一種快速檢測水產(chǎn)病原菌的組合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測水產(chǎn)病原菌的組合物，尤其是對殺鮭氣單胞菌具有特異性。該組合物能對殺鮭氣單胞菌進行快速檢測。根據(jù)殺鮭氣單胞菌特異保守基因vapA、spsM、spsE設計引物，可在40分鐘左右完成殺鮭氣單胞菌的檢測，靈敏度達到20cfu/反應。本發(fā)明組合物進行檢測，能使反應結果檢測方便、快捷。可直接觀察反應體系的顏色變化來判定，反應體系由淺褐色變?yōu)闊晒饩G即為陽性結果。同時設備要求簡單，易操作，反應速度更快。
【專利說明】
一種快速檢測水產(chǎn)病原菌的組合物及其制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測水產(chǎn)病原菌的組合物及其制備方法，更具體地說，本發(fā) 明涉及一種對殺鮭氣單胞菌有特異性的組合物及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 水產(chǎn)養(yǎng)殖是我國大農(nóng)業(yè)中發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴大，病害問題 已經(jīng)成為制約產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素。其中細菌性致病是危害養(yǎng)殖業(yè)的一類主要疾病， 每年給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。病原菌的快速檢測可以為魚類養(yǎng)殖日常生產(chǎn)提供 病原變化信息，為病害預警提供依據(jù)，避免病害發(fā)生可能造成的巨大損失。
[0003] 殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)為革蘭氏陰性菌，分布廣泛，能夠引發(fā)多 種水產(chǎn)動物的疾病，是一種致病力較強的水產(chǎn)病原菌。它不僅可以引起多種魚類皮膚潰瘍 病還可以侵染棘皮動物海膽和刺參，并引發(fā)疾病，造成巨大的經(jīng)濟損失。
[0004] 目前，國內(nèi)對魚類細菌性疾病快速診斷技術的研究還處于初級階段，常用的鑒定 方法費時費力，有的還不準確，甚至需要專業(yè)技術人員或?qū)I(yè)技術設備，難以在養(yǎng)殖生產(chǎn)上 應用，遠遠不能滿足生產(chǎn)上的需要，且難以對病原生物早期監(jiān)控、定期檢測、現(xiàn)場快速診斷， 因此往往是爆發(fā)了大規(guī)模流行性疾病后才引起關注和重視。國內(nèi)外尚無針對殺鮭氣單胞菌 的快速有效的易于現(xiàn)場操作的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種靶序列擴增特異性高、反應結果檢測方便和快捷的檢測 水產(chǎn)病原菌的組合物。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種設備要求簡單和易操作、反應速度快、快速有效 且易于現(xiàn)場操作的檢測殺鮭氣單胞菌的檢測方法。
[0007] 本發(fā)明的目的在于:殺鮭氣單胞菌特異基因的選擇及引物的設計和優(yōu)化后的等溫 擴增反應體系的配比及反應條件的設定。
[0008] 本發(fā)明是基于環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification,簡 稱為LAMP)技術建立一種快速檢測殺鮭氣單胞菌的方法，該方法的核心內(nèi)容是殺鮭氣單胞 菌特異基因的選擇及引物的設計和優(yōu)化后的等溫擴增反應體系的配比及反應條件的設定。
[0009] 環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification,簡稱為LAMP)技術 依賴于能夠識別靶DNA上6個特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒 溫條件下高效擴增核酸，1小時即可完成，產(chǎn)物是由多重復靶序列的莖-環(huán)狀DNA和花椰菜狀 DNA所組成的混合物，具有高特異性、快速靈敏、操作簡便等特點。本發(fā)明建立的環(huán)介導等溫 擴增體系通過染料鈣黃綠素的顏色變化來指示反應結果，肉眼即可觀察。
[0010] LAMP對引物設計的要求非常高，LAMP的2對引物分別稱為FIP和BIP、F3和B3,可識 別靶基因的6個不同的區(qū)域。F3:正向外引物，F(xiàn)3區(qū)與靶基因的F3c區(qū)域互補；B3:反向外引 物，B3區(qū)域與靶基因的B3c區(qū)域互補;FIP:正向內(nèi)引物，由F2區(qū)和Flc區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基 因3'端的F2c區(qū)域互補，F(xiàn)lc區(qū)與靶基因5'端的Flc區(qū)域序列相同;BIP:反向內(nèi)引物，由Blc和 B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3'端的B2c區(qū)域互補，Blc區(qū)域與靶基因5'端Blc區(qū)域序列相同。 在LAMP反應中加入環(huán)引物(正向環(huán)引物LF、反向環(huán)引物LB)能夠明顯加快等溫擴增的速度， 大大提尚了檢測效率。
[0011]
[0012] LAMP引物設計
[0013] 遵循"種內(nèi)保守，種間特異"的原則，通過查閱文獻和與NCBI數(shù)據(jù)庫中殺鮭氣單胞 菌基因組以及本實驗室已測序殺鮭氣單胞菌基因組的比對分析，篩選到vapA、 SpSM、SpSE 三個殺鮭氣單胞菌特異毒力基因的保守區(qū)（300bp左右)作為靶基因來設計等溫擴增的引 物。使用在線等溫擴增引物設計軟件?1'；[1116也1口10代1'￥40；^￥3^來設計引物。引物序列如 下：（備注：由于設計的引物F1和F2在靶基因上距離較近，不需要再添加正向環(huán)引物LF，只需 添加反向環(huán)引物LB即可）
[0014]

[0022] LAMP反應體系特異性評價：以水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中常見細菌包括溶藻弧菌、大西洋弧 菌、西瓦氏菌、馬胃葡萄球菌、嗜冷桿菌、堅強芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌和3株殺鮭氣單胞菌 的DNA為模板，評價反應體系特異性。3株殺鮭氣單胞菌核酸檢測均在1小時內(nèi)出現(xiàn)了陽性擴 增，7株非殺鮭氣單胞菌核酸檢測均未出現(xiàn)陽性擴增，表明該LAMP反應體系特異性較好。陽 性結果為由淺褐色變?yōu)闊晒饩G，陰性結果和陰性對照均為淺褐色。
[0023] LAMP反應體系的優(yōu)化:25yL的LAMP反應體系包括2個內(nèi)引物FIP和BIP、2個外引物 卩3和133、1個環(huán)引物1^、10\11161'11^1〇1131^€61'、甜菜堿(136丨3；[116)、脫氧核糖核苷酸（(1階？）、 硫酸鎂、氯化錳、鈣黃綠素 、Bst DNA聚合酶、DNA模板、滅菌水補足體系。選擇對LAMP體系中 的關鍵因素進行優(yōu)化，包括外引物與內(nèi)引物濃度比（1:4、1:6、1:8、1:10、1:12)、鎂離子濃度 (3、4、5、6、7、8、9mmol/L)、鈣黃綠素與氯化錳的比例（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)、反 應溫度(61、62、63、64、65°0。最終得到最優(yōu)的擴增體系如下：25以1^的1^^反應體系，63度恒 溫擴增。
[0025] LAMP反應體系靈敏度評價:將殺鮭氣單胞菌培養(yǎng)液10倍系列梯度稀釋后，選取連 續(xù)7個稀釋度用血球計數(shù)板計數(shù)，每個稀釋度分別取3個樣品計數(shù)，求出每個稀釋度的平均 值。以上述10倍梯度稀釋的細菌DNA為模板，使用優(yōu)化后的LAMP反應體系進行擴增試驗。最 終得到優(yōu)化后的LAMP反應體系靈敏度為20cfu/反應，反應條件為63度恒溫擴增45分鐘。
[0026] 本發(fā)明取得了如下效果：1)LAMP對靶序列擴增的特異性高。由于LAMP通過4條引物 與靶序列上的6個特異部位準確結合來產(chǎn)生擴增反應，因此可以獲得比PCR更高的特異性。 2)反應結果檢測方便、快捷?？芍苯佑^察反應體系的顏色變化來判定，反應體系由淺褐色變 為熒光綠即為陽性結果。3)設備要求簡單，易操作。LAMP只需要一個普通的水浴鍋或者恒溫 裝置，操作簡單、攜帶方便，技術門檻低。4)反應速度更快。LAMP是恒溫擴增反應，沒有PCR反 應中溫度變化的耗時，一般在30min-60min內(nèi)即可完成，比熒光定量PCR反應速度更快，能更 好的滿足生產(chǎn)現(xiàn)場的快速檢測的要求。5)-般情況下，以分子水平為基礎的檢測方法例如 PCR和熒光定量PCR都會受臨床標本中抑制物的影響，一些研究者報道LAMP使用的Bst DNA 聚合酶對樣品中抑制物的耐受能力比熒光定量PCR中的Taq酶要強。因此LAMP比熒光定量 PCR具有更廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0027]圖1引物spsM特異性實驗對照 [0028]圖2引物spsE特異性實驗對照 [0029]圖3引物vapA特異性實驗對照 圖4 LAMP引物設計
[0030] 1--錯樣芽胞桿菌;2--溶藻弧菌;3--馬胃葡萄球菌；
[0031] 4一一西瓦氏菌;5-一大西洋弧菌;6-一堅硬芽孢桿菌；
[0032] 7--嗜冷桿菌;8--殺鮭氣單胞菌S7; 9--殺鮭氣單胞菌S53;
[0033] 1〇--殺鮭氣單胞菌S121;ll--陰性對照。
【具體實施方式】
[0034] 實施例1
[0035]按體積比該組合物包括： l〇x Thcrmpol builcr 10f/〇 5M:甜菜堿： 12%、
[0036] 100 mM 硫酸鎂 6%、 12.5 mM氯化錳 4%、 0,625 mM鈣黃緑素 4%^
[0037] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為65分鐘(反應溫度為63度，DNA模板濃度為50ng/yL)。
[0038] 實施例2
[0039]按體積比該組合物包括： 10v Thcrmpol bulTcr 10%、 5M甜菜堿 16%、
[0040] 100 mM 硫酸鎂 3%、 12.5 mM氯化錳 4%、 0.625 mM鈣黃綠素 4%
[00411檢測殺鮭氣單胞菌的時間為58分鐘(反應溫度為63度，DNA模板濃度為50ng/yL)。
[0042] 實施例3
[0043]按體積比該組合物包括： 1 〇\ Thermpol buH'er 101?、 5M甜菜堿 16%、
[0044] 100 mM 硫酸鎂 6%、 12.5 mM 氯化錳： 1%、 0.625 mM鈣黃綠素 4%,
[0045] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為40分鐘，陽性結果和陰性結果顏色區(qū)分度較低(反應 溫度為63度，DNA模板濃度為50ngAiL)。
[0046] 實施例4
[0047]按體積比該組合物包括： l〇x Thcrmpo! bulTcr 10% 5M:甜菜堿 16%、
[0048] 100 mM 硫酸鎂 6% 12.5 mM氯化錳 4%、 0,625'mM鈣黃綠素 1%P
[0049] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為40分鐘，陽性結果和陰性結果顏色區(qū)分度較低(反應 溫度為63度，DNA模板濃度為50ngAiL)。
[0050] 實施例5
[00511按體積比該組合物包括： 10、Thcrnipol bulTbr 8%、 5M甜菜堿 16%、
[0052] l.O.O.mM 疏酸鎂 6%, 12.5 mM氯化錳 蛛％、 0.625 mM鈣黃綠素 4%P
[0053] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為55分鐘(反應溫度為63度，DNA模板濃度為50ngAiL)。
[0054] 實施例6
[0055]按體積比該組合物包括： l〇x Thcrmpol buffer 12〇/0> 5M 甜菜堿 16%、
[0056] ]00mM硫酸鎂 6%、 12.5 mM氯化猛 4%、
[0057] 0.625 mM 鈣黃綠素 4%。：
[0058]檢測殺鮭氣單胞菌的時間為50分鐘(反應溫度為63度，DNA模板濃度為50ngAiL)。
[0059] 實施例7
[0060]按體積比該組合物包括： l〇x Thcrmpol buffer 10:%、 5M甜菜堿 20%、
[0061 ] 100 mM 硫酸鎂 .6%、 12.5 mM 氯化錳 4%:、 0.625 mM鈣黃綠素 4%。
[0062] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為45分鐘(反應溫度為63度，DNA模板濃度為50ng/yL)。
[0063] 實施例8
[0064]按體積比該組合物包括： 10x Thcrmpol bulTcr 10%、 5M甜菜堿 16%、
[0065] 100 mM 硫酸鎂 9%、 12.5 mM氯化錳 4%、 0.:625 imM鈣黃綠素 4%。
[0066] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為45分鐘(反應溫度為63度，DNA模板濃度為50ng/yL)。
[0067] 實施例9
[0068]按體積比該組合物包括： l〇x Thcrmpol bulTcr 10%、
[0069] 5 Μ 甜菜堿 16%、 100 mM硫酸鎂 6%、 12.5 mM氯化錳 4%、
[0070] 0.625 mM鈣黃綠素 8%。
[0071] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為40分鐘，陽性結果和陰性結果顏色區(qū)分度較低(反應 溫度為63度，DNA模板濃度為50ngAiL)。
[0072] 實施例10
[0073]按體積比該組合物包括： l〇x Thermpo! bulTcr 10% 5M甜菜堿 16%、
[0074] lOOraM 硫酸鎂 6%、 氯化錳 8%、. 0.:6_2:5.mM 1? 黃綠素 4%。
[0075] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為40分鐘，陽性結果和陰性結果顏色區(qū)分度較低(反應 溫度為63度，DNA模板濃度為50ngAiL)。
[0076] 實施例11
[0077]按體積比該組合物包括： IQx Thcrmpol buil'cr 1.0%、.. 5M甜菜堿 16%、 ]()0mM硫酸鎂 6%、 12.5 mM氯化錳 4%、 0.625 mM鈣黃綠素 4%。
[0078] 2:S mM dNTP 5.6%·. 100 μΜ F3 0.2%, 100μΜ B3 0.2%、 100μΜ FIP 1，6%、 100μΜ BIP 1.6%, 100μΜ LB 0.8%, BstDNA聚介酶 4%、
[0079] DNA 模板 8%、 無菌水 補足體系。
[0080] 該反應體系檢測殺鮭氣單胞菌的時間為40分鐘，陽性結果和陰性結果顏色區(qū)分度 較高(反應溫度為63度，DNA模板濃度為50ngAiL)。
[0081 ] 實施例12
[0082] LAMP引物設計
[0083]遵循"種內(nèi)保守，種間特異"的原則，通過查閱文獻和與NCBI數(shù)據(jù)庫中殺鮭氣單胞 菌基因組以及本實驗室已測序殺鮭氣單胞菌基因組的比對分析，篩選到vapA、SpSM、 SpSE三 個殺鮭氣單胞菌特異毒力基因的保守區(qū)（300bp左右)作為靶基因來設計等溫擴增的引物。 使用在線等溫擴增引物設計軟件PrimerExplorer V4software來設計引物。引物序列如下： (備注：由于設計的引物F1和F2在靶基因上距離較近，不需要再添加正向環(huán)引物LF，只需添 加反向環(huán)引物LB即可）
[0084]
[0085] vapA
[0086]
[0092] LAMP反應體系特異性評價：以水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中常見細菌包括溶藻弧菌、大西洋弧 菌、西瓦氏菌、馬胃葡萄球菌、嗜冷桿菌、堅強芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌和3株殺鮭氣單胞菌 的DNA為模板，評價反應體系特異性。3株殺鮭氣單胞菌核酸檢測均在1小時內(nèi)出現(xiàn)了陽性擴 增，7株非殺鮭氣單胞菌核酸檢測均未出現(xiàn)陽性擴增，表明該LAMP反應體系特異性較好。陽 性結果為由淺褐色變?yōu)闊晒饩G，陰性結果和陰性對照均為淺褐色。
[0093] LAMP反應體系的優(yōu)化:25yL的LAMP反應體系包括2個內(nèi)引物FIP和BIP、2個外引物 卩3和133、1個環(huán)引物1^、10\11161'11^1〇1131^€61'、甜菜堿(136丨3；[116)、脫氧核糖核苷酸（(1階？）、 硫酸鎂、氯化錳、鈣黃綠素 、Bst DNA聚合酶、DNA模板、滅菌水補足體系。選擇對LAMP體系中 的關鍵因素進行優(yōu)化，包括外引物與內(nèi)引物濃度比（1:4、1:6、1:8、1:10、1:12)、鎂離子濃度 (3、4、5、6、7、8、9mmol/L)、鈣黃綠素與氯化錳的比例（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)、反 應溫度(61、62、63、64、65°0。最終得到最優(yōu)的擴增體系如下：25以1^的1^^反應體系，63度 恒溫擴增
[0095] LAMP反應體系靈敏度評價:將殺鮭氣單胞菌培養(yǎng)液10倍系列梯度稀釋后，選取連 續(xù)7個稀釋度用血球計數(shù)板計數(shù)，每個稀釋度分別取3個樣品計數(shù)，求出每個稀釋度的平均 值。以上述10倍梯度稀釋的細菌DNA為模板，使用優(yōu)化后的LAMP反應體系進行擴增試驗。最 終得到優(yōu)化后的LAMP反應體系靈敏度為20cfu/反應，反應條件為63度恒溫擴增45分鐘。
【主權項】
1. 一種快速檢測水產(chǎn)病原菌的組合物，按體積比該組合物包括： i〇x Thcmipol b山Ter 8%-! 2%、 5M 甜菜堿 12%-20%、 100 mM 硫酸簇 3〇/〇-9〇/〇、 12.5 ητΜ 氯化猛 1%-8%. 0.625 mM 巧巧綠某 1%-8%。2. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中10 X化ermpol buffer的體積比含量為10 %。3. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中5M甜菜堿的體積比含量為16%。4. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中l(wèi)OOmM硫酸儀的體積比含量為6 %。5. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中12.5mM氯化儘的體積比含量為4%。6. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，其中0.625mM巧黃綠素的體積比含量為4%。7. 根據(jù)權利要求1所述的組合物，按體積比該組合物還包括： 25 mM clNTP 5.6%、 100μΜ引物混合物： 4.4%、 Bst DNA 聚合酶 4:%、 DNA模板 8%、 無菌水 補足體系。8. 根據(jù)權利要求7所述的組合物，其中所述的100μΜ引物混合物按其體積比包括： 100μΜ F3 0.2%、 100μΜ 總 3 0,2% V 100μΜ F!P !'(-,%、 Ι.ΟΟμΜ BIP 1,6%. 100μΜ； LB 0.8% 〇9. 一種快速檢測水產(chǎn)病原菌的組合物的應用，其特征在于對殺娃氣單胞菌有特異性。
【文檔編號】C12Q1/68GK105969853SQ201610317558
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】馮婕, 杜曉辰
【申請人】中國科學院微生物研究所