一種肉類成分四重pcr的檢測方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肉類成分四重PCR的檢測方法及應(yīng)用。該檢測方法具體為：依據(jù)豬、牛、羊、狗、鴨特異基因序列，自設(shè)引物，根據(jù)引物擴(kuò)增的目標(biāo)長度，合理選擇引物組合模式，建立四重PCR方法；檢測各組引物有無擴(kuò)增反應(yīng)且擴(kuò)增產(chǎn)物是否為特異性四個(gè)條帶；若為四個(gè)條帶，檢測是否符合設(shè)計(jì)目標(biāo)長度；PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)束后，置紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照保存結(jié)果。對71份市售不同類型肉類食品的檢測結(jié)果表明，本研究所建立的多種肉類成分多重PCR方法檢測體系，適用于多種動(dòng)物組織樣本、涮肉片及調(diào)理生肉制品、鹵肉制品、火腿腸類樣本中肉類成分的鑒別檢驗(yàn)，適用范圍廣，可靠性高。
【專利說明】
一種肉類成分四重PCR的檢測方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種肉類成分四重PCR的檢測方法及應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生活水平的提高，人們對動(dòng)物源性產(chǎn)品質(zhì)量的安全意識也在不斷增強(qiáng)。北京 作為全國的政治文化中心和大型消費(fèi)性城市，動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品安全不僅關(guān)系到人民群眾的 身體健康和生命安全，而且直接影響著首都的形象和我國的國際聲譽(yù)。動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督作為 國家動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督和管理部門，依照法律和法規(guī)要求，對動(dòng)物防疫及動(dòng)物產(chǎn)品安全實(shí)施監(jiān) 督檢查和管理的活動(dòng)，是一種政府管理的行政行為，目的在于發(fā)現(xiàn)、制止、糾正、處理違法行 為。因此，建立簡潔、快速、有效且適應(yīng)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督工作實(shí)際的快速鑒別檢驗(yàn)技術(shù)，將有利 于對食品進(jìn)行動(dòng)物源性成分鑒定，對加工肉制品的質(zhì)量進(jìn)行把關(guān)，有利于維護(hù)消費(fèi)者利益， 保障人民生命安全，為打擊此類違法行為提供有力技術(shù)支撐，也有利于肉類及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的 健康發(fā)展。同時(shí)鑒別動(dòng)物源性成分對于解決某些因食品問題引起的民族矛盾和糾紛都十分 重要。
[0003] 當(dāng)前，北京地區(qū)乃至全國動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督管理實(shí)際中動(dòng)物源性成份的檢測僅可依靠 傳統(tǒng)感官鑒別，存在無法準(zhǔn)確判定其實(shí)際成份的迫切需要和關(guān)鍵性技術(shù)問題。本研究針對 當(dāng)前北京地區(qū)某些市場上動(dòng)物產(chǎn)品交易過程中以次充好、存在欺詐的現(xiàn)象，將著眼點(diǎn)放在 動(dòng)物源性肉類食品快速鑒別檢驗(yàn)方法的建立和應(yīng)用上，以豬肉、羊肉、牛肉、狗肉等動(dòng)物源 性肉類食品為研究對象，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)，研究采用PCR特異性擴(kuò)增檢測手段，建立簡 潔、快速、有效且適應(yīng)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督工作實(shí)際的動(dòng)物源性肉類食品快速鑒別檢驗(yàn)方法。研究 成果將為動(dòng)物源性食品安全保障和質(zhì)量監(jiān)督提供有力技術(shù)支撐，具有一定市場推廣應(yīng)用價(jià) 值。對保障廣大人民群眾的身體健康和生活質(zhì)量，維護(hù)社會穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有積極作用。
[0004] 形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)鑒定方法是以動(dòng)物肉、骨骼、淋巴結(jié)的外剖形態(tài)特征為基礎(chǔ)，通過 觀察動(dòng)物肌肉色澤、嫩度、肌纖維形狀;脂肪的色澤、肌間脂肪分布；固有氣味;骨骼、淋巴結(jié) 解剖特征等對動(dòng)物肉類品種進(jìn)行鑒別區(qū)分。理化學(xué)鑒定則主要包括脂肪熔點(diǎn)的測定、糖原 測定反應(yīng);作為動(dòng)物源性肉市場交易環(huán)節(jié)中重要的鑒別方法，形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)及理化鑒定簡 便、易行，檢測成本低。但是，形態(tài)學(xué)及解剖學(xué)鑒定主要依靠檢測人員實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的積累，判定 指標(biāo)模糊，對于凍肉等經(jīng)初加工的動(dòng)物源性肉類憑感官鑒別確認(rèn)難度較大。
[0005] 以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的檢測方法主要有:免疫學(xué)方法和電泳學(xué)方法。免疫學(xué)技術(shù)是以 抗原和抗體特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，再輔以免疫放大技術(shù)來鑒別動(dòng)物源性成分種類的方 法。
[0006] 酶聯(lián)免疫的原理是抗體與抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，將酶分子與抗體分子結(jié)合形成酶標(biāo) 記分子。當(dāng)它與固相免疫吸附劑中相應(yīng)的抗原或抗體、或抗原抗體結(jié)合物相遇時(shí)形成酶抗 原抗體結(jié)合物，加入酶底物，結(jié)合物中的酶水解底物，生成有色的反應(yīng)物，根據(jù)顏色的深淺 進(jìn)行判斷。利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性，進(jìn)行成分的鑒別和血清學(xué)分型。目前商業(yè)使用的 ELISA檢測試劑盒主要用于肉類食品檢驗(yàn)，利用肉類在熱處理過程中具有熱穩(wěn)定性的肌鈣 蛋白I(Tnl)作為區(qū)分動(dòng)物種類的標(biāo)記蛋白，從而可以區(qū)分蛋白來源，在肉類原料來源鑒別 具有很好的效果。免疫技術(shù)簡單、方便而且能夠?qū)ξ⒘康牡鞍走M(jìn)行檢測，ELISA需要分離品 種特異性的蛋白，但品種接近的蛋白間能夠發(fā)生交叉反應(yīng)，甚至其它品種的微量蛋白常常 能夠掩蓋品種特異性的條帶，因此會產(chǎn)生假陽性結(jié)果。從20世紀(jì)90年代末至今，大量研究報(bào) 道了應(yīng)用免疫學(xué)方法對各種動(dòng)物源性成分的鑒定技術(shù)，相應(yīng)的酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑 盒與免疫層析試紙條也已面世。商品化的ELISA試劑盒與免疫層析試紙條等免疫學(xué)鑒定技 術(shù)具有檢測時(shí)間短、操作簡便等優(yōu)勢，但同時(shí)也存在著特異性較低、受樣品基質(zhì)影響大的局 限。目前，尚未有一種商品化的免疫種屬鑒定方法通過美國FDA或AOAC等權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)證。
[0007] 除免疫學(xué)方法外，根據(jù)蛋白質(zhì)分布特征區(qū)分動(dòng)物種屬是動(dòng)物源性肉本質(zhì)鑒別的另 一思路。利用高效液相色譜(HPLC)法檢測檢測脊椎動(dòng)物組織中天然含有的組氨酸二肽、肌 肽、鵝肌肽和蛇肉肽的分布特征，可有效地對反芻動(dòng)物來源的肉制品進(jìn)行鑒定。此外，通過 十二磺基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、毛細(xì)管凝膠電泳(CE)和等電聚焦電泳 (IEF)等電泳技術(shù)對肉制品提取物中的蛋白質(zhì)分布特征進(jìn)行定性、定量分析，從而鑒別肉類 的方法也屢見報(bào)道。然而，動(dòng)物源性肉中蛋白質(zhì)含量變化范圍廣、干擾因素多，導(dǎo)致此類技 術(shù)準(zhǔn)確度低，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)化與推廣應(yīng)用的前景均受到很大局限。
[0008] 分子生物學(xué)方法主要是利用DNA分析技術(shù)，根據(jù)基因組中的DNA序列來確定物種， 并且對于經(jīng)過熱加工的食品仍能很好地區(qū)分動(dòng)物來源。DNA的熱穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性均優(yōu) 于蛋白質(zhì)，以動(dòng)物種屬間遺傳信息的差異作為物種鑒別的檢測靶點(diǎn)具有特異性高、方法便 捷、不受組織類別限制等諸多優(yōu)勢，已逐漸成為食品中肉類成分鑒別的主流方法。以檢測 DNA為基礎(chǔ)的方法主要有:核酸探針雜交、限制性片段長度多態(tài)性擴(kuò)增(PCR-RPLF)、DNA指紋 分析、PCR特異擴(kuò)增。近十多年來，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)的迅速發(fā)展為物種鑒別開辟了 新的途徑，逐步成為動(dòng)物源性肉類種屬鑒定的核心方法。其基本的實(shí)驗(yàn)思路為:根據(jù)不同物 種細(xì)胞或線粒體基因組序列中的特征位點(diǎn)設(shè)計(jì)物種特異性引物，利用PCR反應(yīng)實(shí)現(xiàn)食品中 目標(biāo)基因片段的指數(shù)級擴(kuò)增，繼而通過電泳或熒光檢測鑒別食品中可能的物種來源。相較 其他分析方法，PCR特異擴(kuò)增法操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，因此在實(shí)際檢測工作中應(yīng)用最為 廣泛。但由于動(dòng)物源性肉中DNA成分復(fù)雜，加之PCR技術(shù)的高靈敏度，使得應(yīng)用PCR擴(kuò)增方法 來鑒定物種具有因非特異性擴(kuò)增而產(chǎn)生假陽性結(jié)果的缺點(diǎn)。此外，對于未知基因序列的物 種，也難以應(yīng)用上述的常規(guī)思路設(shè)計(jì)PCR鑒定流程。因此，以PCR為基礎(chǔ)、應(yīng)用改良的引物設(shè) 計(jì)策略或新型驗(yàn)證手段的鑒定方法已逐步成為了動(dòng)物源性肉定性鑒別的新方向。
[0009]近紅外方法(Near infrared spectroscopic method，NIBS)在飼料工業(yè)中廣泛地 用于飼料的質(zhì)量控制分析，如對水分、蛋白、脂肪、灰分、糖、淀粉、纖維等的測定。該方法的 原理是組成分析樣品中的分子在不同電磁波的吸收不同。近紅外方法的優(yōu)點(diǎn)是快捷，使用 中無有害物質(zhì)，樣品用量少，具有良好的可重復(fù)性。Murray等采用NIRS方法檢測了含有3 %、 6%、9%肉骨粉的90種魚粉，該項(xiàng)結(jié)果表明，NIRS能夠區(qū)分出來自于兩種不同動(dòng)物的動(dòng)物蛋 白。但該方法的最大缺點(diǎn)是非直接的，因此需要大量具有權(quán)威性的標(biāo)準(zhǔn)樣品以形成標(biāo)準(zhǔn)或 判別模式。
[0010]超聲波技術(shù)、電特性技術(shù)、光譜分析技術(shù)等是根據(jù)不同的工作原理對肉品質(zhì)指標(biāo) 進(jìn)行檢測的，均具有無損、快速、實(shí)時(shí)、在線檢測的能力，對它們的研究、開發(fā)、應(yīng)用，能夠極 大地提高對肉類品質(zhì)檢測的準(zhǔn)確度、效率、可靠性，節(jié)約成本，具有很大的實(shí)用推廣價(jià)值和 廣闊的應(yīng)用前景。但隨著對這些技術(shù)的深入研究發(fā)現(xiàn)，上述各種檢測技術(shù)在所檢測具體肉 品質(zhì)各指標(biāo)的能力上也是各有優(yōu)劣，它們往往僅對肉類品質(zhì)某一兩項(xiàng)指標(biāo)有較好的預(yù)測判 別能力，對多種信息綜合指標(biāo)的評價(jià)能力還是不足的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 鑒于此，本發(fā)明針對上述的問題，提供了一種肉類成分四重PCR的檢測方法及應(yīng) 用，本方案以現(xiàn)實(shí)應(yīng)用為目標(biāo)，建立準(zhǔn)確、快速的多種肉類成分四重PCR檢測技術(shù)。
[0012] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種肉類成分四重PCR的檢測方法，包括以 下步驟：
[0013] 1)依據(jù)豬、牛、羊、狗、鴨基因序列，自設(shè)可擴(kuò)增的特異性條帶引物，根據(jù)引物設(shè)計(jì) 擬擴(kuò)增目標(biāo)長度，合理選擇引物組合模式，建立四重PCR方法;檢測各組引物有無擴(kuò)增反應(yīng)， 且擴(kuò)增產(chǎn)物是否為特異性四個(gè)條帶;若為四個(gè)條帶，檢測是否符合設(shè)計(jì)目標(biāo)長度；
[0014] 2)取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5yL，用2%瓊脂糖凝膠電泳20min，電壓180V，置紫外凝膠成像系 統(tǒng)中觀察并拍照保存結(jié)果。
[0015] 進(jìn)一步地，該肉類成分四重PCR的檢測方法具體是指豬、牛、羊、狗四重PCR的檢測 方法，或者，豬、鴨、牛、狗四重PCR的檢測方法，或者，豬、牛、羊、鴨四重PCR的檢測方法。
[0016] 進(jìn)一步地，PCR反應(yīng)體系如下：ddH20 9yL，2XEasyTaq PCR super Mix 25yL，上游 引物lyL X 4，下游引物lyL X 4，組織DNA模板2yL X 4，總體積50yL。
[0017] 進(jìn)一步地，PCR反應(yīng)條件如下：94°C預(yù)變性4min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C 延伸35s，共35個(gè)循環(huán);72°C終末延伸lOmin。
[0018] 進(jìn)一步地，豬、牛、羊、狗四重PCR的檢測方法采用的引物組合為：上游引物如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:19所示，下游引物如SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:20所示；或者，上游引物如SEQ ID N0:3、SEQ ID NO: 9、 SEQIDN0:11、SEQIDN0:17所示，下游引物如SEQIDN0:5、SEQIDN0 :10、SEQID N0:15、SEQ ID N0:20所示。
[0019] 進(jìn)一步地，豬、鴨、牛、狗四重PCR的檢測方法采用的引物組合為：上游引物如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:19所示，下游引物如SEQ ID N0:5、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:20所示；或者，上游引物如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO: 27、SEQIDN0:6、SEQIDN0:19所示，下游引物如SEQIDN0 :5、SEQIDN0:30、SEQIDN0: 10、 SEQ ID NO :20所示。
[0020] 進(jìn)一步地，豬、牛、羊、鴨四重PCR的檢測方法采用的引物組合為：上游引物如SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:27所示，下游引物如SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:30所示。
[0021] 本發(fā)明還公開了一種由上述的肉類成分四重PCR的檢測方法在多種動(dòng)物組織樣 本、涮肉片及調(diào)理生肉制品、鹵肉制品、火腿腸類樣本中肉類成分的鑒別檢驗(yàn)中的應(yīng)用。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：
[0023] 1)建立了豬、牛、羊、狗四重PCR方法;豬、鴨、牛、狗四重PCR方法，進(jìn)一步完善了多 種肉類成分多重PCR方法檢測體系。
[0024] 2)對71份市售不同類型肉類食品的檢測結(jié)果表明，本研究所建立的方法-多種肉 類成分多重PCR方法檢測體系，適用于多種動(dòng)物組織樣本、涮肉片及調(diào)理生肉制品、鹵肉制 品、火腿腸類樣本中肉類成分的鑒別檢驗(yàn)，適用范圍廣、可靠性高。
[0025] 3)應(yīng)用建立的豬、牛、羊、狗四重PCR方法對市售71份實(shí)際樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯 示，市售食品中動(dòng)物組織樣本、鹵肉制品未見摻假情況，合格率100%;肉類摻假情況多發(fā)生 于涮肉片及調(diào)理生肉制品，摻假率為28.6%;火腿類制品與標(biāo)識不符的情況突出，不合格率 為 69.6%。
[0026] 當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。
【附圖說明】
[0027] 此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā) 明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中： [0028] 圖1是本發(fā)明豬、牛、羊、狗的四重PCR特異性試驗(yàn);其中，M:100bp DNA Ladder;2、 7、12、17:豬；3、8、13、18:牛;4、9、14、19:羊；5、10、15、20:狗；1、6、11、16:豬+牛+羊+狗；
[0029] 圖2是本發(fā)明豬、鴨、牛、狗的四重PCR特異性試驗(yàn);其中，M:100bp DNA Ladder;2、 7、12:豬;3、8、13:鴨;4、9、14:牛;5、10、15:狗；1、6、11:豬+鴨+牛+狗；
[0030] 圖3是本發(fā)明豬、牛、羊、鴨的四重PCR特異性試驗(yàn);其中，M: 100bp DNALadder; 2、7、 12、17:豬;3、8、13、18:牛;4、9、14、19:羊；5、10、15、20:鴨；1、6、11、16:豬+牛+羊+鴨；
[0031] 圖4是本發(fā)明豬、牛、羊、狗四重PCR特異性的試驗(yàn);其中，M:100bp DNA Ladder;l: 豬+牛+羊+狗;2:豬;3:牛;4:羊;5:狗;6:鴨;7:雞；10:陰性對照；ll:0.1ygAiL;12:0.01ygAi L; 13:0 · 00 1μg/μL; 14:1 X 10-Vg/yL; 15:1 X 10-5yg/yL; 16:1 X 10-6yg/yL; 17:1 X 10-7yg/y L; 18:1 X 10-8yg/yL; 19:1 X 10-9yg/yL; 20: H20(陰性對照）；
[0032] 圖5是本發(fā)明豬、鴨、牛、狗四重PCR特異性的試驗(yàn);其中，M:100bp DNA Ladder;l: 豬+鴨+牛+狗;2:豬;3:鴨;4:牛;5:狗;6:羊;7:雞；10:陰性對照；ll:0.1ygAiL;12:0.01ygAi L; 13:0 · 00 1μg/μL; 14:1 X 10-Vg/yL; 15:1 X 10-5yg/yL; 16:1 X 10-*VgAiL; 17:1 X 10-7yg/yL; 18:1 X 10-8yg/yL; 19:1 X 10-9yg/yL; 20: H20 (陰性對照）；
[0033]圖6是本發(fā)明樣本的豬、鴨、牛、狗四重PCR鑒別檢驗(yàn)試驗(yàn)(a);其中，M:100bp DNA Ladder; 1-21:實(shí)際檢測樣本；
[0034]圖7是本發(fā)明樣本的豬、鴨、牛、狗四重PCR鑒別檢驗(yàn)試驗(yàn)（b);其中，M:100bp DNA Ladder; 36-55:實(shí)際檢測樣本;P:陽性對照;N:陰性對照；
[0035]圖8是本發(fā)明樣本的豬、鴨、牛、狗四重PCR鑒別檢驗(yàn)試驗(yàn)(a);其中，M:100bp DNA Ladder; 22-33是實(shí)際檢測樣本；
[0036] 圖9是本發(fā)明樣本的豬、鴨、牛、狗四重PCR鑒別檢驗(yàn)試驗(yàn)（b);其中，M:100bp DNA Ladder;56-71實(shí)際檢測樣本;P:陽性對照;N:陰性對照。
【具體實(shí)施方式】
[0037]以下將配合附圖及實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用 技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。
[0038] 實(shí)施例1四重PCR方法的建立
[0039] 1材料及設(shè)備
[0040] 1.1試驗(yàn)組織及材料
[0041] 豬肉、牛肉、羊肉、狗肉、鴨肉，均購于超市及農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場。
[0042] 1.2主要試劑
[0043] 2XEasyTaq PCR superMix:購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；100bp DNA Ladder:購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；電泳上樣緩沖液:購自北京全式金生物技術(shù)有 限公司；電泳級瓊脂糖購自瓊脂糖:購自北京泰科蘭博有限公司。
[0044] 1.3試驗(yàn)所用溶液的配置
[0045] (1)0·01M PBS(pH7·4):0·27gKH2P04、1·42gNa2HP04、8gNaCl、0·2gKCl加 800ml蒸 餾水充分?jǐn)嚢枞芙?，再加適量濃鹽酸調(diào)pH至7.4，最后定容到1L。
[0046] (2)50XTAE 緩沖液：TRIS 堿 121g，冰乙酸 28.55ml，0.5MEDTA(pH8.0)50ml 加雙蒸水 混合，定容至500ml。工作液濃度為1 X TAE
[0047] (3) 2 %瓊脂糖凝膠:取2.0g瓊脂糖加1 X TAElOOml加熱融化，待冷卻至50-60 °C時(shí) 加入5yL核酸染料混勻，倒入模具制成瓊脂糖凝膠。
[0048] (4)蛋白酶K(20mg/mL):用滅菌的50mmol/LTris · Cl (pH8 · 0)，1 · 5mmol/L乙酸f丐溶 解，配置成濃度為20mg/ml的溶液，分裝-20°C保存。
[0049] (5)1M Tris-HCl(pH8.0):121.1gTris堿溶于800mL水中加濃HC1 調(diào)節(jié)pH值至8.0， 定容至1L。
[0050] (6)EB(10mg/mL)儲存液:將適量EB溶于蒸餾水中，稀釋成10mg/mL，劇烈攪拌，待 完全溶解后，于室溫避光保存。
[0051] 1.4試劑盒
[0052] 血液、組織、細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒:購自TIANGEN公司，貨號:DP304。
[0053] 普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒:購自TIANGEN公司，貨號:DP209-02。
[0054] 1.5試驗(yàn)設(shè)備與耗材
[0055] BS 124s電子天平：Sartorius公司產(chǎn)品；MLS-3020型高壓滅菌鍋：SANY0公司產(chǎn) 品；-80 °C超低溫冰箱:海爾集團(tuán)有限公司產(chǎn)品;HH-B11 600-S電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海躍進(jìn)醫(yī) 療器械廠產(chǎn)品;Mi 11 iQ超純水儀:Mi 1 ipore公司產(chǎn)品；SIM-F140制冰機(jī):SANYO公司產(chǎn)品；臺 式離心機(jī):Eppendorf公司產(chǎn)品；Centrifuge5810R低溫高速冷凍離心機(jī):Eppendorf公司產(chǎn) 品；YJ-875SA醫(yī)療凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備公司產(chǎn)品；DDHZ-300多用途臺式恒溫振蕩器： 江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品；電熱恒溫水槽:上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；S1000型PCR儀： BI0-RAD公司產(chǎn)品；Gel Doc2000型凝膠成像儀:BI0-RAD公司產(chǎn)品；微量可調(diào)移液器（lmL、 200yL、100yL、10yL) :Eppendorf公司產(chǎn)品。
[0056] 1.6生物信息學(xué)分析軟件
[0057] 序列對比工具：ClustalX 2.0、Genedoc;序列下載工具：Lasergene 7.0;引物設(shè)計(jì) 軟件:Primer Premier 5.0;引物特異性評價(jià)工具:01igo 7.0〇
[0058] 1.7引物合成及產(chǎn)物測序
[0059]引物合成由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成;產(chǎn)物測序由生工生物工程 (上海)有限公司北京測序部完成。
[0060] 2試驗(yàn)方法
[0061 ] 2.1動(dòng)物組織中總DNA的提取
[0062] 分別使用ΤΙ ANGEN公司血液組織細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒、SDS-蛋白酶K法提取 豬肉組織、牛肉組織、羊肉組織、狗肉組織、雞肉組織、鴨肉組織、馬肉組織、驢肉組織、涮肉 片中的總DNA。其中TIANGEN公司血液組織細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒法，按照說明書操作； SDS-蛋白酶K法參照《分子克隆》第三版;SDS-蛋白酶K法使用酚/氯仿抽提進(jìn)行核酸純化。lg 樣品的總DNA溶解于200yL TE緩沖液中，測定0D260、0D280吸光度值，計(jì)算DNA濃度和純度。 [0063] 2.1.1試劑盒提取法
[0064] 參照TIANGEN公司血液組織細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。
[0065] 2 · 1 · 2SDS-蛋白酶K法提取法
[0066] (1)組織經(jīng)pH 7 · 2PBS勻漿后，反復(fù)凍融三次，然后10，000rpm離心10min，取上清。
[0067] (2)取250yL上清，加入250yL組織裂解液與10yL蛋白酶K，50 °C消化2h，加入等體積 的飽和酚，劇烈振蕩，12，OOOrpm離心1 Omin。
[0068] (3)取上層水相轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈離心管中與等體積的有機(jī)混合液(酚:氯仿:異戊醇： 體積比為25:24:1)混勾后，12, OOOrpm離心10min。
[0069] (4)取上層水相加2倍體積預(yù)冷無水乙醇（_20°C)并加入10%體積的NaAC(3mol/ 〇，放入-20°(：沉淀211。
[0070] (5) 12，OOOrpm離心 15min，棄上清液，加入70 % 乙醇 lmL。
[0071 ] (6)8500rpm離心5min，棄上清液，室溫風(fēng)干。
[0072] (7)加入25mL TE緩沖液，產(chǎn)物儲存于-80°C備用。
[0073] 2.2目的基因的篩選
[0074] 本試驗(yàn)主要參考國家標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)參考文獻(xiàn)，同時(shí)查看基因的同源性，篩選豬、牛、 羊、
[0075] 狗、鴨高度保守的線粒體基因作為候選目的基因。
[0076] 2.3引物的設(shè)計(jì)與合成
[0077] 從1^131網(wǎng)站（;1^卩：//;1^卩.11(313；[.11；[11.80￥/^611011168)下載豬（登錄號：1(卩472178.1)、 牛（登錄號：KF163094.1)、狗（登錄號：JF342863.1)、鴨（登錄號:EU755252.1)的線粒體完整 基因組，再通過ClustalX 2.0、Genedoc軟件獲得目的基因的序列。再用Primer premier5.0 軟件設(shè)計(jì)PCR引物，采用200bp、300bp、450bp、600bp為目標(biāo)長度，每種動(dòng)物設(shè)計(jì)一條共用下 游引物，四條特異性上游引物，篩選無措配、無發(fā)夾結(jié)構(gòu)、無引物二聚體的引物對，同時(shí)初步 評價(jià)引物的特異性。由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成引物合成。引物序列與擴(kuò) 增片段大小見表1。
[0078]表1引物信息表
[0081 ] 2.4多種動(dòng)物四重PCR方法的建立
[0082] 2.4.1豬、牛、羊、狗四重PCR方法的建立
[0083] 依據(jù)自設(shè)豬、牛、羊、狗自設(shè)引物特異性條帶位置，根據(jù)200bp、300bp、450bp、600bp 的自設(shè)目標(biāo)長度，合理選擇引物組合模式，建立四重PCR方法，檢測各組引物有無擴(kuò)增反應(yīng) 且擴(kuò)增產(chǎn)物是否為特異性四重條帶;若為四重條帶是否符合設(shè)計(jì)目標(biāo)長度；
[0084] 反應(yīng)體系（μ〇:
[0086] 94°C 預(yù)變性 4min;94°C 變性 3〇8,55°(：退火3〇8,72°(：延伸358，共35個(gè)循環(huán)；72°(：終 末延伸lOmin。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5yL，用2%瓊脂糖凝膠電泳20min(電壓180V)，至紫外凝膠成 像系統(tǒng)中觀察并拍照保存結(jié)果。重復(fù)上述試驗(yàn)2次，設(shè)立對應(yīng)動(dòng)物組織DNA做模板的陽性對 照。
[0087] 2.4.2豬、鴨、牛、狗四重PCR方法的建立
[0088] 根據(jù)豬、鴨、牛、狗自設(shè)引物特異性條帶位置，合理選擇引物組合模式，建立豬、鴨、 牛、狗四重PCR，方法參照2.4.1。
[0089] 2.4.3豬、牛、羊、鴨四重PCR方法的建立
[0090] 根據(jù)豬、牛、羊、鴨自設(shè)引物特異性條帶位置，合理選擇引物組合模式，建立豬、牛、 羊、鴨四重PCR，方法見2.4.1。
[0091] 2.5方法評價(jià)
[0092]選擇豬、牛、羊、狗四重PCR方法和豬、牛、狗、鴨四重PCR中的優(yōu)秀引物組合作為待 選方法驗(yàn)證自設(shè)引物組合的特異性、靈敏度。同時(shí)，對擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后割膠回收純化、鑒定， 并委托測序。測序結(jié)果與GenBank上的已知序列進(jìn)行比對。
[0093] 2.5.1特異性試驗(yàn)
[0094]使用已知牛、羊、豬、狗、鴨陽性肉類DNA為模板，對建立、優(yōu)化的豬、牛、羊、狗四重 PCR方法和豬、鴨、牛、狗四重PCR方法;參照2.4.1的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行四重PCR，以判 定方法的特異性。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，至紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照保 存結(jié)果。
[0095] 2.5.2檢測靈敏度試驗(yàn)
[0096] 使用已知豬、牛、羊、狗、鴨肉類DNA，于0D260/280測定吸光度值，計(jì)算DNA濃度，將 DNA模板調(diào)整為0.以8/4^(2.01\1011(3叩化8/^〇，然后對所得0嫩進(jìn)行10倍倍比稀釋，得到9 個(gè)稀釋度樣品。參照2.4.1的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件進(jìn)行四重PCR，以判定方法的檢測下限。 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，至紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照保存結(jié)果。
[0097] 2.6PCR產(chǎn)物回收及測序 [0098] 2.7.1PCR產(chǎn)物的回收
[0099]參照TIANGEN公司普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進(jìn)行操作。
[0100] 2.7.2PCR產(chǎn)物的測序
[0101]將回收的PCR產(chǎn)物，送生工生物工程(上海)有限公司北京測序部進(jìn)行測序，測序結(jié) 果與GenBank上的已知序列進(jìn)行比對，對建立的雙重PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。
[0102] 3試驗(yàn)結(jié)果
[0103] 3.1多種動(dòng)物四重PCR方法的建立
[0104] 3 · 1 · 1豬、牛、羊、狗四重PCR方法的建立
[0105]依據(jù)豬、牛、羊、狗自設(shè)引物擴(kuò)增條帶位置選擇引物組合模式，見表2(a)和表2(b)。 以豬、牛、羊、狗肌肉組織提取的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，由圖1可見，1、6可觀察到明亮的特異 性條帶，選其為后續(xù)試驗(yàn)組合。同時(shí)，以人為制成的生鮮肉四種混合物提取的DNA為模板擴(kuò) 增，與DNA四重混合物為模板的PCR結(jié)果相同。因此在后續(xù)試驗(yàn)中，將以DNA混合物為模板進(jìn) 行四重PCR方法的建立。
[0106] 表2(a)豬、牛、羊、狗四重PCR引物組合
[0108] 表2(b)豬、牛、羊、狗四重PCR引物組合
[011 0] 3 · 1 · 2豬、鴨、牛、狗四重PCR方法的建立
[0111]依據(jù)豬、鴨、牛、狗自設(shè)引物擴(kuò)增條帶位置選擇引物組合模式，見表3(a)和表3(b)。 以豬、鴨、牛、狗肌肉組織提取的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，由圖2可見，1、11觀察到明亮的特異性 條帶，6可觀察到較暗的特異性條帶，選1、11為后續(xù)試驗(yàn)組合，6為備選組合。
[0112] 表3(a)豬、鴨、牛、狗四重PCR引物組合
[0115] 表3(b)豬、鴨、牛、狗四重PCR引物組合
[0117] 3 · 1 · 3豬、牛、羊、鴨四重PCR方法的建立
[0118] 依據(jù)豬、牛、羊、鴨自設(shè)引物擴(kuò)增條帶位置選擇引物組合模式，見表4(a)和表4(b)。 以豬、牛、羊、鴨肌肉組織提取的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，由圖3可見，1觀察到明亮的特異性條 帶，選1為后續(xù)試驗(yàn)組合。
[0119] 表4(a)豬、牛、羊、鴨四重PCR引物組合
[0121] 表4(b)豬、牛、羊、鴨四重PCR引物組合
[0123] 3.2方法評價(jià)
[0124] 綜合試驗(yàn)中的四重PCR方法建立及快速檢驗(yàn)實(shí)際應(yīng)用需求，選擇豬、牛、羊、狗四重 PCR方法中的1為待選方法;豬、鴨、牛、狗四重PCR方法中的11為待選方法，驗(yàn)證自設(shè)引物組 合的特異性（引物組合見表2(a)、表2(b)、表3(a)、表3(b))。同時(shí)，對擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化、鑒 定，并委托生工生物工程(上海)有限公司北京測序部測序。測序結(jié)果與GenBank上的已知序 列進(jìn)行比對。
[0125] 3 · 2 · 1豬、牛、羊、狗四重PCR方法的特異性及靈敏度
[0126] 特異性試驗(yàn)中，使用建立的優(yōu)化的四重PCR方法對牛、羊、豬、狗、鴨、目標(biāo)肉類DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，由（圖4)可見在1處可同時(shí)觀察到豬、牛、羊和狗四條特異性條帶，在2處可觀察到 豬的特異性條帶、在3處可觀察到牛的特異性條帶。在4處可觀察到羊的特異性條帶、在5處 可觀察到狗的特異性條帶，鴨、雞、馬、驢處未見特異性條帶。
[0127] 靈敏度試驗(yàn)中，將O.1μg/μL的樣本肉類DNA 10倍梯度稀釋，可見目標(biāo)DNA在稀釋 至Ijo. 0 1μg/μL后，使用PCR檢測方法進(jìn)行檢測，可觀察到特異性擴(kuò)增，在0.00 1μg/μL處未見特 異性條帶，方法靈敏度確定為O.O1μg/μL，結(jié)果見（圖4)。
[0128] 3 · 2 · 2豬、鴨、牛、狗四重PCR方法的特異性及靈敏度
[0129] 特異性試驗(yàn)中，使用建立的優(yōu)化的四重PCR方法對牛、羊、豬、狗、鴨、目標(biāo)肉類DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，由（圖5)在1處可同時(shí)觀察到豬、鴨、牛和狗四條特異性條帶，在2處可觀察到豬的 特異性條帶、在3處可觀察到鴨的特異性條帶。在4處可觀察到牛的特異性條帶、在5處可觀 察到狗的特異性條帶，羊、雞、馬、驢處未見特異性條帶。
[0130] 靈敏度試驗(yàn)中，將0. 1μg/μL的樣本肉類DNA 10倍梯度稀釋，可見目標(biāo)DNA在稀釋到 0.0 1μg/μL后，使用PCR檢測方法進(jìn)行檢測，可觀察到特異性擴(kuò)增，在0.00 1μg/μL處未見特異 性條帶，方法靈敏度確定為〇. O1μg/μL，結(jié)果見圖5。
[0131] 3.3PCR產(chǎn)物回收及測序
[0132] 3 · 3 · 1豬、牛、羊、狗四重PCR方法測序鑒定
[0133] 目的片段經(jīng)膠回收，送生工生物工程(上海)有限公司北京測序部進(jìn)行測序，得到 如下序列（SEQ ID N0:31-SEQ ID N0:34)測序結(jié)果與GenBank上的已知序列進(jìn)行比對，與預(yù) 期結(jié)果相符。
[0134] 3.3.2豬、鴨、牛、狗四重PCR產(chǎn)物測序
[0135] 目的片段經(jīng)膠回收，送生工生物工程(上海)有限公司北京測序部進(jìn)行測序，得到 如下序列（SEQ ID NO: 35-SEQ ID N0: 38)。測序結(jié)果與GenBank上的已知序列進(jìn)行比對后， 同源性為100 %。
[0136] 4 討論
[0137] 4.1多種動(dòng)物四重PCR方法的建立
[0138] 本試驗(yàn)分別建立的豬、牛、羊、狗四重PCR方法;豬、鴨、牛、狗四重PCR方法;豬、牛、 羊、鴨四重PCR方法;并綜合考慮現(xiàn)實(shí)需求、已建立的雙重PCR方法、三重PCR方法，對豬、牛、 羊、狗四重PCR方法，豬、鴨、牛、狗四重PCR方法進(jìn)行了系統(tǒng)的方法評價(jià)。所建立的3種多種動(dòng) 物四重PCR方法均可作為肉類成分特異性鑒定的試驗(yàn)依據(jù)。四重PCR方法引物組合匯總見 (表5)。
[0139] 表5四重PCR方法引物組合匯總
[0141] 4.5 小結(jié)
[0142] 建立了豬、牛、羊、狗四重PCR方法;豬、鴨、牛、狗四重PCR方法;豬、牛、羊、鴨四重 PCR方法;所建立的四重PCR方法均具有較好的特異性，檢測靈敏度為0.0 1μg/μL。
[0143] 實(shí)施例2四重PCR方法的應(yīng)用
[0144] 1材料及設(shè)備
[0145] 1.1試驗(yàn)組織及材料
[0146] 豬肉及其他組織（心臟組織、腸道組織、腦組織、肝臟組織、腎臟組織、骨組織）、牛 肉、羊肉、狗肉、雞肉、鴨肉、涮肉片及調(diào)理生肉制品、鹵肉制品、火腿腸類制品等，均購于北 京超市及農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場。
[0147] 1.2主要試劑
[0148] 詳見實(shí)施例1中的1.2。
[0149] 1.3試驗(yàn)所用溶液的配置
[0150] 詳見實(shí)施例1中的1.3。
[0151] 1.4試劑盒
[0152] 詳見實(shí)施例1中的1.4。
[0153] 1.5試驗(yàn)設(shè)備與耗材
[0154] 詳見實(shí)施例1中的1.5。
[0155] 1.6生物信息學(xué)分析軟件
[0156] 詳見實(shí)施例1中的1.6。
[0157] 1.7引物合成及產(chǎn)物測序
[0158] 詳見實(shí)施例1中的1.7。
[0159] 2試驗(yàn)方法
[0160] 2.1動(dòng)物組織中總DNA的提取
[0161] 詳見實(shí)施例1中的2.1。
[0162] 2.2引物的設(shè)計(jì)與合成
[0163] 詳見實(shí)施例1中的2.3。
[0164] 2.3市售樣本的檢測
[0165] 采用2.1.1的方法對71份(動(dòng)物組織樣本19份、涮肉片及調(diào)理生肉制品樣本14份、 鹵肉制品樣本15份、火腿腸類樣本23份)市售動(dòng)物源性制品樣本進(jìn)行核酸提取，運(yùn)用所建立 的多種肉類成分多重PCR方法進(jìn)行檢測。對豬的肌肉組織、心臟組織、腸道組織、腦組織、肝 臟組織、腎臟組織、骨組織進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證所建立方法的特異性和適用性;對涮肉片及調(diào) 理生肉制品進(jìn)行檢測以檢測市售涮肉片及調(diào)理生肉制品的摻假率;對鹵肉制品及火腿腸類 制品進(jìn)行檢測，以檢測市售鹵肉制品及火腿腸類制品標(biāo)簽標(biāo)識合格率。
[0166] 2 · 3 · 1豬、牛、羊、狗四重PCR方法的應(yīng)用
[0167] 依據(jù)所建立的豬、牛、羊、狗四重PCR方法，引物選擇為：18+24+27+46+21+26+33+ 47,反應(yīng)體系(μυ:
[0169] 94°C預(yù)變性4min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸35s，共35個(gè)循環(huán)；72°C 終 末延伸7min。
[0170] 取PCR產(chǎn)物5yL反應(yīng)產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳2〇11^11(電壓180￥)，至紫外凝膠成 像系統(tǒng)中觀察并拍照保存結(jié)果。每組試驗(yàn)設(shè)立對應(yīng)動(dòng)物組織DNA做模板的陽性對照，以及水 為模板的陰性對照。
[0171] 2.3.2豬、鴨、牛、狗四重PCR方法的應(yīng)用
[0172] 依據(jù)所建立的豬、鴨、牛、狗四重PCR方法，引物選擇為：19+54+22+46+21+57+26+ 47。反應(yīng)體系(μυ:
[0174] 94°C 預(yù)變性 4min;94°C 變性 3〇8,55°(：退火3〇8,72°(：延伸358，共35個(gè)循環(huán)；72°(：終 末延伸lOmin。
[0175] 取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5yL，用2%瓊脂糖凝膠電泳2〇11^11(電壓180￥)，至紫外凝膠成像系 統(tǒng)中觀察并拍照保存結(jié)果。每組試驗(yàn)設(shè)立對應(yīng)動(dòng)物組織DNA做模板的陽性對照，以及水為模 板的陰性對照。
[0176] 3 結(jié)果
[0177] 3.1市售樣本的采集
[0178] 參考中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T763-2004)豬肉、豬肝、豬尿抽樣方法，中 華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T5344.6-2006)無公害食品產(chǎn)品抽樣規(guī)范，第6部分：畜禽 產(chǎn)品方法，于北京幾大批發(fā)市場，隨機(jī)采集來自13個(gè)動(dòng)物產(chǎn)品屠宰加工企業(yè)19份動(dòng)物組織 樣本;5個(gè)動(dòng)物產(chǎn)品生產(chǎn)廠家的6份涮肉片樣本，無生產(chǎn)廠家的6份涮肉片樣本;2個(gè)廠家生產(chǎn) 的2種調(diào)理生肉制品。北京幾家超市隨機(jī)采集來自9個(gè)食品加工企業(yè)的15種鹵肉類制品，以 及來自14個(gè)食品加工企業(yè)的23種火腿腸類動(dòng)物制品。
[0179] 3.2市售樣本的鑒別檢測結(jié)果
[0180] 使用上述建立的豬、牛、羊、狗四重PCR檢測方法及豬、鴨、牛、狗四重PCR檢測方法 對市售71份動(dòng)物源性制品樣本進(jìn)行了肉類的鑒別檢驗(yàn)，樣本的鑒別檢測結(jié)果見圖6-圖9。
[0181] 21份豬組織樣本中，肌肉組織、心臟、腸道、腦、肝臟、腎臟、骨組織的四重PCR檢測 均出現(xiàn)特異性條帶，檢出率為1〇〇 %。
[0182] 在檢測的14份涮肉片及調(diào)理生肉制品樣本中，包括涮肉片樣本8個(gè)(無生產(chǎn)廠家樣 本6個(gè)，有生產(chǎn)廠家樣本2個(gè)），肥牛片樣本2個(gè)(生產(chǎn)廠家2個(gè)），羊肉片樣本2個(gè)(生產(chǎn)廠家2 個(gè)），羊肉串樣本1個(gè)、骨肉相連樣本1個(gè)(生產(chǎn)廠家2個(gè)），全部14個(gè)樣品中，13份樣本出現(xiàn)特 異性條帶，涮肉片樣本未表現(xiàn)明顯特異性，檢出率為92.57%，采用建立的四重PCR檢測方 法，對涮肉片及調(diào)理生肉制品樣本進(jìn)行特異性鑒別檢驗(yàn)。
[0183] 在檢測的15份鹵肉制品樣本中，包括牛肉（熟）、培根、烤肉、醬肘、梅花肉、鹽水鴨、 醬狗肉等(生產(chǎn)廠家9個(gè)），15份樣本均出現(xiàn)特異性條帶，檢測特異性率在100%，鹵肉制品可 作為采集驗(yàn)證的樣本。
[0184] 3.2.4市售肉類食品成分的鑒定
[0185] 19份動(dòng)物組織樣本鑒別檢測中，未出現(xiàn)非目標(biāo)特異性結(jié)果，未見摻假情況，合格率 100%〇
[0186] 14份涮肉片樣本及調(diào)理生肉制品鑒別檢測中，1個(gè)涮肉片樣品，經(jīng)營者認(rèn)定肥牛片 樣本未檢出牛肉成分，1個(gè)涮肉片樣本未檢出牛肉、羊肉成分，1個(gè)涮肉片號樣本檢出含有 牛、豬、鴨成分，1個(gè)羊肉串樣品未檢出羊肉成分，摻假率為28.6%，合格率為71.4%。
[0187] 15份鹵肉制品樣本鑒別檢測中，未檢出非目標(biāo)特異性結(jié)果，未見摻假情況，合格率 100%〇
[0188] 23份火腿類樣本標(biāo)簽標(biāo)識均為混合動(dòng)物制品，其中標(biāo)識含有豬源成分18種，鑒別 檢驗(yàn)出豬肉成分樣本6個(gè)，合格率為33% ;標(biāo)識含有牛源成分2種，鑒別檢驗(yàn)出牛肉成分樣本 1個(gè)，合格率為50 %;
[0189] 肉類摻假情況多發(fā)生于涮肉片中，摻假率為28.6%?；鹜阮愔破放c標(biāo)識不符的情 況突出，合格率為30.4%。
[0190] 4 討論
[0191] 4.1多種肉類成分多重PCR方法檢測體系的現(xiàn)實(shí)應(yīng)用
[0192] 本研究所建立的多種肉類成分多重PCR方法檢測體系適用于多種動(dòng)物組織樣本、 涮肉片及調(diào)理生肉制品、鹵肉制品、火腿腸類樣本中肉類成分的鑒別檢驗(yàn)，引物匯總見(表 6)。本研究選擇豬、牛、羊、狗四重PCR方法;豬、鴨、牛、狗四重PCR方法組成多種肉類成分多 重PCR方法檢測體系，重點(diǎn)考慮了動(dòng)物源性食品安全監(jiān)管的實(shí)際需求，各有側(cè)重，相互印證， 形成體系，以期提升所建立方法的綜合效率、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性、為動(dòng)物源性食品 流通領(lǐng)域監(jiān)督執(zhí)法提供確證和技術(shù)支撐。
[0193] 肉類制品的摻假本質(zhì)上是由于利益的相關(guān)驅(qū)動(dòng)，多存在于一種廉價(jià)肉類代替或摻 入另一種價(jià)格較高的肉類中混合出售，或?qū)⒔钩鍪鄣奈唇?jīng)檢疫的、淘汰的種畜禽經(jīng)過加 工處理，作為其他動(dòng)物產(chǎn)品進(jìn)行出售或以次充好。
[0194] 4.1.1豬、牛、羊、狗四重PCR方法
[0195] 將動(dòng)物源性食品中消費(fèi)量最大的豬、牛、羊三類動(dòng)物制品來源進(jìn)行有機(jī)組合，同時(shí) 加入有較高社會關(guān)注度的狗源性動(dòng)物產(chǎn)品檢測。通過該方法實(shí)現(xiàn)豬、牛、羊、狗源動(dòng)物產(chǎn)品 同批次鑒別檢驗(yàn)，可有效查證打擊以淘汰種母豬肉冒充牛肉，以淘汰小公牛肉冒充羊肉，以 狗肉冒充羊肉的違法行為。同時(shí)，可作為羊肉片、牛肉片、涮肉片、調(diào)理生肉制品（羊肉串）等 動(dòng)物源性產(chǎn)品鑒別檢驗(yàn)中牛、羊源性的確證檢驗(yàn)。
[0196] 4.1.2豬、鴨、牛、狗四重PCR方法
[0197] 豬、鴨、牛、狗四重PCR方法的建立是以羊肉片、肥牛片、涮肉片、調(diào)理生肉制品（羊 肉串、豬腎臟、狗腎臟)等動(dòng)物源性制品的鑒別檢驗(yàn)和確證需求為基礎(chǔ)。通過該方法可有效 實(shí)現(xiàn)對冒充羊肉片、羊肉串及羊肉制品的鑒別檢驗(yàn)，對各種冒充羊源性制品的違法行為實(shí) 現(xiàn)有效查證打擊。同時(shí)有效實(shí)現(xiàn)對肥牛片及牛肉制品的確證檢驗(yàn)，多重PCR方法引物組合匯 總?cè)绫?所示。
[0198] 表6多重PCR方法引物組合匯總
[0200] 5 小結(jié)
[0201] 應(yīng)用建立的多種肉類成分多重PCR方法檢測體系驗(yàn)證市售肉類食品的成分，結(jié)果 顯示，市售食品中動(dòng)物組織樣本、鹵肉制品未見摻假情況，合格率100%;肉類摻假情況多發(fā) 生于涮肉片及調(diào)理生肉制品，摻假率為28.6%;火腿類制品與標(biāo)識不符的情況突出，不合格 率為69.6%。
[0202] 上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非 局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實(shí)施案例的排除，而可用于各種其他組合、修 改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進(jìn) 行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附 權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種肉類成分四重PCR的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 依據(jù)豬、牛、羊、狗、鴨基因序列，自設(shè)可擴(kuò)增的特異性條帶引物，根據(jù)引物設(shè)計(jì)擬擴(kuò) 增目標(biāo)長度，合理選擇引物組合模式，建立四重PCR方法;檢測各組引物有無擴(kuò)增反應(yīng)，且擴(kuò) 增產(chǎn)物是否為特異性四個(gè)條帶;若為四個(gè)條帶，檢測是否符合設(shè)計(jì)目標(biāo)長度； 2) 取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5yL，用2 %瓊脂糖凝膠電泳20min，電壓180v，置紫外凝膠成像系統(tǒng)中 觀察并拍照保存結(jié)果。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肉類成分四重PCR的檢測方法，其特征在于，該肉類成分四重 PCR的檢測方法具體是指豬、牛、羊、狗四重PCR的檢測方法，或者，豬、鴨、牛、狗四重PCR的檢 測方法，或者，豬、牛、羊、鴨四重PCR的檢測方法。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肉類成分四重PCR的檢測方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)體系 如下：ddH20 9yL，2XEasyTaq PCR super Mix 25yL，上游引物lyLX4,下游引物lyLX4,組 織DNA模板2yL X 4，總體積50yL。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肉類成分四重PCR的檢測方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件 如下：94°C預(yù)變性4min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸35s，共35個(gè)循環(huán);72°C終末延 伸lOmin。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的肉類成分四重PCR的檢測方法，其特征在于，豬、牛、羊、狗四重 PCR的檢測方法采用的引物組合為：上游引物如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID ΝΟ:11、 SEQIDN0:19所示，下游引物如SEQIDN0:5、SEQIDN0:10、SEQIDN0 :15、SEQIDN0:20 所示；或者，上游引物如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:ll、SEQ ID NO:17所示，下 游引物如SEQ ID NO:5、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO:15、SEQ ID N0:20所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的肉類成分四重PCR的檢測方法，其特征在于，豬、鴨、牛、狗四重 PCR的檢測方法采用的引物組合為：上游引物如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO: 19所示，下游引物如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:20 所示；或者，上游引物如SEQIDN0:3、SEQIDN0:27、SEQIDN0 :6、SEQIDN0:19所示，下 游引物如SEQIDN0:5、SEQIDN0 :30、SEQIDN0:10、SEQIDN0:20所示。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的肉類成分四重PCR的檢測方法，其特征在于，豬、牛、羊、鴨四重 PCR的檢測方法采用的引物組合為：上游引物如SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:11、 SEQ ID N0:27所示，下游引物如SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:30 所示。8. -種由權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的肉類成分四重PCR的檢測方法在多種動(dòng) 物組織樣本、涮肉片及調(diào)理生肉制品、鹵肉制品、火腿腸類樣本中肉類成分的鑒別檢驗(yàn)中的 應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK105969880SQ201610454267
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月21日
【發(fā)明人】李煥榮, 蓋新娜, 王月虎, 崔德鳳, 周雙海
【申請人】北京農(nóng)學(xué)院