乳腺癌易感基檢測芯片及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種乳腺癌易感基檢測芯片，包括固體支持物及固定在所述固定支持物上的基因檢測探針；所述基因檢測探針包括24個乳腺癌易感基因的31個SNP位點；24個所述乳腺癌易感基因分別為CHEK2、PALB2、ZNF350、ESR1、C6orf97、USP7、MRPS30、AURKA、ATM、CASC16、TOX3、DNMT1、ZMIZ1、TGFB1、FGFR2、ZNF365、SLC4A7、TNRC9、TNP1、HER2、BRCA2、CCDC170、BRCA1、CYP11A1。本發(fā)明中基因檢測探針包括24個乳腺癌易感基因的31個SNP位點，該位點經(jīng)過文獻論證，具有較高的實用性，可用于疾病的早期診斷和大規(guī)模篩查，并且位點檢出成功率高、技術(shù)重現(xiàn)性好、性價比高，為乳腺癌的診斷、分型、預后判斷提供重要依據(jù)，以實現(xiàn)對疾病的早期診斷。
【專利說明】
乳腺癌易感基檢測芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及檢測乳腺癌領(lǐng)域，尤其涉及一種乳腺癌易感基檢測芯片及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 對常見疾病相關(guān)多種遺傳標識進行早期檢測和系統(tǒng)評估將有助于對疾病的早期 預防、診斷和治療。目前，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量與各種常見疾病相關(guān)的遺傳學標識，然而，由于 缺乏有足夠的靈敏度和可以對多種疾病相關(guān)標識進行廣泛(高通量檢測位點、高通量檢測 樣本)篩查和檢驗的方法，使得這些常見疾病的遺傳學標識無法廣泛應(yīng)用。此外，目前常見 疾病遺傳標識缺乏系統(tǒng)、有效的整合，大大制約了常見疾病早期預防、診斷和治療方面的發(fā) 展?，F(xiàn)有檢測只有單一種疾病或一類疾病的遺傳標識檢測，檢測范圍有限，且某些常見疾病 尚無早期檢測的方法。
[0003] 目前，一些傳統(tǒng)醫(yī)學手段，如組織細胞檢測存在著其固有的缺陷，取材位置不當、 組織細胞標本材料不足或認為經(jīng)驗不足等都將導致乳腺癌誤診。其他技術(shù)例如影響學雖然 已被廣泛應(yīng)用于疾病的檢查和診斷，但其在疾病程度的定性上仍存在著很大的局限性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種乳腺癌易感基檢測芯片及其制備方法，能夠 解決檢查診斷準確率高的技術(shù)問題。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] -種乳腺癌易感基檢測芯片，包括固體支持物及固定在所述固定支持物上的基因 檢測探針;所述基因檢測探針包括24個乳腺癌易感基因的31個SNP位點；24個所述乳腺癌易 感基因分別為 CHEK2、PALB2、ZNF350、ESRl、C6orf97、USP7、MRPS30、AURKA、ATM、CASC16、 T0X3、·ΜΤ1、ZMIZ1、TGFB1、FGFR2、ZNF36 5、SLC4A7、TNRC9、TNP1、HER2、BRCA2、CCDC170、 BRCAUCYP11A1；
[0007] 所述 CHEK2 的 SNP 位點為 rsl7879961;
[0008] 所述 PALB2 的 SNP 位點為 rs249954、rsl20963 和 rsl6940342;
[0009] 所述 ZNF350 的 SNP 位點為 rs4986773;
[0010] 所述 ESR1 的 SNP 位點為 rs2046210;
[0011] 所述C6orf97的 SNP位點為rs3757318;
[0012] 所述 USP7 的 SNP 位點為 rs2304467 和 rsl2924995;
[0013] 所述 MRPS30 的 SNP 位點為 rsl0941679;
[0014] 所述 AURKA 的 SNP 位點為 rs2273535;
[0015] 所述 ATM 的 SNP 位點為 rs100 3623;
[0016] 所述 CASC16 的 SNP 位點為 rs4784227;
[0017] 所述 T0X3 的 SNP 位點為 rs8051542;
[0018] 所述 DNMT1 的 SNP 位點為 rsl6999593;
[0019] 所述 ZMIZ1 的 SNP 位點為 rsl250009;
[0020] 所述 TGFB1 的 SNP 位點為 rsl982073;
[0021] 所述 FGFR2的 SNP位點為rs 1219648;
[0022] 所述 ZNF365 的 SNP 位點為 rsl0822013;
[0023] 所述 SLC4A7 的 SNP 位點為 rs4973768;
[0024] 所述 TNRC9 的 SNP 位點為 rs3803662;
[0025] 所述 TNP1 的 SNP 位點為 rsl3387042;
[0026] 所述 HER2 的 SNP 位點為 rsll36201;
[0027] 所述 BRCA2 的 SNP 位點為 rs206116 和 rsl44848;
[0028] 所述 CCDC170 的 SNP 位點為 rs9383935;
[0029] 所述 BRCA1 的 SNP 位點為 rs80357887、rs80357272、rs80357546 和 rs80357086;
[0030] 所述 CYP11A1 的 SNP 位點為 rs2279357。
[0031 ]優(yōu)選地，所述固體支持物為載玻片、硅片、膜或高分子材料。
[0032]本發(fā)明還提供了上述乳腺癌易感基檢測芯片的制作方法，包括以下步驟：
[0033] 1)在含有DNA的組織或細胞樣本中并加入蛋白酶鹽酸胍，渦旋、離心，得到含有DNA 分子的上層清液；
[0034] 2)在PCR反應(yīng)液中加入步驟1)得到含有DNA分子的上層清液，進行擴增，得到擴增 產(chǎn)物；
[0035] 3)將步驟2)得到的擴增產(chǎn)物依次進行堿性磷酸酶處理、單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)結(jié) 束后進行樹脂純化；
[0036] 4)將步驟3)得到樹脂純化的延伸產(chǎn)物在固體支持物上進行點樣，得到乳腺癌易感 基檢測芯片。
[0037]優(yōu)選地，所述含有DNA的組織或細胞樣本為口腔拭子或全血。
[0038]從上述技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明一種乳腺癌易感基檢測芯片，基因檢測探針包 括24個乳腺癌易感基因的31個SNP位點，該位點經(jīng)過文獻論證，具有較高的實用性，可用于 疾病的早期診斷和大規(guī)模篩查，并且位點檢查正確率高、技術(shù)重現(xiàn)性好、性價比高，為乳腺 癌的診斷、分型、預后判斷提供重要依據(jù)，以實現(xiàn)對疾病的早期診斷。
【具體實施方式】
[0039]為了進一步了解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案進行描述，但 是應(yīng)當理解，這些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點而不是對本發(fā)明專利要求的 限制。
[0040]本發(fā)明提供的一種乳腺癌易感基檢測芯片，包括固體支持物及固定在所述固定支 持物上的基因檢測探針;所述基因檢測探針包括24個乳腺癌易感基因的31個SNP位點；24個 所述乳腺癌易感基因分別為 CHEK2、PALB2、ZNF350、ESRl、C6orf97、USP7、MRPS30、AURKA、 ATM、CASC16、T0X3、DNMT1、ZMIZ1、TGFB1、FGFR2、ZNF365、SLC4A7、TNRC9、TNP1、HER2、BRCA2、 CCDC170、BRCA1、CYP11A1;
[0041 ]所述 CHEK2 的 SNP 位點為 rsl7879961;
[0042] 所述 PALB2 的 SNP 位點為 rs249954、rsl20963 和 rsl6940342;
[0043] 所述 ZNF350 的 SNP 位點為 rs4986773;
[0044] 所述 ESR1 的 SNP 位點為 rs2046210;
[0045] 所述C6orf97的 SNP位點為rs3757318;
[0046] 所述 USP7 的 SNP 位點為 rs2304467 和 rsl2924995;
[0047] 所述 MRPS30 的 SNP 位點為 rsl0941679;
[0048] 所述 AURKA 的 SNP 位點為 rs2273535;
[0049] 所述 ATM 的 SNP 位點為 rs100 3623;
[0050] 所述 CASC16 的 SNP 位點為 rs4784227;
[0051 ]所述 T0X3 的 SNP 位點為 rs8051542;
[0052] 所述 DNMT1 的 SNP 位點為 rsl6999593;
[0053] 所述 ZMIZ1 的 SNP 位點為 rsl250009;
[0054] 所述 TGFB1 的 SNP 位點為 rsl982073;
[0055] 所述 FGFR2 的 SNP位點為r s 1219648;
[0056] 所述 ZNF365 的 SNP 位點為 rsl0822013;
[0057] 所述 SLC4A7 的 SNP 位點為 rs4973768;
[0058] 所述 TNRC9 的 SNP 位點為 rs3803662;
[0059] 所述 TNP1 的 SNP 位點為 rsl3387042;
[0060] 所述 HER2 的 SNP 位點為 rsll36201;
[0061 ]所述 BRCA2 的 SNP 位點為 rs206116 和 rsl44848;
[0062] 所述 CCDC170 的 SNP 位點為 rs9383935;
[0063] 所述 BRCA1 的 SNP 位點為 rs80357887、rs80357272、rs80357546 和 rs80357086;
[0064] 所述 CYP11A1 的 SNP 位點為 rs2279357。
[0065] 本發(fā)明選擇檢測的遺傳標識是SNP，SNP即單核苷酸多態(tài)性;是單個核苷酸突變而 導致的核酸序列多態(tài)性。SNP在人類基因組中的分布相當廣泛，大約平均每1000個堿基就有 1個SNP，總數(shù)達到300萬個左右。由于SNP密度很高，數(shù)量眾多，可進行自動化的大規(guī)模檢測， 所以它是很好的遺傳標識。本發(fā)明篩選的24個乳腺癌易感基因的31個SNP位點，具有較高的 實用價值，可以為乳腺癌的診斷、分型、預后判斷提供重要依據(jù)，且位點檢出成功率高、技術(shù) 重現(xiàn)性好。
[0066] 固體支持物經(jīng)過醛基化修飾，每個基因檢測探針在合成時加上氨基化修飾，通過 氨基和醛基的結(jié)合將基因檢測探針固定在固體支持物上;其中固體支持物為載玻片、硅片、 膜或高分子材料。
[0067] 本發(fā)明提供了一種乳腺癌易感基檢測芯片的制作方法，包括以下步驟：
[0068] 1)在含有DNA的組織或細胞樣本中并加入蛋白酶緩沖液，渦旋、離心，得到含有DNA 分子的上層清液；
[0069] 2)在PCR反應(yīng)液中加入步驟1)得到含有DNA分子的上層清液，進行擴增，得到擴增 產(chǎn)物；
[0070] 3)將步驟2)得到的擴增產(chǎn)物依次進行堿性磷酸酶處理、單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)結(jié) 束后進行樹脂純化；
[0071] 4)將步驟3)得到樹脂純化的延伸產(chǎn)物在固體支持物上進行點樣，得到乳腺癌易感 基檢測芯片。
[0072]上述方案制作的乳腺癌易感基檢測芯片，儲存著24個乳腺癌易感基因的31個SNP 位點；24個乳腺癌易感基因分別為CHEK2、PALB2、ZNF350、ESRl、C6orf97、USP7、MRPS30、 AURKA、ATM、CASC16、T0X3、DNMT1、ZMIZ1、TGFB1、FGFR2、ZNF365、SLC4A7、TNRC9、TNP1、HER2、 BRCA2、CCDC170、BRCA1、CYP11A1 ;CHEK2 的 SNP 位點為 rsl7879961 ;PALB2 的 SNP 位點為 rs249954、rsl20963 和 18 16940342;2冊350的5即位點為184986773$51?1的5即位點為 rs2046210;C6orf97 的 SNP 位點為 rs3757318;USP7 的 SNP 位點為 rs2304467 和 rsl2924995; 1〇^530的5即位點為^10941679^1^1^的5即位點為^2273535 ^了]\1的5即位點為 rs100 3623;CASC16 的 SNP 位點為 rs4784227;T0X3 的 SNP 位點為 rs8051542;DM\m 的 SNP 位點 為 rsl6999593;ZMIZl 的 SNP 位點為 rsl250009;TGFBl 的 SNP 位點為 rsl982073;FGFR2 的 SNP 位 點為 rsl219648;ZNF365 的 SNP 位點為 rsl0822013;SLC4A7 的 SNP 位點為 rs4973768;TNRC9 的 SNP 位點為 rs3803662;TNPl 的 SNP 位點為 rsl3387042;HER2 的 SNP 位點為 rsll36201;BRCA2 的 SNP 位點為 rs206116 和 rsl44848;CCDC170 的 SNP 位點為 rs9383935;BRCAl 的 SNP 位點為 rs80357887、rs80357272、rs80357546 和 ^80357086<￥?1認1的5陬位點為^2279357。該方 法可快速、靈敏地檢測乳腺癌易感基因 SNP位點信息，檢測相關(guān)乳腺癌易感基因 SNP位點突 變情況，分析受試者乳腺癌發(fā)生風險，以實現(xiàn)對疾病的早期診斷。
[0073]在本發(fā)明的實施例中，含有DNA的組織或細胞樣本為口腔拭子或全血。
[0074] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明：
[0075] 1、DNA 的提取
[0076] 1 · 1 口腔拭子DNA提取
[0077] 1)將口腔拭子放在2ml離心管中，加入400μ1 PBS。
[0078] 2)加入20μ1 QIAGEN Protease和400μ1 Buffer AL。立即渦旋 15s混勻。為了保證 有效的裂解，樣品和Buffer AL必須立即并充分混合。
[0079] 3)56°C 孵育 lOmin。短暫離心。
[0080] 4)加入400μ1乙醇(96-100% )到樣品中，渦旋混勻。短暫離心以使管蓋上無液體。 [0081 ] 5)將液體轉(zhuǎn)移至離心柱，8000rpm(6000 X g)離心lmin。
[0082] 6)柱子放入新的2mlEP管（試劑盒提供），加500μ1 Buffer AW1，8000rpm離心lmin， 棄EP管和廢液。
[0083] 7)柱子放入新的2mlEP管（試劑盒提供），加500μ1 Buffer AW2，14000rpm(20,000 Xg)離心3min，丟棄EP管和廢液。
[0084] 8)將柱子放入新的2mlEP管，14000rpm空管離心lmin，丟棄EP管。
[0085] 9)將柱子放入新的1.5mlEP管，加120μ1 Buffer AE，室溫孵育5min，8000rpm離心 lmin，-2CTC 保存。
[0086] 1.2全血DNA提取
[0087] 1)向1.5ml EP管中加入20μ1 QIAGEN Protease。
[0088] 2)向管中加200μ1全血樣品。注:先加入酶的目的是保證酶與血液的混勻。
[0089] 3)加 200μ1 Buffer AL，渦旋混勻 15s。
[0090] 4)56°C孵育lOmin，短暫離心。注:延長孵育時間不能增加產(chǎn)量或提高質(zhì)量。
[0091] 5)加入200μ1無水乙醇，渦旋15s后，短暫離心以使管蓋上無液體。
[0092] 6)繼續(xù)口腔拭子5~10步驟。
[0093] 2、PCR 擴增
[0094] 2.1在一個新的1.5mlEP管中配制PCR擴增反應(yīng)體系 「00951
[0096]以上試劑混勻后每孔各加2μ1。
[0097] 2.2 每孔依次加入DNA 10ng/ul 1μ1，0·25ιιΜ Primer Mix 2μ1，總體積5μ1。
[0098] 2.3在兼容96孔板的？0?儀上設(shè)定?0?反應(yīng)條件為:941€41^11，94 1€2〇8,561€3〇1^11， 72°(：111^11，45個循環(huán);721€31^11;4°(：保持。將96孔?0?反應(yīng)板放置于?0?儀上，啟動?0?反應(yīng)。
[0099] 3、PCR產(chǎn)物堿性磷酸酶處理
[0100] 3.1 在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR 產(chǎn)物用SAP (shrimp alkaline phosphatase，4下喊性 磷酸酶)處理，以去除體系中游離的dNTPs。
[0101] 3.2配制堿性磷酸酶處理反應(yīng)體系
[0102]
[0103]以上試劑混勻后每孔加2μ1
[0104] 3 · 3在兼容96孔板的PCR儀上，設(shè)定PCR反應(yīng)條件:37°C40min; 85°C5min; 4°C保持， 啟動PCR儀進行堿性磷酸酶處理。
[0105] 4單堿基延伸
[0106] 4.1在堿性磷酸酶處理結(jié)束后，進行單堿基延伸反應(yīng)。
[0107] 4.2配制單堿基延伸反應(yīng)體系
[0108]
[0109] 以上試劑混勻后每孔加1·06μ1
[0110] 4.3 每孔加入iPLEX Extend Primer Mix 0·94μ1，總體積9μ1 〇
[0111] 4 · 4 在兼容96孔板的PCR儀上，設(shè)定PCR反應(yīng)條件:94°C30s，94°C 5s，52°C 5s，80°C 5s; 52°C5s，80°C5s 4個循環(huán)；94°C5s，52°C5s，80°C5s 39個循環(huán)；72°C3min; 4°C維持。啟動 PCR儀進行單堿基延伸反應(yīng)。
[0112] 5、樹脂純化
[0113] 5.1將Clean Resin樹脂平鋪到6mg的樹脂板中；
[0114] 5.2加 16μ1水到延伸產(chǎn)物的對應(yīng)孔內(nèi)；
[0115] 5.3將干燥后的樹脂倒入延伸產(chǎn)物板中，封膜，低速垂直旋轉(zhuǎn)15min，使樹脂與反 應(yīng)物充分接觸；
[0116] 5.4 3000rpm 5min離心使樹脂沉入孔底部。
[0117] 6、芯片點樣
[0118] 啟動MassARRAY Nanodispenser RS1000點樣儀，將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至96 孔固體支持物上，制作出芯片。
[0119] 7、質(zhì)譜檢測
[0120] 將芯片使用MALDI-TOF(matrix_assisted laser desorption/ionization-time of f 1 igh，基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜）分析，檢測結(jié)果使用TYPER4.0軟件 (sequenom)分型并輸出結(jié)果，分析受試者乳腺癌發(fā)生風險，以實現(xiàn)對疾病的早期診斷。
[0121] 以上對本發(fā)明提供的一種乳腺癌易感基檢測芯片及其制作方法進行了詳細的介 紹，本文中應(yīng)用了具體個例對本發(fā)明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只 是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修 飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種乳腺癌易感基檢測芯片，其特征在于，包括固體支持物及固定在所述固定支持 物上的基因檢測探針;所述基因檢測探針包括24個乳腺癌易感基因的31個SNP位點；24個所 述乳腺癌易感基因分別為 CHEK2、PALB2、ZNF350、ESRl、C6orf97、USP7、MRPS30、AURKA、ATM、 CASC16、T0X3、DMm、ZMIZl、TGFBl、FGFR2、ZNF365、SLC4A7、TNRC9、TNPl、HER2、BRCA2、 CCDC170、BRCA1、CYP11A1; 所述 CHEK2 的 SNP 位點為 rsl7879961; 所述 PALB2 的 SNP 位點為 rs249954、rsl20963 和 rsl6940342; 所述 ZNF350 的 SNP 位點為 rs4986773; 所述ESR1的SNP位點為rs2046210; 所述 C6orf97 的 SNP 位點為 rs3757318; 所述 USP7 的 SNP 位點為 rs2304467 和 rsl2924995; 所述 MRPS30 的 SNP 位點為 rsl0941679; 所述AURKA的SNP位點為rs2273535; 所述ATM的SNP位點為rs100 3623; 所述 CASC16 的 SNP 位點為 rs4784227; 所述T0X3的SNP位點為rs8051542; 所述 DNMT1 的 SNP 位點為 rsl6999593; 所述ZMIZ1的SNP位點為r s 1250009; 所述TGFB1的SNP位點為rsl982073; 所述FGFR2的SNP位點為r s 1219648; 所述 ZNF365 的 SNP 位點為 rsl0822013; 所述 SLC4A7 的 SNP 位點為 rs4973768; 所述TNRC9的SNP位點為rs3803662; 所述TNP1的SNP位點為rsl3387042; 所述HER2的SNP位點為rsll36201; 所述 BRCA2 的 SNP 位點為 rs206116 和 rsl44848; 所述 CCDC170 的 SNP 位點為 rs9383935; 所述 BRCA1 的 SNP 位點為 rs80357887、rs80357272、rs80357546 和 rs80357086; 所述 CYP11A1 的 SNP 位點為 rs2279357。2. 如權(quán)利要求1所述的乳腺癌易感基檢測芯片，其特征在于，所述固體支持物為載玻 片、硅片、膜或高分子材料。3. -種如權(quán)利要求1~2任一項所述的乳腺癌易感基檢測芯片的制作方法，其特征在 于，包括以下步驟： 1) 在含有DNA的組織或細胞樣本中并加入蛋白酶鹽酸胍，渦旋、離心，得到含有DNA分子 的上層清液； 2) 在PCR反應(yīng)液中加入步驟1)得到含有DNA分子的上層清液，進行擴增，得到擴增產(chǎn)物； 3) 將步驟2)得到的擴增產(chǎn)物依次進行堿性磷酸酶處理、單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后 進行樹脂純化； 4) 將步驟3)得到樹脂純化的延伸產(chǎn)物在固體支持物上進行點樣，得到乳腺癌易感基檢 測芯片。4.如權(quán)利要求3所述的制作方法，其特征在于，所述含有DNA的組織或細胞樣本為口腔 拭子或全血。
【文檔編號】C12Q1/68GK105969859SQ201610323117
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】張核子
【申請人】深圳市核子基因科技有限公司