一種弓形蟲熒光定量pcr特異性引物、試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種弓形蟲熒光定量PCR特異性引物、試劑盒及其檢測方法,本發(fā)明含有弓形蟲熒光定量PCR特異性引物、DNA提取液、熒光定量PCR反應(yīng)液、質(zhì)控反應(yīng)液、Spin Columns CB3、Collection Tubes 2ml，本發(fā)明應(yīng)用GRA7基因作為遺傳標(biāo)記，以特異性引物優(yōu)化試劑濃度、溫度等PCR反應(yīng)體系條件，能夠快速、特異、靈敏檢測動物感染弓形蟲病，操作簡捷，能應(yīng)用多種動物弓形蟲病的診斷。
【專利說明】
一種弓形蟲熒光定量PCR特異性引物、試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及熒光定量PCR特異性引物及其應(yīng) 用檢測技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 剛性弓形蟲簡稱弓形蟲，是專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲。弓形蟲的生活史包括5種形態(tài)，即 滋養(yǎng)體(又稱速殖子）、包囊(可長期存活于組織內(nèi)，破裂后可釋出緩殖子）、裂殖體、配子體 和囊合子，前3期為無性生殖，后2期為有性生殖。弓形蟲生活史的完成需中間宿主和終宿 主，弓形蟲寄生在中間宿主內(nèi)進(jìn)行無性生殖，只有在終宿主內(nèi)才能進(jìn)行有性生殖。
[0003] 貓和其他貓科動物是弓形蟲的終末宿主，弓形蟲有性生殖僅在終宿主腸粘膜上皮 細(xì)胞內(nèi)發(fā)育，發(fā)生局部感染;而中間宿主(包括人、其他哺乳類動物，禽類)吞入囊合子會發(fā) 生感染，囊合子內(nèi)含子孢子，能穿過小腸腸壁，隨血液或淋巴流動散播全身各個組織，在細(xì) 胞內(nèi)以縱二分裂法進(jìn)行增值，宿主細(xì)胞破裂后，滋養(yǎng)體會侵犯其他細(xì)胞，對中間宿主造成危 害。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，全球人類感染弓形蟲的概率有25-50%。一般免疫功能正常的 人不會出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。多種畜禽如豬、牛、貓、犬、羊、馬、駱駝、家兔、雞、鴨等均可感 染弓形蟲，其中以豬的感染率較高，病死率可達(dá)60%以上，這對畜牧業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損 失。
[0004] 當(dāng)前弓形蟲病的診斷方法有病原學(xué)檢查、免疫學(xué)檢查及分子生物學(xué)方法。病原學(xué) 培養(yǎng)和動物接種雖是弓形蟲檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但漏診率高，操作繁瑣，耗時長，成本高，通常只 用于基礎(chǔ)研究。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法由于簡便，快速，敏感性尚佳，仍然是各實(shí)驗(yàn)室的常用方 法，但血清學(xué)只是感染的間接標(biāo)志，當(dāng)機(jī)體免疫力低下時，則很難獲得可供診斷的血清學(xué)結(jié) 果。
[0005] 自 1985年MyLls等創(chuàng)立聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)， 如今已發(fā)展出多種相關(guān)技術(shù)應(yīng)用于寄生蟲遺傳變異和種類鑒定的分子生物學(xué)方法研究，包 括特異PCR、DNA序列分析、多重PCR、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)連接的限 制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAH))、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCR)以及 熒光定量PCR等，為分子寄生蟲學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展提供了有利的工具。
[0006] 熒光定量PCR原理是以熒光共振能量轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)，在反應(yīng)體系中加入熒光探針或 熒光染料，利用熒光信號的積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR的反應(yīng)過程。熒光染料結(jié)合在DNA雙鏈的 小溝中，當(dāng)DNA擴(kuò)增時，焚光染料可與dsDNA結(jié)合，發(fā)出熒光信號，隨著dsDNA漸增，熒光信號 逐漸增強(qiáng)，當(dāng)信號達(dá)到閾值時，熒光信號即可被熒光定量PCR儀器檢測到。每個模板的Ct值 與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。通過對不同稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品做熒光定量 PCR，即可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線可以對未知樣品進(jìn)行定性和定量檢測。常用的熒光 染料有Pico Green和SYBR Green，熒光染料法相對于熒光探針優(yōu)勢在于檢測方法簡單，檢 測成本低。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相 比，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，并且能有效解決PCR污染問題。
[0007] 對比文件1:中國發(fā)明專利申請公開號為"CN101613751A"，名為《快速檢測弓形蟲 的熒光定量PCR試劑盒》的文件中針對弓形蟲B1基因的檢測，記載了如下技術(shù)特征：
[0008] 快速檢測弓形蟲的熒光定量PCR試劑盒包括：
[0009] 1)DNA提取液裂解緩沖液，其組分:0.1MTris-HCl(pH8.0)，0.1 ~0.15M NaCl，0.1 ~0.15M EDTA(pH8.0)，l%~4%SDS;
[001 0] 20mg/ml蛋白酶K貯存液，加入裂解緩沖液的終濃度為4yg/yL;
[0011] 2)熒光定量PCR反應(yīng)液（包括SYBR-Rreen I，弓形蟲B1基因特異性引物、MgC12、 dNTPs、無菌雙蒸水）；
[0012] 3)標(biāo)準(zhǔn)陽性模板pMD-Bl，含有弓形蟲B1基因223個堿基的核苷酸片段構(gòu)成的pMD- 18重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a增殖后；
[0013] 4)弓形蟲B1基因特異性引物；
[0014] 5)陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，即無菌雙蒸水。
[0015]第一，對比文件1中以B1基因?yàn)闄z測的靶基因，理論上檢測的靈敏度與實(shí)際檢測下 限出入較大。正常情況下，臨床樣品感染了 0.5個速殖子，加上DNA提取效率不可能達(dá)到 100%及一些操作上的誤差，實(shí)際上是難以檢測得到的；
[0016] 第二，對比文件1中檢測的時間為2小時，檢測效率并未達(dá)到最高水平，究其原因可 知:對比文件1中擴(kuò)增的目的片段為223bp，而理想的qPCR的目的片段長度為200bp以下，所 以擴(kuò)增效率不夠高;另外，該技術(shù)方案的反應(yīng)采用3步法，檢測時間較長；
[0017] 第三，對比文件1在加樣時，反應(yīng)液是分開加的（SYBR-Rreen I，MgC12、dNTPs，Taq 酶及Buffer)，操作不夠簡便。
[0018] 為了克服B1基因的檢測技術(shù)的不足，另開發(fā)一種新檢測技術(shù)是醫(yī)學(xué)發(fā)展的必然需 求。
[0019] 研究表明：弓形蟲致密顆粒蛋白7(GRA7)雖只占弓形蟲蛋白總量的0.5%，但在弓 形蟲生活史的每個階段均有表達(dá)(參考文獻(xiàn)1)，可見GRA7對于弓形蟲的作用非同小可。GRA7 基因序列具有高度保守性，但目前在分子生物學(xué)層面上對該基因序列檢測研究甚少。
[0020] 參考文獻(xiàn)[1]洪彩玲.弓形蟲GRA7分泌蛋白與宿主組分的相互作用研究[D].首都 醫(yī)科大學(xué)，2014.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 本發(fā)明的目的在于為克服現(xiàn)有技術(shù)中檢測靈敏度不足、檢測效率不高等存在的問 題，提供1對能用于檢測弓形蟲的特異性引物。
[0022] 本發(fā)明的另一個目的是提供利用上述引物制成的試劑盒。
[0023] 本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供利用上述試劑盒以SYBR Green熒光染料法進(jìn)行弓形 蟲病熒光定量PCR檢測的方法。
[0024] 為了達(dá)到上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0025] 本研究對來自于不同宿主，不同地理位置的弓形蟲分離株的致密顆粒蛋白7 (GRA7)基因進(jìn)行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)GRA7種內(nèi)保守性很高，可用作診斷檢測的靶基因。本申 請發(fā)明人根據(jù)弓形蟲的GRA7的特異序列設(shè)計1對特異引物如下：
[0026] qPCR-F:5，-ACGACAACATCTACGAGGAG-3，；
[0027] qPCR-R:5，-GCACCCATACCAACAGC-3，。
[0028] 本發(fā)明基于上述引物組成用于檢測豬弓形蟲的試劑盒，含有：
[0029] (l)DNA 提取液：Buffer GA、Buffer GB、Buffer GD、Buffer PW、Buffer TE、 Proteinase K、無水乙醇。
[0030] (2)熒光定量PCR反應(yīng)液:SYBR Green I、引物、雙蒸水。
[0031 ] (3)質(zhì)控反應(yīng)液：陰性對照反應(yīng)液:滅菌雙蒸水、陽性對照反應(yīng)液:含有弓形蟲GRA7 基因的pMD-18質(zhì)粒。
[0032] 在上述試劑盒中，還包括Spin Columns CB3、Collection Tubes 2ml〇
[0033] 在上述試劑盒中，各物質(zhì)的優(yōu)選量為：
[0034] (l)DNA 提取液：為反應(yīng) 200 次的 50mL 的 Buffer GA、50mL 的 Buffer GB、52mL 的 Buffer GD、50mL的Buffer PW、60mL的Buffer TE、4mL的Proteinase K、10mL的無水乙醇；
[0035] (2)熒光定量PCR反應(yīng)液:為反應(yīng)200次的SYBR Green I試劑、終濃度為lOpmol/yL 的弓形蟲特異性引物、雙蒸水；
[0036] (3)質(zhì)控反應(yīng)液:為反應(yīng)200次的陰性對照反應(yīng)液和陽性對照反應(yīng)液。
[0037]本發(fā)明同時提供所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟：
[0038] 1:DNA的提取（參照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒，按說明書提取弓形蟲全基 因組DNA):
[0039] (1)取200yL生理鹽水或ros研磨好的待檢動物的組織勻漿，11200xg離心lmin，棄 上清，加 200yL緩沖液GA，震蕩至徹底混勻；
[0040] (2)加入20yL蛋白酶K，于漩渦振蕩器上混勻，瞬時離心后放置到56°C的水浴鍋中 作用lh;
[0041 ] (3)瞬時離心后加入200yL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 °C放置10min，溶液應(yīng)變清 亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；
[0042] (4)加入200yL無水乙醇，充分震蕩15s，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去 除管蓋內(nèi)壁的水珠；
[0043] (5)將上一步所得的溶液加入一個吸附柱CB3中13400x g離心lmin，倒掉廢液，將 吸附柱CB3放回收集管中；
[0044] (6)向吸附柱中加入500μ1緩沖液⑶(使用前先檢查是否已加入無水乙醇），13400x g離心lmin，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；
[0045] (7)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW(使用前先檢查是否已加入無水乙醇）， 13400x g離心lmin，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
[0046] (8)重復(fù)操作步驟(7);
[0047] (9)將吸附柱CB3放回收集管中，13400x g離心2min，倒掉廢液，將吸附柱置于室溫 放置10分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；
[0048] (10)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100yL 洗脫緩沖液TE，室溫放置5min，13400x g離心2min，將溶液收集到離心管中；為增加基因組 DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱中，室溫放置2min，13400x g離心2min;離心 管中的液體即為提取的基因組DNA，-20°C保存待檢。
[0049] 2:熒光定量PCR擴(kuò)增:反應(yīng)體系為：SYBR Green I 10yL，上下游引物各0.4yL，雙蒸 水7.2yL，模板DNA 2yL。按照待檢的擴(kuò)增樣品數(shù)n(n = n+l)取PCR反應(yīng)液混勻，然后分別吸取 18yL至各個反應(yīng)管中，將保存待檢DNA加入對應(yīng)反應(yīng)管中，同時分別吸取2yL的陰性對照反 應(yīng)液和陽性對照反應(yīng)液于2個反應(yīng)管中，標(biāo)記后混勻離心，置于熒光定量PCR儀上，設(shè)置擴(kuò)增 為:95 °C預(yù)變性3min; 95 °C變性5s，60.5 °C退火延伸30s，共40個循環(huán);熔解參數(shù)為:熔解溫度 范圍為60 °C到95 °C，每步升溫1°C，然后啟動反應(yīng)。
[0050] 3:熒光定量PCR結(jié)果分析:從終端電腦上讀取熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果及熔解結(jié)果。
[0051] 本發(fā)明的有益效果是：
[0052] (1)本發(fā)明對來自于不同宿主，不同地理位置的弓形蟲分離株的致密顆粒蛋白7 (GRA7)基因進(jìn)行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)GRA7種內(nèi)保守性很高，可用作診斷檢測的靶基因。本申 請發(fā)明人根據(jù)弓形蟲的GRA7的特異序列設(shè)計1對特異引物，建立了用于檢測豬弓形蟲病的 熒光定量PCR方法。
[0053] (2)本發(fā)明通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，研制出一種基于熒光染料法的檢測豬 弓形蟲病熒光定量PCR試劑盒，試劑盒操作簡單程序化，方法特異性強(qiáng)，敏感性高，結(jié)果判定 客觀。該方法可實(shí)現(xiàn)對豬弓形蟲病的流行病學(xué)調(diào)查、隱性感染的檢測和臨床診斷，為動物弓 形蟲病的診斷和防治技術(shù)等進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0054]此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本申請的一部分，并不 構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定，在附圖中：
[0055]圖1弓形蟲熒光定量PCR特異性擴(kuò)增圖；
[0056]圖1中卜6分別代表RH株弓形蟲，PRU株弓形蟲，VEG株弓形蟲，新孢子蟲，豬等孢球 蟲和豬附紅細(xì)胞體的特異性擴(kuò)增曲線圖；
[0057]圖2弓形蟲熒光定量PCR特異性熔解圖；
[0058]圖2中卜6分別代表RH株弓形蟲，PRU株弓形蟲，VEG株弓形蟲，新孢子蟲，豬等孢球 蟲和豬附紅細(xì)胞體的特異性熔解曲線圖；
[0059]圖3弓形蟲陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR擴(kuò)增曲線；
[0060]圖 3中，1-5 分別代表陽性質(zhì)粒 PMD18-GRA7 濃度為107、106、105、104、10 3copies/uUt 的擴(kuò)增曲線圖；
[0061 ]圖4弓形蟲陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品焚光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0062] 圖5弓形蟲熒光定量PCR敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0063] 圖 5中，1-6 分別代表陽性質(zhì)粒 PMD18-GRA7 濃度為lO^lO'lO^lO^lO^lOlopies/ ul時的擴(kuò)增曲線圖；
[0064] 圖6弓形蟲熒光定量PCR重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0065] 圖6中，1-4分別代表陽性質(zhì)粒PMD18-GRA7濃度為107、106、105、10 4copies/ul時分 別做的三個重復(fù)擴(kuò)增曲線圖；
[0066]圖7到圖12 50份豬血液臨床樣品的檢測結(jié)果；
[0067] 圖7到圖12中，PC代表陽性對照，NTC代表陰性對照。
【具體實(shí)施方式】
[0068]下面將結(jié)合附圖以及具體實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明，在此以本發(fā)明的示意性實(shí)施 例及說明用來解釋本發(fā)明，但并不作為對本發(fā)明的限定。
[0069]實(shí)施例1試劑盒的組成
[0070] 試劑盒內(nèi)含：
[0071] 1)DNA提取液，其中含有反應(yīng)200次的50mL的Buffer GA、50mL的Buffer GB、52mL的 Buffer GD、50mL的Buffer PW、60mL的Buffer TE、4mL的Proteinase K、10mL的無水乙醇；
[0072] 2)熒光定量PCR反應(yīng)液為反應(yīng)200次的SYBR Green I試劑、終濃度為lOpmol/yL的 弓形蟲特異性引物、滅菌雙蒸水、MgCl 2、dNTPs，Taq酶。
[0073] 3)質(zhì)控反應(yīng)液為反應(yīng)200次的陰性對照反應(yīng)液和陽性對照反應(yīng)液。
[0074]實(shí)施例2試劑盒特異性試驗(yàn)
[0075] 分別以RH株DNA，PRU株DNA，VEG株DNA，豬等孢球蟲DNA，附紅體DNA，新孢子蟲DNA為 模板，按照試劑盒的反應(yīng)條件進(jìn)行特異熒光定量PCR擴(kuò)增，同時設(shè)空白對照。
[0076] 反應(yīng)體系為：SYBR Green I 10yL，上下游引物各0.4yL，雙蒸水7.2yL，模板DNA 2μ L〇
[0077]熒光定量PCR擴(kuò)增條件為：
[0079]結(jié)果表明：不同蟲株的弓形蟲DNA均出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增，陰性對照及其它DNA均無 擴(kuò)增(圖1)。
[0080] 實(shí)施例3試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線及敏感性分析
[0081] 分別以101()~10*3拷貝/VL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，選擇連 續(xù)5個點(diǎn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2)和標(biāo)準(zhǔn)方程(表1)并分析其敏感性，結(jié)果顯示熒光定量PCR在模 板濃度為1 〇拷貝以下時未見有擴(kuò)增，可得出熒光定量PCR的靈敏度為10個拷貝的靶DNA。 [0082] 表1弓形蟲熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)方程
[0083]
[0084] 注:X = lg(初始模板濃度），CT值為熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時的循環(huán)數(shù)。
[0085]本研究為了更加真實(shí)反映理論上的檢測下限與實(shí)際檢測下限的差距，做了以下技 術(shù)上的改進(jìn):取純化后的弓形蟲RH株速殖子腹腔液，通過鏡檢稀釋成1000，100，50，25，20， 15，10及1個速殖子的8份蟲液，分別混于8份磨碎的豬肉樣品中，然后再分別提取其DNA。 [0086]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10個及1個速殖子的混合樣品檢測不到，其它6份均可檢測到，與理 論計算值有一定的差異，理論值的10個拷貝大體上相當(dāng)于實(shí)際的15個拷貝，結(jié)果貼近實(shí)際， 可信度高。
[0087]實(shí)施例4試劑盒的穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0088]分別以107，106，105，104(： 〇?以8/111的四個濃度梯度的陽性標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行 qPCR，每個梯度重復(fù)3次，計算每次的CT值，求得變異系數(shù)，評價其穩(wěn)定性。
[0089] 結(jié)果顯示其變異系數(shù)CV為0.9%~2.7%，均小于3% (表2)。說明該方法具有良好 的穩(wěn)定性。
[0090] 表2弓形蟲熒光定量PCR穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
[0091]
[0092] 實(shí)施例5試劑盒對臨床樣品的檢測
[0093]分別對廣東惠州、江門和肇慶三個規(guī)?；i場共50份樣品進(jìn)行檢測。從血液中直 接提取DNA，利用本試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示本試劑盒操作簡便，結(jié)果客觀準(zhǔn) 確，可用于臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查。
[0094]表3 50份豬血液臨床檢測結(jié)果
[0096] 注表示弓形蟲核酸陽性；表示弓形蟲核酸陰性。
[0097] 綜上可知，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要有以下幾點(diǎn)：
[0098] 1、本申請的檢測靈敏，理論計算值貼近實(shí)際，可信度高；
[0099] 2、本申請擴(kuò)增的目的片段為112bp，符合理想的qPCR目的片段200bp的長度要求， 且本申請將退火和延伸并為一步，米用2步法，大大縮短檢測時間，提尚效率；
[0100] 3、本申請優(yōu)化反應(yīng)液的各組分濃度比例，將其混合在一起為mix，操作更簡便。
[0101] 因本研究選取弓形蟲高度保守的基因 GRA7的絕對保守片段作為檢測的靶標(biāo)，本領(lǐng) 域技術(shù)人員能夠通過上述以豬為檢測對象應(yīng)用的本檢測技術(shù)，直接推論出本申請的檢測技 術(shù)同樣能夠應(yīng)用于其他中間宿主，而不僅限于檢測豬弓形蟲。
[0102] 以上對本發(fā)明實(shí)施例所提供的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個例 對本發(fā)明實(shí)施例的原理以及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說明只適用于幫助理解本 發(fā)明實(shí)施例的原理；同時，對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，在具體實(shí)施方 式以及應(yīng)用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
【主權(quán)項】
1. 一種弓形蟲巧光定量PCR特異性引物，其特征在于： 包括W下序列： 上游引物 qPCR-F: 5 ' -ACGACAACATCTACGAGGAG-3 '， 下游引物 qPCR-R: 5 ' -GCACCCATACCAACAGC-3 '。2. -種弓形蟲巧光定量PCR特異性檢測試劑盒，其特征在于： 包括弓形蟲巧光定量PCR特異性引物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種弓形蟲巧光定量PCR特異性檢測試劑盒，其特征在于： 所述弓形蟲巧光定量PCR特異性引物的終濃度為lOpmol/化。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種弓形蟲巧光定量PCR特異性檢測試劑盒，其特征在于： 還包括（1 )DNA提取液； (2) 巧光定量PCR反應(yīng)液； (3) 質(zhì)控反應(yīng)液； (4) Spin Columns CB3； (5) Collection Tubes 2ml。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種弓形蟲巧光定量PCR特異性檢測試劑盒，其特征在于： (1 )DNA提取液:為反應(yīng)200次的 Buffer GA 50 mL; Buffer GB 50 inL; Buffer GD 52 mL; Buffei'PW 50 mL ; Buffer TE 60 mL; Proteinase K 4 mL; 無永乙醇 Kh'nL·; (2) 巧光定量PCR反應(yīng)液:為反應(yīng)200次的SYBR Green I試劑、雙蒸水； (3) 質(zhì)控反應(yīng)液:為反應(yīng)200次的陰性對照反應(yīng)液和陽性對照反應(yīng)液。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種弓形蟲巧光定量PCR特異性檢測試劑盒，其特征在于： 所述陰性對照反應(yīng)液為滅菌雙蒸水； 所述陽性對照反應(yīng)液為含有弓形蟲GRA7基因的pMD-18質(zhì)粒。7. -種弓形蟲巧光定量PCR特異性檢測方法，其特征在于： (1) 提取待檢動物DNA; (2) 巧光定量PCR擴(kuò)增，進(jìn)行烙解曲線分析，設(shè)置的擴(kuò)增及溶解參數(shù)如下： 護(hù)增：碩變性 3 min; 變性 ％ C 5 s ; 退火延伸 60.5"C 30 s; 40個循踩； 烙解:60 °C~95 °C，每步升溫rC。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種弓形蟲巧光定量PCR特異性檢測方法，其特征在于： 巧光定量PCR擴(kuò)增體系包括如下： SYB民 GreenI l(),uL; 上下游引物 各0.4 滅菌雙蒸木 7.2軒巳； 模板 DNA 2 μL^。
【文檔編號】C12Q1/68GK105969855SQ201610318797
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】廖昕萌, 袁子國, 謝國清
【申請人】廣州海瀝生物科技有限公司