一種狹鱈魚皮素及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開一種狹鱈魚素及其應(yīng)用，屬于生化技術(shù)領(lǐng)域，它是以狹鱈魚皮為原料、由以下步驟制備而成：將鱈魚皮洗凈、切碎，加水進(jìn)行濕法打漿；加水，混勻后升溫至50～60℃，調(diào)節(jié)pH至7.0，加復(fù)合蛋白酶，酶解2～3小時(shí)；升溫至60～90℃保持10分鐘，使酶滅活；采用離心機(jī)對(duì)鱈魚皮酶解液離心20～30分鐘，收集酶解上清液；將酶解上清液進(jìn)行冷凍干燥成粉末，得狹鱈魚素。本發(fā)明的鱈魚皮素能預(yù)防由UVB輻射誘導(dǎo)所致的皮膚鱗狀細(xì)胞癌，給藥方法為皮膚外用，涂抹，不僅對(duì)零海拔有效，對(duì)高原人群也有效。
【專利說明】
一種狹鱈魚皮素及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生化技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種狹鱈魚皮素及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 皮膚鱗狀細(xì)胞癌簡(jiǎn)稱鱗癌，又名表皮癌，是發(fā)生于表皮或附屬器細(xì)胞的一種惡性 腫瘤，癌細(xì)胞有不同程度的角化。多見于有鱗狀上皮覆蓋的部位，如皮膚、口腔、唇、食管、子 宮頸、陰道等處。此外，有些部位如支氣管、膀胱、腎盂等處雖無鱗狀上皮覆蓋，但可通過鱗 狀上皮化生而形成鱗狀細(xì)胞癌。
[0003] 隨著工業(yè)化的發(fā)展，目前環(huán)境污染嚴(yán)重，霧霾天氣越來越多，人們皮膚非常容易被 空氣中的有害物質(zhì)污染，在這種空氣中皮膚非常容易發(fā)生癌變，目前，市場(chǎng)上有不少品種的 藥治療皮膚病，價(jià)格昂貴，西藥為主，負(fù)作用大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種狹鱈魚皮素及其應(yīng)用，解決現(xiàn)有的預(yù)防皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥物負(fù) 作用大的問題。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] 本發(fā)明提供一種狹鱈魚素，它是以狹鱈魚皮為原料、由以下步驟制備而成：
[0007] 1)原料預(yù)處理:將鱈魚皮洗凈、切碎，加水進(jìn)行濕法打漿；
[0008] 2)酶解:加入鱈魚皮重量20~40%的水，混勻后升溫至50~60°C，調(diào)節(jié)pH至7.0，加 入鱈魚皮重量〇. 1~〇. 2%的復(fù)合蛋白酶，50~60°C的條件下酶解2~3小時(shí);其中，加入的復(fù) 合蛋白酶是天然的蛋白酶；
[0009] 3)滅活:升溫至60~90°C保持10分鐘，使酶滅活；
[0010] 4)固液分離:采用離心機(jī)對(duì)鱈魚皮酶解液離心20~30分鐘，收集酶解上清液；
[0011] 5)干燥:將酶解上清液進(jìn)行冷凍干燥成粉末，得狹鱈魚素。
[0012] 其中，優(yōu)選地，組分中分子量小于3000Da的占組分總數(shù)的75%以上。
[0013] 本發(fā)明并提供了狹鱈魚皮素在制備預(yù)防皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥物中應(yīng)用。
[0014] 其中，優(yōu)選地，所述藥物配制成外用給藥制劑。
[0015] 其中，優(yōu)選地，所述外用給藥制劑中狹鱈魚皮素的含量為5~25%。
[0016] 為了更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面提供本發(fā)明狹鱈魚皮素預(yù)防UVB誘導(dǎo)的小鼠 皮膚癌藥效學(xué)試驗(yàn)。
[0017] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0018] 1紫外線UVB輻射昆明種無毛小鼠致皮膚癌模型的制備
[0019] (1)制備鼠固定器
[0020] 長(zhǎng)寬高分別為：25cmxl8cmx3cm
[0021 ] (2)隨機(jī)將昆明種無毛小鼠分為雙蒸水涂抹未照射組，模型組，給藥組(5 % CPWPS 組，20%CPWPS組，陽性對(duì)照組(5 %維生素 C組））5組，模型組13只，其他組各組5只，按設(shè)計(jì)方 案給藥。背部外涂（1ml/只/天），用相同規(guī)格的毛刷蘸取藥物均勻涂布于每只小鼠背部，盡 量保證涂布均勻。涂后避光2h后，將動(dòng)物置于特制的鼠固定器內(nèi)，暴露其背部相應(yīng)部位皮 膚，置UVB特殊光源下，單次輻射劑量1 luw/cm2，單次輻射4h，每天輻照強(qiáng)度為180mJ/cm2，在5 周，10周，15周，20周，25周時(shí)分別取模型組兩只無毛小鼠的皮膚，直至25周后，處死所有的 動(dòng)物，取皮膚組織。
[0022] 2用相機(jī)記錄各個(gè)時(shí)期老鼠皮膚的變化情況
[0023] 3HE 檢測(cè)
[0024] 皮膚石蠟包埋:皮膚組織切下后4%多聚甲醛固定24小時(shí)，自來水沖洗12h，浸75% 乙醇lh，85 %乙醇lh，95 %乙醇lh，新的95 %乙醇再浸lh，100%酒精各浸lh，二甲苯5min，重 復(fù)一次，浸軟蠟1.5h，硬蠟lh。將組織塊放入模具中，倒入硬蠟包埋，硬蠟:軟蠟=3:1，將冷 卻好的臘塊取出裝在切片固定器上，切片機(jī)切成5um的組織塊，把切好的切片在40°C溫水中 展開，貼在載玻片上，晾干，60°C烤片3h后備用。
[0025] 1.HE染色：將烘干的切片浸入二甲苯1中脫蠟lOmin-將切片從二甲苯1移入二甲 苯2中浸泡lOmin-移入95%的酒精浸泡15min-移入95%的酒精2內(nèi)浸泡5min-移入80% 的酒精內(nèi)浸泡2min-蒸餾水洗凈切片上的酒精-移入蘇木精染液中染色5min-自來水洗 3min-0.5 %鹽酸酒精溶液分化數(shù)秒，鏡檢著色程度-自來水充分洗凈近20min-蒸餾水洗 兩次-伊紅染液染色2min-系列乙醇脫水，80%乙醇3〇8-95%乙醇3〇8-無水乙醇1內(nèi)浸 泡2min-無水乙醇2內(nèi)浸泡2min-透明，移入二甲苯1內(nèi)浸泡2min-二甲苯2內(nèi)浸泡2min- 中性樹膠封片，顯微鏡觀察。
[0026] 4免疫組織化學(xué)
[0027] 1.脫蠟，將切片放入二甲苯1內(nèi)浸泡5min-二甲苯2內(nèi)浸泡5min-100 %無水乙醇1 內(nèi)浸泡3min-100%無水乙醇2內(nèi)浸泡3min-95%乙醇1內(nèi)浸泡3min-95%乙醇2內(nèi)浸泡 3min-85 %乙醇內(nèi)浸泡3min-75 %乙醇內(nèi)浸泡3min-蒸餾水內(nèi)浸泡3min。
[0028] 2.滅活內(nèi)源性酶，用蒸餾水新鮮配制3 %H202，將配好的H202滴在玻片的各個(gè)組織 上，室溫放置8min，PBS洗3次，每次3min。
[0029] 3.封閉蛋白間孔隙，滴加5%BSA封閉液，室溫放置20min，甩去組織上的液體，不清 洗。
[0030] 4.孵育一抗，用PBS稀釋一抗，PCNA，EGFR，P-AKT，AQP3，AQP9抗體的稀釋倍數(shù)分別 為：1:200，1:500，1:100，1:300，1:300。每個(gè)組織滴加20ul，4°C過夜，PBS洗3次，每次3min。
[0031] 5.滴加二抗，每個(gè)組織滴加20ul，37°C lh后，PBS洗3次，每次3min。
[0032] 2.滴加 SABC，SABC與二抗結(jié)合，每個(gè)組織滴加20ul，37 °C放置30min，PBS洗4次，每 次5min〇
[0033] 6.DAB顯色，A，B，C液各一滴，加入lml的蒸餾水內(nèi)，混勻后加至切片，鏡下控制反應(yīng) 時(shí)間，5-30min后蒸餾水洗滌。
[0034] 7.蘇木素染色，浸入蘇木素內(nèi)30s拿出脫水透明，75 %乙醇-85 %乙醇-95%乙醇 -95%乙醇-100%乙醇-100%乙醇內(nèi)各浸泡30s-二甲苯內(nèi)浸泡lmin-復(fù)染后自來水洗 4次。
[0035] 8.封片，中性樹膠封片，晾干后顯微鏡觀察。
[0036] 5腫瘤觀察
[0037]隨著持續(xù)的UVB照射，模型組前五周無毛鼠的皮膚干燥，彈性差，出現(xiàn)紅斑，長(zhǎng)鱗 肩，第十周，脫肩，掉毛，12周開始出現(xiàn)帽針尖大小丘疹，疑似腫瘤丘疹，20周丘疹進(jìn)一步增 多，25周進(jìn)而變成菜花樣瘤體。模型組首次出現(xiàn)腫瘤的時(shí)間為UVB照射12周時(shí)，而陽性對(duì)照 組VC組首次出現(xiàn)為第13周，狹鱈魚皮素兩組出現(xiàn)腫瘤的時(shí)間均比陽性對(duì)照組晚，且25周時(shí) 平均每只老鼠身上的腫瘤個(gè)數(shù)較陽性對(duì)照組少。
[0038] 表1UVB照射無毛鼠后首次出現(xiàn)腫瘤的時(shí)間及腫瘤個(gè)數(shù)(25周時(shí)，n = 5)
[0041 ] 5.1UVB長(zhǎng)期輻射后對(duì)無毛鼠皮膚影響的HE染色
[0042] HE的結(jié)果顯示昆明種有毛小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，毛囊及汗腺豐富，昆 明種無毛小鼠皮膚組織表皮層較有毛小鼠薄，毛囊及汗腺較有毛小鼠少，其他均無不同， (由于正常組5，10，15，20，25周皮膚病理表現(xiàn)差距不大，實(shí)驗(yàn)則選擇五周的正常皮膚作為對(duì) 照)UVB照射5周后，模型組無毛小鼠皮膚表皮層較正常組變厚，尤其是棘層;照射10周后，棘 層肥厚，表皮突不規(guī)則輕度向下延伸；照射15周后，角化過度更加明顯，開始出現(xiàn)癌巢，表皮 內(nèi)出現(xiàn)假性角囊腫；照射20周后，角化過度相對(duì)15周進(jìn)一步明顯，癌巢增多，黑色素輕微沉 積，細(xì)胞異型性;照射25周后，黑色素沉積明顯，高度的角化過度，彌漫的異型性細(xì)胞，癌巢 進(jìn)一步增多且明顯，部分伴有鱗癌角珠。而各給藥組較模型組均有不同程度的癥狀減輕。陽 性對(duì)照組與模型組比較癌巢少，而5 %的CPWPS組比模型組表皮增生增厚程度輕，角化程度 輕。20 %的CPWPS組癥狀最輕，無彌漫的異型性細(xì)胞，無鱗癌角珠。
[0043] 5.2UVB輻射無毛鼠后PCNA表達(dá)的變化
[0044] 在本實(shí)驗(yàn)中正常組無毛小鼠 PCNA的著色強(qiáng)度為淺黃色，用Image-Pro Plus
[0045] 6.0軟件分析平均光密度值，25周時(shí)模型組無毛小鼠 PCNA的表達(dá)量明顯升高，著色 強(qiáng)度為深褐色，與正常組相比，在皮膚癌模型中PCNA高表達(dá)(P〈0.05)，以上指標(biāo)證明模型在 25周已形成，所以之后測(cè)的是25周各組蛋白表達(dá)情況。
[0046] 表2UVB輻射后PCNA的表達(dá)量化的平均光密度值
[0048] 5.3鱈魚皮素下調(diào)UVB損傷后皮膚中EGFR蛋白表達(dá)
[0049] 25周時(shí)，正常組EGFR的平均光密度值為0.007，模型組的表達(dá)量為0.070，模型組與 正常組相比，表達(dá)量明顯升高(P〈〇.05);與陽性對(duì)照VC組比較也有降低;與模型組比較，5% 和20 %的CPWPS組EGFR表達(dá)量明顯降低(P〈0.05)，且低于5 % VC組，20 % CPWPS組EGFR的表達(dá) 量較5%的CPWPS也降低。
[0050] 5.4鱈魚皮素下調(diào)UVB損傷后皮膚中P-AkT蛋白的表達(dá)
[0051 ] UVB照射25后，模型組P-AKT的表達(dá)量明顯升高，較正常組(P〈0.05)，同時(shí)期與模型 組比較，5 % CPWPS的P-AKT表達(dá)量降低;提前加入20 % CPWPS預(yù)防的組經(jīng)過25周UVB的照射后 P-AKT的表達(dá)較模型組明顯降低，降低了49.8% (P〈0.05)，且明顯低于VC組P-AKT的表達(dá)。 [0052] 5.5鱈魚皮素抑制UVB損傷后皮膚中AQP3的表達(dá)
[0053] 模型組無毛鼠經(jīng)過25周的照射后AQP3的表達(dá)顯著上升，與正常對(duì)照組比較（P〈 0.05)，VC組較模型組比較，AQP3的表達(dá)量明顯降低(P〈0.05); 5%CPWPS組與模型組比較， AQP3的表達(dá)量降低(P〈0.05);20% CPWPS組與模型組比較，AQP3的表達(dá)量顯著降低，降低了 58.0%(卩〈0.05)，且低于5%〇卩冊(cè)3組。
[0054] 5.6鱈魚皮素對(duì)UVB損傷后皮膚中AQP9表達(dá)的影響
[0055] 在UVB照射前給予各給藥組相應(yīng)劑量的涂抹，兩小時(shí)后進(jìn)行UVB照射，25周后模型 組無毛鼠與非UVB輻射組比較AQP9的蛋白表達(dá)量上升（P〈0.05)，但表達(dá)量低于AQP3，5 % CPWPS組與模型組比較，AQP9的表達(dá)量降低(？〈0.05);20%0?1?3組與模型組比較4〇?9的表 達(dá)量顯著降低，降低了62.6% (P〈0.05)。
[0056] 6 結(jié)論
[0057] 1.模擬日光紫外線B長(zhǎng)期慢性照射(單次輻射劑量10mJ/cm2)，成功建立昆明種無 毛小鼠皮膚癌的模型。
[0058] 2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EGFR、AKT、AQP3、AQP9均參與了皮膚癌的發(fā)生過程，在腫瘤 形成中各蛋白表達(dá)量均升高，且首次發(fā)現(xiàn)AQP9在皮膚癌中高表達(dá)。
[0059] 3.狹鱈魚皮素均對(duì)皮膚癌有預(yù)防作用，且20 %CPWPS的預(yù)防作用最好，其預(yù)防作用 可能與抑制EGFR、AKT、AQP3、AQP9蛋白的表達(dá)有關(guān)。
[0060] 4.本發(fā)明的鱈魚皮素預(yù)防的是UVB輻射誘導(dǎo)所致的皮膚鱗狀細(xì)胞癌，給藥方法為 皮膚外用，涂抹，不僅對(duì)零海拔有效，對(duì)高原人群也有效。
【具體實(shí)施方式】
[0061 ]下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的內(nèi)容僅僅是本發(fā) 明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒 有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0062] 實(shí)施例1
[0063]本發(fā)明提供一種狹鱈魚素，它是以狹鱈魚皮為原料、由以下步驟制備而成：
[0064] 1)原料預(yù)處理:將鱈魚皮洗凈、切碎，加水進(jìn)行濕法打漿；
[0065] 2)酶解:加入鱈魚皮重量30 %的水，混勻后升溫至50~60°C，調(diào)節(jié)pH至7.0，加入鱈 魚皮重量〇. 15 %的復(fù)合蛋白酶，50~60°C的條件下酶解2.5小時(shí)；
[0066] 3)滅活:升溫至75°C保持10分鐘，使酶滅活；
[0067] 4)固液分離:采用離心機(jī)對(duì)鱈魚皮酶解液離心25分鐘，收集酶解上清液；
[0068] 5)干燥:將酶解上清液進(jìn)行冷凍干燥成粉末，得狹鱈魚素。
[0069]得到的狹鱈魚素組分中分子量小于3000Da的占組分總數(shù)的75%以上。其中，〉 5000Da，A6.90%，3000-5000Da，Al8.01%，1000-2999Da，A40.60%，500-999DaA 27.20%，〈500Da占7.31。
[0070] 實(shí)施例2
[0071 ]本發(fā)明提供一種狹鱈魚素，它是以狹鱈魚皮為原料、由以下步驟制備而成：
[0072] 1)原料預(yù)處理:將鱈魚皮洗凈、切碎，加水進(jìn)行濕法打漿；
[0073] 2)酶解:加入鱈魚皮重量20 %的水，混勻后升溫至50~60°C，調(diào)節(jié)pH至7.0，加入鱈 魚皮重量〇. 1 %的復(fù)合蛋白酶，50~60 °C的條件下酶解2小時(shí)；
[0074] 3)滅活:升溫至60°C保持10分鐘，使酶滅活；
[0075] 4)固液分離:采用離心機(jī)對(duì)鱈魚皮酶解液離心20分鐘，收集酶解上清液；
[0076] 5)干燥:將酶解上清液進(jìn)行冷凍干燥成粉末，得狹鱈魚素。
[0077]得到的狹鱈魚素組分中分子量小于3000Da的占組分總數(shù)的75 %以上。其中，〉 5000Da，A6.91%，3000-5000Da，Al8.00%，1000-2999Da，A40.65%，500-999DaA 27.17%，〈500Da占7.29%
[0078] 實(shí)施例3
[0079] 本發(fā)明提供一種狹鱈魚素，它是以狹鱈魚皮為原料、由以下步驟制備而成：
[0080] 1)原料預(yù)處理:將鱈魚皮洗凈、切碎，加水進(jìn)行濕法打漿；
[0081 ] 2)酶解:加入鱈魚皮重量40 %的水，混勻后升溫至50~60°C，調(diào)節(jié)pH至7.0，加入鱈 魚皮重量〇. 2 %的復(fù)合蛋白酶，50~60 °C的條件下酶解3小時(shí)；
[0082] 3)滅活:升溫至90°C保持10分鐘，使酶滅活；
[0083] 4)固液分離:采用離心機(jī)對(duì)鱈魚皮酶解液離心30分鐘，收集酶解上清液；
[0084] 5)干燥:將酶解上清液進(jìn)行冷凍干燥成粉末，得狹鱈魚素。
[0085]得到的狹鱈魚素組分中分子量小于3000Da的占組分總數(shù)的75%以上。其中，〉 5000Da，A6.89%，3000-5000Da，Al8.02%，1000-2999Da，A40.55%，500-999DaA 27.23%，〈500Da占7.33%
[0086] 實(shí)施例4
[0087] 本發(fā)明提供一種狹鱈魚素，它是以狹鱈魚皮為原料、由以下步驟制備而成：
[0088] 1)原料預(yù)處理:將鱈魚皮洗凈、切碎，加水進(jìn)行濕法打漿；
[0089] 2)酶解:加入鱈魚皮重量25 %的水，混勻后升溫至50~60°C，調(diào)節(jié)pH至7.0，加入鱈 魚皮重量0.13%的復(fù)合蛋白酶，50~60°C的條件下酶解2小時(shí)；
[0090] 3)滅活:升溫至70°C保持10分鐘，使酶滅活；
[0091 ] 4)固液分離:采用離心機(jī)對(duì)鱈魚皮酶解液離心22分鐘，收集酶解上清液；
[0092] 5)干燥:將酶解上清液進(jìn)行冷凍干燥成粉末，得狹鱈魚素。
[0093]得到的狹鱈魚素組分中分子量小于3000Da的占組分總數(shù)的75%以上。其中，〉 5000Da，A6.90%，3000-5000Da，Al8.01%，1000-2999Da，A40.64%，500-999DaA 27.18%，〈500Da占7.29%。
[0094] 實(shí)施例5
[0095] 本發(fā)明提供一種狹鱈魚素，它是以狹鱈魚皮為原料、由以下步驟制備而成：
[0096] 1)原料預(yù)處理:將鱈魚皮洗凈、切碎，加水進(jìn)行濕法打漿；
[0097] 2)酶解:加入鱈魚皮重量35 %的水，混勻后升溫至50~60°C，調(diào)節(jié)pH至7.0，加入鱈 魚皮重量〇. 18 %的復(fù)合蛋白酶，50~60°C的條件下酶解3小時(shí)；
[0098] 3)滅活:升溫至80°C保持10分鐘，使酶滅活；
[0099] 4)固液分離:采用離心機(jī)對(duì)鱈魚皮酶解液離心28分鐘，收集酶解上清液；
[0100] 5)干燥:將酶解上清液進(jìn)行冷凍干燥成粉末，得狹鱈魚素。
[0101]得到的狹鱈魚素組分中分子量小于3000Da的占組分總數(shù)的75%以上。其中，〉 5000Da，A6.91%，3000-5000Da，Al8.00%，1000-2999Da，A40.62%，500-999DaA 27.19%，〈500Da占7.30%
[0102]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種狹鱈魚素，其特征在于，它是以狹鱈魚皮為原料、由以下步驟制備而成： 1) 原料預(yù)處理:將鱈魚皮洗凈、切碎，加水進(jìn)行濕法打漿； 2) 酶解:加入鱈魚皮重量20~40%的水，混勻后升溫至50~60°C，調(diào)節(jié)pH至7.0,加入鱈 魚皮重量〇. 1~〇. 2 %的復(fù)合蛋白酶，50~60 °C的條件下酶解2~3小時(shí)； 3) 滅活:升溫至60~90 °C保持10分鐘，使酶滅活； 4) 固液分離:采用離心機(jī)對(duì)鱈魚皮酶解液離心20~30分鐘，收集酶解上清液； 5) 干燥:將酶解上清液進(jìn)行冷凍干燥成粉末，得狹鱈魚素。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種狹鱈魚素，其特征在于，所述狹鱈魚素組分中分子量小于 3000Da的占組分總數(shù)的75 %以上。3. 權(quán)利要求1的狹鱈魚皮素在制備預(yù)防皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥物中應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的狹鱈魚皮素在制備預(yù)防皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥物中應(yīng)用，其特征 在于，所述藥物配制成外用給藥制劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的狹鱈魚皮素在制備預(yù)防皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥物中應(yīng)用，其特征 在于，所述外用給藥制劑中狹鱈魚皮素的含量為5~25%。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK105969831SQ201610322724
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】韓彥弢, 苗德森, 趙晨懿, 王春波, 張德巖, 趙雲(yún)琪
【申請(qǐng)人】青島海博瑞克生物科技有限公司