， 還能降低植物光合作用過程中自發(fā)熒光在目標(biāo)區(qū)域的平均輻射率。
[0038]本發(fā)明的第五方面，提供一種由前述方法制備獲得的轉(zhuǎn)基因植物。
[0039] 一方面，提高miR408的表達或活性，從而對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量進行 正向調(diào)控所獲得的轉(zhuǎn)基因植物能夠提高植物光合作用過程中自發(fā)熒光產(chǎn)量、自發(fā)熒光的最 大熒光值或自發(fā)熒光在目標(biāo)區(qū)域的平均輻射率。所述轉(zhuǎn)基因植物能夠提高植物耐低銅生長 環(huán)境及銅高效循環(huán)利用能力。
[0040]另一方面，降低miR408表達或活性，從而對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量進行 負向調(diào)控所獲得的轉(zhuǎn)基因植物能夠降低植物光合作用過程中自發(fā)熒光產(chǎn)量、自發(fā)熒光的最 大熒光值或自發(fā)熒光在目標(biāo)區(qū)域的平均輻射率。所述轉(zhuǎn)基因植物能夠降低植物耐低銅生長 環(huán)境及銅高效循環(huán)利用能力。
[0041 ]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0042]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，miR408可作為作用靶點用于調(diào)控植物光合作用過程中自發(fā)熒光 量、自發(fā)熒光的最大熒光值以及自發(fā)熒光在目標(biāo)區(qū)域的平均輻射率。本發(fā)明為運用轉(zhuǎn)基因 等分子育種技術(shù)培育能夠改變植株光合作用最大熒光值能力以及耐低銅生長環(huán)境及銅高 效循環(huán)利用的農(nóng)作物新品種，提供非常有價值的基因資源。
【附圖說明】
[0043]圖l:miR408突變體插入突變位置及轉(zhuǎn)基因過表達載體構(gòu)建示意圖。
[0044] 圖2:miR408過表達轉(zhuǎn)基因植株、突變體植株中miR408表達分析。
[0045]圖3:擬南芥生長發(fā)育各個時期miR408表達量分析。
[0046]圖4:擬南芥miR408過表達植株及突變體植株表型。
[0047]圖5 :miR408過表達植株及突變體葉片長度、寬度與野生型植株對比。
[0048]圖6:兩種栽培模式下(MS培養(yǎng)基及土栽)轉(zhuǎn)基因植株熒光分析。
[0049]圖7: miR408表達對植株光合作用中光適應(yīng)后最大熒光值(Fm)比較分析。
[0050]圖8:miR408過表達植株及突變體植株在不同銅濃度下的自發(fā)熒光表型分析。
[0051 ]圖9:miR408過表達植株及突變體植株目標(biāo)區(qū)域(R0I)平均輻射率。
【具體實施方式】
[0052]本申請的發(fā)明人經(jīng)過長期的研究，首次從研究中發(fā)現(xiàn)了擬南芥中miR408與植物最 大熒光直接的關(guān)系，提高miR408表達能夠提高植株最大熒光值，這可能是miR408過表達植 株生長量增大的原因之一。從擬南芥中克隆miR408后對其功能進行了具體分析，發(fā)現(xiàn)過表 達miR408能夠增大植株生長量，轉(zhuǎn)基因植株熒光輻射率明顯高于野生型植株，單位面積熒 光發(fā)光強度明顯大于野生型植株，且miR408突變體植株表型相反。研究結(jié)果表明，miR408過 表達植株生長量增大可能與植株光合過程中Fm的增大有關(guān)，miR408通過控制植株光合作用 最大熒光值調(diào)控植株生長。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0053] 本發(fā)明利用模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)展開研究。擬南芥又名鼠耳 芥，阿拉伯芥，阿拉伯草，十字花科植株，被子植物門，雙子葉植物綱?；蚪M大約為12500萬 堿基對和5對染色體。
[0054] 鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，本專利所述植物是其中包含小分 子miR408的表達或者其表達活性受到抑制或增強的植物。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)明白，除了 模式植物擬南芥外本文所述的植物還有包括雙子葉植物、單子葉植物等。主要包括:番茄、 煙草、辣椒、馬鈴薯、葡萄、葡萄柚、蘋果、梨、李、桃、杏、櫻桃、草莓、木莓、黑莓、甘蔗、水稻、 小麥、大麥、黑麥、玉米、高梁、甜菜、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罌粟、齊墩果、向日葵、椰 子、蓖麻油植物、可可豆、花生、萌蘆、黃瓜、西瓜、棉花、亞麻、大麻、黃麻、柑桔、檸檬、菠菜、 苘苣、蘆輿、洋白菜、大白菜、小白菜、胡蘿卜、洋蔥、咖啡、前子、茶、蛇麻草、香蕉、橡膠和觀賞 植物等。
[0055] 作為一種優(yōu)選方式，所述的"植物"包括但不限于：十字花科、禾本科、薔薇科。比 如，所述的"植物"包括但不限于:十字花科蕓薹屬的大白菜、小白菜，十字花科鼠耳芥屬植 物，禾本科的水稻，此外還包括煙草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的"植物"是十字花 科蕓薹屬(擬南芥)的植物。
[0056] 如本文中所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然物質(zhì)，原 始環(huán)境即天然環(huán)境）。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的， 但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。 [0057]如本文所用，"分離的植物小分子RNA"、"分離的提高植物光合能力的miRNA"、或 "分離的miR408"是指擬南芥小分子RNA中ath-miR408,擬南芥中小分子RNA中408家族不含 有同源小分子RNA，即miR408家族在擬南芥中只有一個成員。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的 小分子RNA擴增手段在擬南芥中或者其他植物中克隆到miR408基因。成熟miR408在15%聚 丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
[0058] 如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......構(gòu) 成"、"基本上由......構(gòu)成"、和"由......構(gòu)成"；"主要由......構(gòu)成"、"基本上由...... 構(gòu)成"和"由......構(gòu)成"屬于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。
[0059] 如本文所用，所述的"高(強)光環(huán)境"或"光氧化脅迫環(huán)境"是指一種環(huán)境，其中光 的強度大于常規(guī)環(huán)境。例如光強度高于lOOOwnol nfW更佳地高于3000μηιο1 nf2s'
[0060] 如本文所用，所述的"低銅環(huán)境"、"銅饑餓"是指一種環(huán)境，其中銅的含量低于5μΜ 或銅含量為〇;所述的"高銅環(huán)境"是指一種環(huán)境，其中銅的含量高于?ΟμΜ。
[0061 ]如本文所用，所述"啟動子"或"啟動子區(qū)域"是指一段核酸序列，其位置通常存在 于目的基因編碼序列的上游(5'端），能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般情況下，啟動子或 啟動子區(qū)提供RNA聚合酶結(jié)合位點和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它轉(zhuǎn)錄因子的識別位點。本 文中，所述的啟動子或啟動子區(qū)包括組成型啟動子，該啟動子為35S啟動子，其在正常狀態(tài) 下表達，不存在時空特性，也不存在組織特性等;還包括衰老和維管組織特異性表達啟動子 (BFN啟動子），其在植物衰老過程中啟動其鏈接基因的表達，以及特異性的在植物維管組織 中表達(如:葉脈等），在其他組織或者生長發(fā)育時期沒有表達。
[0062]如本文所用，所述的"連接"、"插入"是指兩個或多個核酸區(qū)域的空間排列。例如： 啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置(上游），使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該 啟動子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動子區(qū)域被"連接、插入"到該核酸序列上。
[0063]本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含miR408DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄、前體 頸環(huán)結(jié)果形成控制的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)等。所述的 DNA序列可有效連接到表達載體中的適當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)miRNA前體合成。表達載體還包 括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0064] 本發(fā)明的擬南芥光合相關(guān)小分子RNA的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR 擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷 酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的頸環(huán)引物法特異 性反轉(zhuǎn)錄獲得miR408特異性片段，PCR擴增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較短時，常常多次PCR擴增 確定序列核苷酸組成。
[0065] -旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。 [0066]如本文所用，突變體植株是指通過T-DNA插入技術(shù)獲得的插入突變植株，T-DNA插 入的核算序列喪失本來的基因功能。miR408突變體插入突變位置及轉(zhuǎn)基因過表達載體構(gòu)建 示意圖如圖1所示。突變體經(jīng)過純合化后獲得該基因的不表達突變體株系。擬南芥突變體植 株購買自%i^#ABR(^(http://www.arabidopsis.org)，后經(jīng)實驗室PCR驗證法獲得純合 的T3代株系。
[0067] 本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人 工合成的DNAANA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。非編碼RNA可以 是長鏈非編碼RNA和小RNA。如本文所用，"miR408"、"miR408前體"分別是指21bp的miR408成 熟小分子RNA序列和形成21bp的miR408成熟小分子RNA的必須具備的全部最短轉(zhuǎn)錄本序列， 即能夠形成miRNA頸環(huán)結(jié)構(gòu)的mRNA序列。
[0068]用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所 用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl 2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方 法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如 顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0069]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，獲得miR408高表達的植株的方法如下：
[0070] (1)提供攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，所述的表達載體含有miR408的DNA序列；
[0071] (2)將植物細胞或組織或器官與步驟（1)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使該miR408的DNA 序列轉(zhuǎn)入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；
[0072] (3)選擇出轉(zhuǎn)入所述miR408的DNA序列的植株；
[0073] (4)將步驟(3)中的植株自交獲得T2代自交系純合體株系。
[0074] 其中，可采用任何適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實施此方法。
[0075] 本發(fā)明的啟動子有兩種，一種是組成型表達的，一種是誘導(dǎo)目的基因在特點組織 中或特點生長階段(微管組織、衰老期)下表達的。
[0076] 本發(fā)明的啟動子可以被可操作地連接到目的基因上，該目的基因相對于啟動子可 以是外源(異源）的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列（優(yōu)選結(jié)構(gòu)性核酸序列），所 述的目的基因優(yōu)選非編碼RNA。所述的目的基因可以被改進來產(chǎn)生各種期望的特性。例如， 目的基因可以被改進來增加表達量，改變對應(yīng)靶基因的表達量等。
[0077] 此外，啟動子和目的基因可以設(shè)計成下調(diào)特定基因。這一般是通過將啟動子連接 到目的miRNA序列的STTM來實現(xiàn)，該序列以靶基因模仿的方式引起目標(biāo)基因沉默。本領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員熟悉這種STTM技術(shù)。任何miRNA序列可以以這種方式被調(diào)節(jié)。
[0078] 任何一種前述的啟動子和目的基因序列可被包含在構(gòu)建物中，更具體地如重組載 體中。
[0079] 包含上述適當(dāng)?shù)膯幼雍湍康幕虻妮d體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎允?其能夠在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境下表達miRNA。
[0080]在本發(fā)明的一個實施方式中，找到了一種來源于擬南芥的miRNA，稱為81:11-表達強烈地被低銅生長環(huán)境所誘導(dǎo)，在低銅生長環(huán)境下ath-miR408具 有促進植物體內(nèi)銅循環(huán)再利用的功能。
[0081 ] ath-miR408是一個低銅生長環(huán)境響應(yīng)的、參與銅代謝關(guān)鍵小分子RNAdth-milMOS 可改變植株大小，通過控制植物最大熒光值(Fm值)影響植物光系統(tǒng)II的光合效率。
[0082] ath-miR408受低銅營養(yǎng)生長環(huán)境誘導(dǎo)。在低銅和正常MS培養(yǎng)基上分別種植miR408 過表達及野生型株系，分析表明在低銅MS培養(yǎng)基中過表達miR408植株生長有差異，但最大 熒光值基本相同；而在缺銅MS培養(yǎng)基中過表達miR408株系明顯生長旺盛，最大熒光值明顯 高于野生型植株。利用Handy Pea便攜式焚光儀測定植株光合效率也證實，miR408過表達株 系最大熒光值明顯大于野生型植株。
[0083] 本發(fā)明人篩選得到ath-miR408兩個個Null突變體命名為408-m4(SALK_038860)， 408-m5(SALK_121013)。利用這兩個材料本發(fā)明人分析408-m4,408-m5與低銅營養(yǎng)環(huán)境相關(guān) 的表型。在正常的培養(yǎng)條件下408-m4，408-m5突變體與野生型相比植株生長量小。在缺銅MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)408-m4,408-m5突變體株系，分析表明突變體最大熒光值明顯低于野生型植 株。利用Handy Pea便攜式熒光儀測定植株光合效率也證實，miR408突變體株系最大熒光值 明顯小于野生型植株。這表明銅饑餓環(huán)境對miR408突變體株系的影響比野生型更大，同時 也顯示ath-miR408對植物適應(yīng)銅脅迫環(huán)境逆境具有重要的功能。
[0084]本發(fā)明的主要優(yōu)點包括：
[0085] (1)本發(fā)明為運用轉(zhuǎn)基因等分子育種技術(shù)培育能夠改變植株光合作用最大熒光值 能力的農(nóng)作物新品種，提供非常有價值的基因資源。
[0086] (2)本發(fā)明為運用轉(zhuǎn)基因等分子育種技術(shù)培育耐低銅生長環(huán)境及銅高效循環(huán)利用 的農(nóng)作物新品種，提供非常有價值的基因資源。
[0087] 在進一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案;還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法， 通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。
[0088] 當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端 點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實 現(xiàn)本發(fā)明。
[0089] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng) 域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及 相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998;METH0DS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin(P.M.ffassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0090] I.材料與方法
[0091] 通用材料
[0092] 實驗材料為模式植物Col生態(tài)型擬南芥(Arabidopsis thaliana)野生型植株和突 變體植株(購買自ABRC庫，PCR法獲得純合株系）。反轉(zhuǎn)錄試劑盒RNA PCR Kit(MMV)購自大連 丁&1^1^公司，聚合酶義(1對1^§嫂)2?0?1(^購自(：1〇1^6(*公司41了39!^購自大連了31^1^1 公司。UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。10 EcoR I 酶購自大連TaKaRa公司。dNTP Mixture，X-gal，IPTG，DNA Marker DL2000購自大連TaKaRa 公司；其他試劑除特別說明外，均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。
[0093] 通用方法
[0094] 1.擬南芥miR408前體的PCR擴增
[0095] 根據(jù)擬南芥基因組網(wǎng)站提供的基因組數(shù)據(jù)（http : //www. arabidopsis · org/ index. jsp)，利用Primer5軟件設(shè)計miR408前體的全長PCR擴增引物，以反轉(zhuǎn)錄的第一條鏈 cDNA為模板進行PCR擴增。獲得miR408前體，然后，利用所獲得的miR408前體合成成熟 miR408〇
[0096]所用引物如下：
[0099] 所獲得的能夠合成成熟miR408的miR408前體序列如SEQIDN0.3所示，具體如下：
[0101]成熟miR408核苷酸序列信息如下：
[0102] ath-miR408-5p:ACAGGGAACAAGCAGAGCATG(miRNA*)(SEQ ID N0.4)
[0103] ath-miR408-3p：ATGCACTGCCTCTTCCCTGGC(miRNA)(SEQ ID NO.5)
[0104] 2.植物表達載體的構(gòu)建
[0105] 用Xhol和Xbal雙酶切測序正確的陽性克隆質(zhì)粒和表達載體pFGC-5941，經(jīng)過1%瓊 脂糖凝膠電泳，回收純化miR408前體序列和pFGC-5941空載體片段。用T4DNA連接酶連接兩 個片段構(gòu)建pFGC-5941-35s-miR408重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于含IPTG、卡 那霉素和X-gal的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)、篩選，挑取白色菌落進行搖菌。對獲得的重組質(zhì)粒 雙酶切鑒定實驗，然后將pFGC-5941-35s-miR408重組質(zhì)粒經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細 胞。
[0106] 同樣方法將miR408前體序列構(gòu)建到包含BFN啟動子的pFGC-5941載體中，獲得 pFGC-5941-BFN-miR408〇
[0107] 加入酶切位點的PCR擴增引物如下：
[0110] 3.浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥及篩選
[0111] 挑取轉(zhuǎn)入 pFGC-5941-35s-miR408、pFGC-5941-BFN-miR408 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落， 轉(zhuǎn)接于30mL YEB (50mg/L10利福平，50mg/L卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，28 °C，200r/min培養(yǎng)至 OD6〇〇 0.5~0·8〇
[0112] 轉(zhuǎn)基因步驟：
[0113] a)當(dāng)擬南芥抽苔后莖高約5厘米時進行轉(zhuǎn)化，若待轉(zhuǎn)化的植株結(jié)實率低則要在植 株打頂4天后進行。
[0114] b)轉(zhuǎn)化前，將已授粉的花和角果去除掉。并使土壤吸水過夜。
[0115] c)將已培養(yǎng)過夜的農(nóng)桿菌1:100稀釋于大瓶培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)24小時后，4°C 5000rpm離心20分鐘，棄上清，將農(nóng)桿菌沉淀懸浮于原菌液的兩倍體積的轉(zhuǎn)化緩沖液中，使 OD6〇q在0.8左右。
[0116] d)擬南芥的除蓮座葉外的地上部分完全浸入菌液中l(wèi)min，取出平放，覆蓋保鮮膜 和報紙，黑暗下過夜，次日移入人工氣候室正常豎直培養(yǎng)。
[0117] e)種子經(jīng)4°C春化兩天后播種到組培室，除草劑篩選抗性苗移。
[0118] f)抗性苗取葉片提取基因組DNA經(jīng)PCR檢測得到陽性苗，再經(jīng)兩代篩選得到轉(zhuǎn)基因 的T2代純系，用于進一步分析。
[0119] 實施例l:Real-time PCR鑒定miR408時空表達及轉(zhuǎn)基因植株表達量分析
[0120] 植物體基因表達具有時空特異性，即在不同的時間、空間條件下，有不同的功能基 因表達。首先對擬南芥發(fā)育不同時期中miR408的表達量進行了分析，發(fā)現(xiàn)miR408在植物生 長過程中都有表達，衰老前期、后期呈現(xiàn)表達量不斷上升的趨勢，見圖3。
[0121] 擬南芥轉(zhuǎn)基因獲得多個T2代株系，從ABRC購買的多個突變體株系，經(jīng)PCR法純合化 后獲得2個突變體株系。引物如下：
[0122] 在基因 T-DNA插入?yún)^(qū)域前后設(shè)計一對引物：
[0127] 通過PCR產(chǎn)物大小及測序來鑒定T-DNA的插入。
[0128] Real-time PCR對過表達植株和突變體植株中miR408的表達量進行分析，結(jié)果顯 示過表達株系miR408表達量分別增長約50倍、85倍，而突變體中miR408表達量急劇下降，幾 乎沒有表達，見圖2。方法及引物：
[0129] 提取植物小分子RNA，定量并分析純度；取相同的植物小分子RNA，反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA，用作模板用于PCR;以UBC基因為作為內(nèi)參基因，進行目標(biāo)基因的PCR反應(yīng);PCR產(chǎn)物進 行電泳初分析。
[0130] miR408反轉(zhuǎn)錄引物：
[0137] 實施例2:過表達miR408植株及突變體植株的光合特性
[0138] miR408過表達植株的表型與野生型相比有明顯差別，過表達植株生長旺盛，植株 體積明顯大于野生型植株。過表達植株葉片長度、寬度都明顯大于野生型植株。miR408突變 體植株則明顯表現(xiàn)出相反的表型特性，葉片長度、寬度都明顯小于野生型植株，見圖4,5。
[0139] 在營養(yǎng)土中栽培miR408過表達及突變體植株，15天幼苗在IVSII系統(tǒng)（The IVIS Lumina II imaging system，PerkinElmer Inc.，USA)中觀察植株自發(fā)焚光(激發(fā)光430nm， 接受波長560-580nm)。結(jié)果顯示，miR408過表達株系葉綠素自發(fā)熒光量明顯高于野生型植 株（圖6,左），而突變體植株則顯示出完全相反的結(jié)果，葉綠素自發(fā)熒光量明顯小于野生型 植株也小于過表達植株(圖6,左）。
[0140] 在MS培養(yǎng)基中栽培miR408過表達及突變體植株，選擇在包含3 %蔗糖的MS培養(yǎng)基 的同一個培養(yǎng)皿中同時種植35s啟動子過表達miR408、BFN啟動子過表達miR408、野生型植 株、miR408突變體植株(每個株系40株）。結(jié)果顯示，與營養(yǎng)土中的結(jié)果類似，過表達植株的 葉綠體自發(fā)熒光量明顯高于野生型和突變體植株(圖6，右）。
[0141]此結(jié)果表明，無論在土壤栽培(光合作用提供糖源)還是MS培養(yǎng)基栽培(添加3%蔗 糖），miR408都能夠調(diào)控植株的光合自發(fā)熒光量，調(diào)控植株大小。
[0142] 實施例3:低銅營養(yǎng)環(huán)境下過表達、突變體植株葉綠素自發(fā)熒光量對比
[0143] 含銅MS培養(yǎng)基配方
[0144] 鹽分及用量與文獻Murashige，T.and Skoog，F(xiàn). (1962)A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture.Physiol Plant.15,473-497中描述的配方相同，另外加入7g/L瓊脂、3%蔗糖。
[0145] 無銅MS培養(yǎng)基
[0146] 無 CuS〇4成分，其它與含磷MS培養(yǎng)基相同。
[0147] 結(jié)果
[0148] 為了解miR408在低銅生長環(huán)境中的生理功能，本發(fā)明人分析miR408過表達株系和 突變體株系在幼苗期的表型，在正常的培養(yǎng)條件下（Cu，0.5yg)miR408過表達株系、突變體 株系與野生型相比，葉綠素自發(fā)熒光量略有提高（圖8)。
[0149] 然而在缺銅的生長環(huán)境下(Cu，0yg)，miR408過表達株系和野生型或者突變體株系 相比，葉綠素自發(fā)熒光量明顯提高（圖8)。
[0150] 這表明低銅生長環(huán)境逆境對miR408的影響比野生型更大，同時也提示miR408基因 對植物適應(yīng)低銅環(huán)境逆境具有重要的功能。這與前人報道的miR408在低銅條件下誘導(dǎo)表達 結(jié)果相一致。
[0151] 實施例4:miR408表達對植株光合作用中光適應(yīng)后的最大熒光值(Fm)的影響
[0152] 為確定miR408表達可以影響植株自發(fā)熒光量，
【申請人】通過Handy Pea便攜式熒光 測定儀測定過表達株系、突變體株系和野生型的暗適應(yīng)后的最大熒光值。
[0153] 基本操作步驟：
[0154] 選擇生長一致的15天土栽擬南芥幼苗（約6片葉）每個株系各10株，逐個測定葉片 最大焚光值。首先，選擇擬南芥植株第6片葉作為測定對象，暗適應(yīng)20分鐘，打開Handy Pea 便攜式熒光測定儀光源，給予3000ym〇l nf的高光照強度，設(shè)定儀器為沒0.1秒收集葉片 熒光，收集時間為30秒。結(jié)果顯示過表達植株在30秒的測定時間內(nèi)葉片最大熒光始終大于 野生型植株，突變體植株熒光值最小（圖7)。
[0155] 為進一步證明miR408與植株最大自發(fā)熒光相關(guān)，結(jié)合上一個實驗實例中的結(jié)果-miR408在銅饑餓條件下誘導(dǎo)表達。這里
【申請人】在缺銅條件下種植miR408突變體植株和野生 型植株，結(jié)果顯示野生型植株葉綠素自發(fā)熒光在30秒內(nèi)始終高于miR408突變體植株，即說 明在銅缺乏情況下誘導(dǎo)了 miR408的表達，miR408的表達引起植株自發(fā)熒光量的增大（圖7)。
[0156] 實施例5:miR408過表達植株及突變體植株平均輻射率
[0157] 為了鑒定光合相關(guān)小分子RNA(miR408)功能，本發(fā)明人構(gòu)建了 35S啟動及BFN啟動 的過表達植物載體35S-miR408和BFN-miR408,并轉(zhuǎn)化到擬南芥。檢測擬南芥T2代植株的基 因表達以及葉綠體自發(fā)熒光增強。本實驗案例希望測定轉(zhuǎn)基因株系、突變體株系及野生型 植株的葉綠體自發(fā)熒光量。通過在3%蔗糖的MS培養(yǎng)基中種植35s、BFN啟動子過表達、突變 體和野生型株系，15天正常生長的植株進行葉綠體自發(fā)熒光發(fā)光量測定。利用IVSII熒光成 像系統(tǒng)檢測各個株系的焚光量，目標(biāo)區(qū)域(region of interest，R0I)的平均福射率35s-miR408過表達植株為4.gGie+iMp/sec/cmVsr/yW/cmYFluorescence emission radiance per incident excitation intensity,單位ROI中焚光福射率），BFN_miR408過表達植株為 5 · 429e+04p/sec/cm2/sr/yW/cm2，野生型為4 · 495e+04p/sec/cm2/sr/yW/cm2，突變體最低為 3 · 909e+04p/sec/cm2/sr/yW/cm2 (圖9) 〇
[0158] 綜上，擬南芥miR408是一個銅脅迫響應(yīng)的植物內(nèi)源小分子RNA，它能夠有效的提高 植物葉綠體自發(fā)熒光量，可用于改進苗期植物的生長能力，可能通過改變植物光合作用機 制提尚植株廣量。
[0159] 以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明任何形式上和實質(zhì)上的限制， 應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出 若干改進和補充，這些改進和補充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員， 在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更 動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)對 上述實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍 內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種miR408作為作用靶點用于調(diào)控植物光合作用過程中自發(fā)熒光量的用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述調(diào)控包括正向調(diào)控和負向調(diào)控。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，miR408作為作用靶點用于調(diào)控植物光合作 用過程中自發(fā)熒光量包括兩方面的內(nèi)容:其一，將miR408作為作用對象，降低miR408表達從 而對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量進行負向調(diào)控;將miR408作為作用對象，提高miR408 表達從而對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量進行正向調(diào)控。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述自發(fā)熒光量為葉綠素自發(fā)熒光量或葉 綠體自發(fā)熒光量。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，miR408還可作為作用靶點用于調(diào)控植物光 合作用過程中自發(fā)熒光的最大熒光值或自發(fā)熒光在目標(biāo)區(qū)域的平均輻射率。 6. miR408作為作用靶點用于篩選調(diào)控植物光合作用過程中自發(fā)熒光量的物質(zhì)的用途。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，miR408還可作為作用靶點用于篩選調(diào)控植 物光合作用過程中自發(fā)熒光的最大熒光值的物質(zhì)或用于篩選調(diào)控植物光合作用過程中自 發(fā)熒光在目標(biāo)區(qū)域的平均輻射率的物質(zhì)。 8. miR408在制備植物光合作用過程中自發(fā)熒光量促進劑中的用途。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述促進劑還能提高植物光合作用過程中 自發(fā)熒光的最大熒光值或提高植物光合作用過程中自發(fā)熒光在目標(biāo)區(qū)域的平均輻射率。10. -種用于調(diào)控植物光合作用過程中自發(fā)熒光量的方法，該方法包括兩方面的內(nèi)容： 其一，提高miR408的表達或活性，從而對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量進行正向調(diào)控;其 二，降低miR408表達或活性，從而對植物光合作用過程中自發(fā)熒光量進行負向調(diào)控。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，提高miR408的表達或活性，從而對植物 光合作用過程中自發(fā)熒光量進行正向調(diào)控，包括:將miR408基因轉(zhuǎn)入到植物基因組中，提高 植物中miR408的表達或活性。12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，降低miR408表達或活性，從而對植物光 合作用過程中自發(fā)熒光量進行負向調(diào)控，包括:將植物基因組中的miR408基因進行突變，降 低植物中miR408表達或活性。13. -種由如權(quán)利要求10~12任一權(quán)利要求所述方法制備獲得的轉(zhuǎn)基因植物。
【文檔編號】A01H5/00GK105969797SQ201610570372
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月19日
【發(fā)明人】馬超, 吳玉森, 高振, 駱萌, 王世平, 張才喜, 許文平, 宋士任
【申請人】上海交通大學(xué)