基于AllGlo探針的Glu504lys檢測(cè)分型試劑盒及其分型方法
【專利摘要】基于AllGlo探針的Glu504lys檢測(cè)分型試劑盒及其分型方法，涉及單核苷酸多態(tài)性。試劑盒包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑、陽性對(duì)照及陰性對(duì)照；所述Glu504lys為NCBI所提供人12號(hào)染色體ALDH2基因中的SNP位點(diǎn)；分型方法：1)采用常規(guī)方法提取EDTA抗凝全血樣本中的DNA；2)采用所述基于AllGlo探針的Glu504lys檢測(cè)分型試劑盒提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑將DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；3)根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)對(duì)人ALDH2基因Glu504lys進(jìn)行分型。AllGlo探針在保持高特異性和敏感性的前提下，檢測(cè)價(jià)格比直接測(cè)序法更低廉，并且過程更簡易耗時(shí)更短。
【專利說明】
基于AI IGI 〇探針的GI u5041 ys檢測(cè)分型試劑盒及其分型方法
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及單核苷酸多態(tài)性(SNP)，尤其是涉及一種基于AllGlo探針的Glu5041ys 檢測(cè)分型試劑盒及其分型方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一 種。SNPs在人類基因組中廣泛存在，平均每500~1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá) 300萬個(gè)甚至更多。作為第三代遺傳標(biāo)志，SNP與人體許多表型差異、藥物易感性與疾病易感 性密切相關(guān)。SNP在基因組中的大量存在，使其成為一個(gè)強(qiáng)有力的工具，在疾病定位與克隆、 藥物的設(shè)計(jì)和測(cè)試以及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究中起了非常重要的作用。
[0003] 個(gè)體化診斷治療是未來醫(yī)學(xué)發(fā)展的大方向。將個(gè)體化的靶點(diǎn)定位于某個(gè)基因，甚 至是單個(gè)核苷酸，發(fā)現(xiàn)疾病的遺傳標(biāo)志物，將有助于根據(jù)每個(gè)患者的不同遺傳背景來開展 疾病預(yù)防、診斷和治療?；虻腟NP是形成個(gè)體間差異的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)，通過SNP與疾病和 藥物治療的關(guān)聯(lián)性分析，使得醫(yī)生不僅可以通過所檢測(cè)出的SNP預(yù)測(cè)、確定與疾病有關(guān)的基 因，同時(shí)也將能夠事先把握患者個(gè)體對(duì)于某種藥物的反應(yīng)特點(diǎn)，并根據(jù)這一特點(diǎn)選擇治療 效果最好，不良反應(yīng)等危險(xiǎn)性最小的藥物對(duì)患者進(jìn)行精準(zhǔn)治療。
[0004] SNP在疾病的預(yù)防、診斷、治療及個(gè)體化醫(yī)學(xué)發(fā)展中扮演著重要的角色，因此準(zhǔn)確 快速的進(jìn)行SNP檢測(cè)分型具有重大的意義。
[0005] 目前，SNP分型的方法主要有直接測(cè)序技術(shù)法、限制性片段長度多態(tài)性技術(shù) (RFLP)、Tagman熒光探針法、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)、高分辨熔解曲線分析法(HRM)等。其 中，直接測(cè)序法是目前最直觀，準(zhǔn)確性相對(duì)而言最高的SNP分型方法，但其步驟多而分散，成 本較高，工作量大，周期長，價(jià)格昂貴，不適合大樣本多位點(diǎn)檢測(cè);限制性片段長度多態(tài)性技 術(shù)(RFLP)作為一種最早的DNA標(biāo)記技術(shù)，對(duì)儀器要求低，只需要一臺(tái)PCR儀以及電泳儀器即 可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但其實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，檢測(cè)周期長，不適合大樣本檢測(cè);Tagman熒光探針法準(zhǔn)確 度較好，但其設(shè)計(jì)合成程序復(fù)雜，并且不適合多位點(diǎn)少量樣本的分型，尤其是頻率偏低的位 點(diǎn)；擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS法)快速、簡便，但是不能閉管操作，對(duì)基因多態(tài)性分析難以實(shí) 現(xiàn)高通量、自動(dòng)化;高分辨熔解曲線分析法(HRM)具有簡單、快速等優(yōu)點(diǎn)，但該方法特異性不 足，儀器選擇少。
[0006] AllGlo探針作為新一代的熒光探針，在具備TaqMan-MGB探針優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，大大 提高信噪比，減少背景熒光信號(hào)。目前，AllGlo探針已經(jīng)成功應(yīng)用于檢測(cè)皰疹病毒、乙型肝 炎病毒基因突變（Feng，Z.L.Yu，X.Y.Lu，Z.M.Geng，D.Y.Zhang，L.Chen，S.J.Rapid detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo? probes[J].Clin Chim Acta，2011，412( 11-12) :1018-1021 )、侵襲性曲霉菌?。╓u，D.S.Shen，J. Z. Zhou, X.Q.Shen,S.F.ffu,X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145)〇
[0007] 硝酸甘油是臨床上廣泛用于治療及預(yù)防冠心病心絞痛的常用藥，在治療心絞痛方 面已有100多年的歷史。雖然硝酸甘油是治療心絞痛的一線藥物，但其臨床的治療效果在不 同個(gè)體間卻有很大的差異，尤其在中國漢族人群中含服硝酸甘油無效的比例可高達(dá)25%以 上。乙醛脫氫酶(ALDH2)是體內(nèi)催化硝酸甘油生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，其酯酶活性可以通過將硝 酸甘油脫硝形成一氧化氮，進(jìn)而發(fā)揮作用。ALDH2第12外顯子存在一個(gè)SNP位點(diǎn)一 Glu5041ys，該SNP位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致ALDH2活性發(fā)生改變，進(jìn)而造成硝酸甘油無法產(chǎn)生一氧化氮， 喪失藥效。Glu5041ys在白種人中少見，但是在東亞黃種人中卻高達(dá)30%-50%(Goedde服， et al.Population genetic studies of aldehyde dehydrogenase isozyme deficiency and alcohol sensitivity .Am. J. Hum. Genet · 1983; 35:769-772)，因此在用藥前對(duì)患者進(jìn) 行Glu5041ys的檢測(cè)分型，能夠?yàn)榛颊哌x擇更為合適的治療藥物，避免無效用藥，為臨床治 療用藥提供重要的參考依據(jù)。在個(gè)體化診斷與治療快速發(fā)展的背景下，Glu5041ys與硝酸甘 油的緊密聯(lián)系使其成為了一個(gè)極具醫(yī)學(xué)潛力的SNP位點(diǎn)，因此急需一種更快速高效的SNP分 型方法來滿足精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的之一在于針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)SNP方法中使用的試劑盒和檢測(cè)方法存在的 上述缺陷，提供基于AllGlo探針的Glu5041ys檢測(cè)分型試劑盒。
[0009] 本發(fā)明的目的之二在于提供基于AllGlo探針的Glu5041ys檢測(cè)分型方法。
[0010]所述基于AllGlo探針的Glu5041ys檢測(cè)分型試劑盒，包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑、 陽性對(duì)照及陰性對(duì)照；
[0011] 所述Glu5041ys為美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)所提供人12號(hào)染色體ALDH2 基因中的SNP位點(diǎn)；
[0012] 所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑包括以下組份：10 X Taq緩沖液、10m mol的MgCl2、5ιι/μ L的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLow R0X、100mL無核酶水、10μ mol/L Glu5041ys的特異正向引物、ΙΟμ mol/L Glu5041ys的特異反向引物和AllGlo探針;所 述lOXTaq緩沖液包括 100m mol Tris-HCl和500m mol KC1。
[0013] 所述Glu5041ys的特異正向引物的核苷酸序列為：
[0014] SEQ ID N0·1:5'-GGCTACAAGATGTCGGGGAG-3，；
[0015] 所述Glu5041ys的特異反向引物的核苷酸序列為：
[0016] SEQ ID NO^^^GCCACCAGCAGACCCTCA-S^
[0017] 所述AllGlo探針為Glu5041ys的特異探針，其核苷酸序列為：
[0018] SEQ ID N0.3：Glu5041ys-A:MAR-CAGGCATACACTAAAG-MAR；
[0019] SEQ ID N0.4：Glu5041ys-G:JUP-CAGGCATACACTGAAG-JUP；
[0020] 所述陽性對(duì)照包括：陽性純合對(duì)照品1、陽性純合對(duì)照品2、陽性雜合對(duì)照品。所述 陽性純合對(duì)照品1為Glu5041ys分型為AA的DNA樣品，所述陽性純合對(duì)照品2為Glu5041ys分 型為GG的DNA樣品，所述陽性雜合對(duì)照品為Glu5041ys分型為AG的DNA樣品。
[0021 ]所述陰性對(duì)照為lmL的無核酶水。
[0022]所述基于AllGlo探針的Glu5041ys檢測(cè)分型方法，包括以下步驟：
[0023] 1)采用常規(guī)方法提取EDTA抗凝全血樣本中的DNA;
[0024] 2)采用所述基于AllGlo探針的Glu5041ys檢測(cè)分型試劑盒提供的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR試劑將DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增；
[0025] 3)根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)對(duì)人ALDH2基因 Glu5041ys進(jìn)行分型。
[0026] 所述AllGlo探針可米用美國AlleLogic Biosciences Corporation公司的焚光定 量探針，它擁有普通Taqman，Taqman_MGB及分子信標(biāo)(molecular beacon)探針?biāo)袃?yōu)點(diǎn)，克 服了目前這幾種探針的最大弊端，它打破了傳統(tǒng)Taqman-端報(bào)告基團(tuán)一端淬滅基團(tuán)的限 制，利用了美國AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的幾種常見波長的特制焚 光染料，標(biāo)記在寡核苷酸上面互為報(bào)告基團(tuán)和粹滅基團(tuán)，而且上面含有特殊的可以提高Tm 值(退火溫度)的化學(xué)基團(tuán)，提高探針特異性，雜交特異性大大提高，在雜交水解之后兩端標(biāo) 記的染料又全部變?yōu)閳?bào)告基團(tuán)，提高熒光增量。
[0027]所述AllGlo探針具有以下優(yōu)勢(shì)：①提高Tm值(可達(dá)10°C以上），探針更短可以達(dá)到 15~16個(gè)堿基，可以適用A，T含量比較高的序列設(shè)計(jì)探針;②加大了多重?zé)晒舛康倪x擇， 因?yàn)槊糠N染料即是報(bào)告基團(tuán)又是淬滅基團(tuán)，打破傳統(tǒng)Taqman探針因波長原因標(biāo)記選擇困 難，不受淬滅基團(tuán)波長限制；③大大提高信噪比，無背景信號(hào)，空間距離近，更好的淬滅效 果;④成本較低，價(jià)格僅相當(dāng)于Taqman-MGB探針的一半，具有MGB探針?biāo)袃?yōu)勢(shì)。
[0028] 本發(fā)明采用了 AllGlo探針技術(shù)，設(shè)計(jì)了特異性引物和相應(yīng)的AllGlo探針，探針分 別標(biāo)記2種特殊熒光基團(tuán)(MAR、JUP)，并對(duì)該技術(shù)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種AllGlo探 針SNP檢測(cè)分型方法，應(yīng)用前景廣闊。
[0029] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0030] 本發(fā)明提供了一種基于AllGlo探針的SNP檢測(cè)分型試劑盒和檢測(cè)方法，其特異性 和敏感性高，可快速準(zhǔn)確進(jìn)行SNP分型，與現(xiàn)有的常見技術(shù)相比具有以下優(yōu)勢(shì)：
[0031 ] 1.與直接測(cè)序法相比，AllGlo探針在保持高特異性和敏感性的前提下，檢測(cè)價(jià)格 比直接測(cè)序法更低廉，并且過程更簡易耗時(shí)更短。
[0032] 2.與taqman-MGB探針相比，AllGlo探針采用相同的熒光基團(tuán)，互為報(bào)告基團(tuán)和淬 滅基團(tuán)，一方面釋放的熒光信號(hào)更強(qiáng)，另一方面本底信號(hào)更低;而且合成程序簡單，價(jià)格僅 相當(dāng)于Taqman-MGB的一半。
[0033] 3.與限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(RFLP)相比，基于AllGlo探針的SNP分型方法將 反應(yīng)時(shí)間大大縮短，通量更大，并且敏感性與特異性要明顯高于基于限制性酶切位點(diǎn)的SNP 分型方法。
[0034] 4.與擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMS)相比，基于AllGlo探針SNP分型方法檢測(cè)靈敏度更 強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)"閉管操作"，有效防止外界污染，具有良好的特異性和準(zhǔn)確性。
[0035] 5 .與高分辨熔解曲線分析法(HRM)相比，基于A11G1 〇探針SNP分型方法特異性更 高，并且多種儀器可應(yīng)用AllGlo探針進(jìn)行SNP檢測(cè)分型，可用儀器選擇多，不需要特定技術(shù) 人員操作，應(yīng)用范圍更廣闊。
[0036] 6.本發(fā)明建立了基于AllGlo探針進(jìn)行Glu5041ys的檢測(cè)分型方法，適合人群進(jìn)行 個(gè)體化的SNP檢測(cè)分型，推動(dòng)了 SNP在臨床藥物研究及個(gè)體化用藥的發(fā)展。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 實(shí)施例1
[0038] 本發(fā)明基于AllGlo探針的Glu5041ys檢測(cè)分型試劑盒包括以下組份：
[0039] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑、陽性對(duì)照及陰性對(duì)照。
[0040] ①實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑包括以下組份:10 X Taq緩沖液(10 X Taq緩沖液包括100m mol Tris-HCl和500m mol KCl)、10m mol的MgCl2、5u/yL的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLow R0X、100mL無核酶水、10ymol/L Glu5041ys的特異正向引物、10 ymol/L Glu5041ys的特異反向引物和AllGlo探針。
[0041 ]②陽性對(duì)照包括：陽性純合對(duì)照品1、陽性純合對(duì)照品2、陽性雜合對(duì)照品。所述陽 性純合對(duì)照品1為Glu5041ys分型為AA的DNA樣品，所述陽性純合對(duì)照品2為Glu5041ys分型 為GG的DNA樣品，所述陽性雜合對(duì)照品為Glu5041ys分型為AG的DNA樣品。
[0042]③陰性對(duì)照為lmL的無核酶水。
[0043] 實(shí)施例2
[0044] 外周血Glu5041ys的檢測(cè)分型，包括以下步驟：
[0045] 1.收集EDTA抗凝外周血：
[0046] 抽取新鮮血液標(biāo)本2mL裝于EDTA抗凝管并分裝多管，每管分裝400~500yL，取200μ L用于DNA提取，其余全血標(biāo)本置于-80 °C凍存。
[0047] 2.提取 DNA:
[0048]采用天根生物科技有限公司的生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒(DP348)，按照操 作說明書進(jìn)行樣本(全血)DNA提取，200yLEDTA抗凝全血按照說明書操作進(jìn)行，最后用50yL 的洗脫緩沖液TB溶解DNA，于核酸分光光度儀器Nano Drop2000上分別測(cè)定濃度和純度，取 純度A260/A280比值在1.7~1.9之間，取濃度10~50ng/yL的已提取的DNA用于SNP分型檢 測(cè)，其余的DNA均于-80 °C凍存。
[0049] 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增：
[0050] 3.1將熒光定量PCR的各組分置于室溫溶解，混勻后置于冰上。
[0051] 3.2配制卩0?反應(yīng)混合液如表1。
[0052] 表 1
[0054] 3.3于8聯(lián)管中分裝配制好PCR反應(yīng)混合液，每管加入lyL的DNA，充分混勻，整個(gè)過 程在冰上進(jìn)行，避免氣泡的產(chǎn)生。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照，設(shè)置一個(gè)陽性純合對(duì)照品1， 一個(gè)陽性純合對(duì)照品2和一個(gè)陽性雜合對(duì)照品。
[0055] 3.4檢測(cè)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器上進(jìn)行，可使用ABI7300,7500(美國Applied Biosystems公司）等多種儀器。
[0056] 3.5設(shè)置熒光定量PCR反應(yīng)條件如表2。
[0057] 表 2
[0058]
[0059] 4.結(jié)果分析與處理:應(yīng)用ABI儀器自帶軟件進(jìn)行結(jié)果分析。根據(jù)對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果，分 型產(chǎn)生三種基因型：
[0060] 第一種基因型:AA，與陽性純合對(duì)照品1在同一軸上；
[0061] 第二種基因型:AG，與陽性雜合對(duì)照品在同一軸上；
[0062]第三種基因型:GG，與陽性純合對(duì)照品2在同一軸上。
[0063] 實(shí)施例3.組織樣本SNP檢測(cè)分型
[0064] 1 ·組織樣本處理：
[0065] 組織(脾組織用量應(yīng)少10mg)應(yīng)打碎處理為細(xì)胞懸液，然后lOOOOrpm(~11200Xg) 離心lmin，倒盡上清，加200yL緩沖液GA(天根DNA提取試劑盒DP304)，震蕩至徹底懸浮；
[0066] 2.組織樣本DNA提取和富集：
[0067]采用天根生物科技有限公司的生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(DP304)，按照操作說明書進(jìn) 行組織樣本的DNA提取，最后用50yL的洗脫緩沖液TE溶解DNA，于核酸分光光度儀器Nano Drop2000上分別測(cè)定濃度和純度；
[0068] 3.組織樣本的SNP檢測(cè)分型。
[0069]后續(xù)步驟參照實(shí)施例2的步驟3~4。
[0070] 可應(yīng)用范圍：
[0071]基于AllGlo探針的Glu5041yS檢測(cè)分型試劑盒及其檢測(cè)方法可應(yīng)用于人類組織樣 本和血細(xì)胞Glu5041ys的檢測(cè)分型，以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā) 明的優(yōu)點(diǎn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 基于AllGlo探針的Glu5041ys檢測(cè)分型試劑盒，其特征在于包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR試 劑、陽性對(duì)照及陰性對(duì)照； 所述Glu5041ys為美國國家生物技術(shù)信息中心所提供人12號(hào)染色體ALDH2基因中的SNP 位點(diǎn)。2. 如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針的Glu5041ys檢測(cè)分型試劑盒，其特征在于所述實(shí) 時(shí)熒光定量PCR試劑包括以下組份：lOXTaq緩沖液、10m mol的MgCl2、5u/yL的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLow R0X、100mL無核酶水、ΙΟμ mol/L Glu5041ys的特異正向引物、ΙΟμ mol/L Glu5041ys的特異反向引物和AllGlo探針;所述10 X Taq緩沖液包括 100m mol Tris-HCl和500m mol KC1。3. 如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針的Glu5041ys檢測(cè)分型試劑盒，其特征在于所述 Glu5041ys的特異正向引物的核苷酸序列為： SEQ ID NO.1：5;-GGCTACAAGATGTCGGGGAG-3;； 所述Glu5041ys的特異反向引物的核苷酸序列為： SEQ ID NO·2:5，-GCCACCAGCAGACCCTCA-3，； 所述AllGlo探針為Glu5041ys的特異探針，其核苷酸序列為： SEQ ID N0.3：Glu5041ys-A:MAR-CAGGCATACACTAAAG-MAR； SEQ ID N0.4:Glu5041ys-G:JUP-CAGGCATACACTGAAG-JUP。4. 如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針的Glu5041ys檢測(cè)分型試劑盒，其特征在于所述陽 性對(duì)照包括：陽性純合對(duì)照品1、陽性純合對(duì)照品2、陽性雜合對(duì)照品，所述陽性純合對(duì)照品1 為Glu5041ys分型為AA的DNA樣品，所述陽性純合對(duì)照品2為Glu5041ys分型為GG的DNA樣品， 所述陽性雜合對(duì)照品為Glu5041ys分型為AG的DNA樣品。5. 如權(quán)利要求1所述基于AllGlo探針的Glu5041ys檢測(cè)分型試劑盒，其特征在于所述陰 性對(duì)照為1 mL的無核酶水。6. 基于A1 lGlo探針的Glu5041ys檢測(cè)分型方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 采用常規(guī)方法提取EDTA抗凝全血樣本中的DNA; 2) 采用如權(quán)利要求1~5中任一所述基于AllGlo探針的Glu5041ys檢測(cè)分型試劑盒提供 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑將DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增； 3) 根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)對(duì)人ALDH2基因 Glu5041ys進(jìn)行分型。7. 如權(quán)利要求6所述基于AllGlo探針的Glu5041ys檢測(cè)分型方法，其特征在于所述 AllGlo探針采用美國AlleLogic Biosciences Corporation公司的焚光定量探針。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105969842SQ201610083711
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年2月6日
【發(fā)明人】方宜臻, 林華月, 張忠英
【申請(qǐng)人】廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院, 張忠英