一種使用逆轉(zhuǎn)錄pcr檢測hla-b*5801基因表達(dá)的檢測方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明是屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是關(guān)于一種使用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測HLA?B*5801基因表達(dá)的檢測方法，及用于進(jìn)行該檢測方法的HLA?B*5801 RT?PCR檢測試劑盒，本發(fā)明的技術(shù)方案特征包括：篩選一段特異性的引物，該引物翻譯的產(chǎn)物僅僅針對HLA?B*5801的序列；以及將該引物用于針對HLA?B*5801的蛋白翻譯序列的cDNA片段進(jìn)行的RT?PCR檢測。本發(fā)明的RT?PCR檢測方法及試劑盒，是針對HLA?B*5801翻譯區(qū)的RNA或cDNA的檢測，對比針對HLA?B*5801基因的DNA序列的檢測，更能直接檢測到HLA?B*5801蛋白的表達(dá)。
【專利說明】
一種使用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測HLA-B*5801基因表達(dá)的檢測方法及 試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明是屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是關(guān)于一種使用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測HLA-B*5801基因表達(dá)的檢測方法，及用于進(jìn)行該檢測方法的HLA-B*5801RT-PCR檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，人們生活水平持續(xù)，日常飲食結(jié)構(gòu)和習(xí)慣逐漸發(fā) 生改變，飲食結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致了痛風(fēng)和高尿酸血癥這類自身免疫性疾病正逐漸成為常見的 多發(fā)病。
[0003] 痛風(fēng)是由于血尿酸水平過高而造成尿酸鹽結(jié)晶在關(guān)節(jié)中沉積而導(dǎo)致的一種急性 關(guān)節(jié)炎。據(jù)近年各地高尿酸血癥患病率的報道，目前我國約有高尿酸血癥者1.2億，其發(fā)病 率已經(jīng)達(dá)到了人群的10%，在發(fā)病率呈上升趨勢的同時，發(fā)病年齡也開始呈現(xiàn)低齡化趨勢。 據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年有近100萬人因痛風(fēng)致殘。痛風(fēng)已成為嚴(yán)重影響人們身體健康的疾 病之一。此外高尿酸血癥及痛風(fēng)還會引發(fā)嚴(yán)重的相關(guān)疾病，如腎功能障礙、缺血性心臟病、 腎結(jié)石、肥胖癥、尚血脂癥、糖尿病、尚血壓等。
[0004] 目前控制痛風(fēng)及血尿酸水平過高主要依靠別嘌呤醇和丙磺舒類藥物。別嘌呤醇為 痛風(fēng)患者治療中的一線藥，但其一個顯著的缺點(diǎn)是患者易發(fā)生過敏。過敏患者可以發(fā)生嚴(yán) 重的剝脫性皮炎，包括Stevens-John綜合征（SJS)及中毒性表皮壞死癥(TEN)，甚至可危及 患者的生命。別嘌呤醇藥疹因潛伏期長，病情重，易復(fù)發(fā)和病死率高而受到重視，因此對于 即將使用別嘌呤醇的患者對于其發(fā)生過敏風(fēng)險的預(yù)測極其重要。
[0005] HLA_B*5801為一個可用于預(yù)測別嘌呤醇使用過程中是否會出現(xiàn)過敏的一個基因。 HLA-B*5801為一種白細(xì)胞分化抗原。近年來，國內(nèi)外很多研究都證實(shí)它和使用別嘌呤醇患 者發(fā)生嚴(yán)重過敏的風(fēng)險存在強(qiáng)烈的相關(guān)性，如表1所示。而2012年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)關(guān) 于痛風(fēng)患者的指南中也指出，HLA-B*5801可作為一種有效的預(yù)測手段，用于判斷痛風(fēng)患者 能否使用別嘌呤醇。研究報道亞洲人群和歐洲人群的別嘌呤醇誘導(dǎo)的嚴(yán)重藥物不良反應(yīng) 與HLA-B*5801之間存在強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)性。有研究表明，HLA-B*5801與別嘌呤醇誘導(dǎo)的過敏反 應(yīng)的敏感性和特異性分別為100 %和87 %。因此，檢測痛風(fēng)患者是否攜帶HLA-B*5801，對于 指導(dǎo)用藥有重要的意義。世界不同人種HLA-B*5801的平均攜帶率差異，非洲人2-4%，白種 人1-6%，亞洲人3-15%，華人8.8-10.9%。美國Π )Α及日本，中國臺灣地區(qū)等地的醫(yī)療監(jiān)管 部門已明確要求醫(yī)生在對亞裔人群使用別嘌呤醇前，必須進(jìn)行HLA-B*5801基因檢測，并且 此項(xiàng)檢測已納入醫(yī)保范圍。
[0006] 由于HLA-B*5801在痛風(fēng)患者中的重要價值剛被確立，目前診斷手段尚不成熟，主 要檢測方法有DNA測序法和PCR檢測（主要針對DNA)方法。目前應(yīng)用于HLA-B*5801的檢測試 劑盒，主要是通過直接測序法及DNA的Q-PCR檢測方法。直接測序或者是PCR-SBT都是需要通 過測序儀針對HLA-B位點(diǎn)進(jìn)行測序，雖然結(jié)果較為準(zhǔn)確，但是由于目的基因與其家族成員存 在高度相似性，測序結(jié)果較容易出現(xiàn)套峰，并且測序技術(shù)需要購置測序儀，過程繁瑣，耗時 較長，不利于快速檢測基因分型，準(zhǔn)確指導(dǎo)臨床用藥。
[0007] 目前已有針對HLA-B*5801基因的DNA的PCR檢測方法，例如我國專利公布號 103484533A公開了一種檢測HLA-B*5801等位基因的方法，包括利用三對特異性引物和一對 內(nèi)參引物，或一對特異性引物和二條熒光探針，及一對內(nèi)參引物和一條相應(yīng)熒光探針進(jìn)行 PCR-SSP擴(kuò)增，再通過瓊脂糖凝膠電泳分析，或熒光PCR分析待測樣本是否攜帶HLA-B*5801 等位基因。專利公布號104017898A公開了一種快速檢測HLA-B*5801基因的引物、試劑盒及 方法，其特征是采用多重引物的組合設(shè)計，完全覆蓋HLA-B*5801基因的SNP位點(diǎn)，來增強(qiáng)特 異性結(jié)合，防止假陽性檢測結(jié)果的產(chǎn)生。專利公布號104232781A公開了一種檢測HLA-B* 5801等位基因的TaqMan探針實(shí)時熒光PCR方法，特點(diǎn)是設(shè)計特異性擴(kuò)增HLA_B*5801等位基 因的引物探針組合，將目的基因與內(nèi)參基因加入一管中進(jìn)行雙通道熒光PCR反應(yīng)，通過擴(kuò)增 曲線分析結(jié)果。
[0008] 目前我國市場上具備臨床資質(zhì)的HLA-B*5801等位基因測試盒，僅中國臺灣地區(qū)世 基生物醫(yī)學(xué)股份有限公司的試劑盒(2015年剛獲批，CE認(rèn)證，CFDA認(rèn)證）。目前針對DNA的Q-PCR檢測方法，雖然可以通過熒光結(jié)果判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但是針對的是HLA-B*5801的全長DNA 序列，而不是針對發(fā)揮功能的蛋白序列，并且DNA的合成產(chǎn)物不僅僅包括翻譯區(qū)的外顯子， 還包括非編碼區(qū)的內(nèi)含子序列，因此缺少檢測的特異性。
[0009] 藥物誘發(fā)的不良反應(yīng)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)成為近年來藥物遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)人 類的HLA基因的單核苷酸多態(tài)性變異與多種藥物不良事件相關(guān)。HLA分子在免疫反應(yīng)中扮演 這重要的角色，它可以將藥物抗原(通常為8-10個多肽)呈遞TCR，可以識別專一的T細(xì)胞并 引起免疫反應(yīng)。所有有核細(xì)胞表面均表達(dá)I類HLA分子，包括HLA-A，HLA-B及HLA-C等8個基因 座位。其中HLA-B位點(diǎn)上有800多個基因型，是人類最復(fù)雜的遺傳多肽系統(tǒng)，并且成員之間序 列相似性極高，即使是同一種血清型B58,也有31種等位基因存在，其中HLA-B*5801與HLA-B*5802，HLA-B*5803等成員僅有一個氨基酸的差異，并且出現(xiàn)雜合子的概率遠(yuǎn)大于純合子， 故對于HLA-B*5801基因型的檢測鑒定新方法的研究有著重要的意義。根據(jù)HLA的命名原則， 主要是通過特異性的蛋白進(jìn)行分類命名，因而針對特定目標(biāo)蛋白序列的檢測及翻譯區(qū)的 RNA或cDNA的檢測，可以增加檢測蛋白的特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明目的是開發(fā)一種新的針對HLA-B*5801蛋白翻譯序列的cDNA片段的RT-PCR 檢測方法，其主要解決的技術(shù)手段是：篩選一段特異性的引物，并將其應(yīng)用于針對HLA-B* 5801的cDNA的逆轉(zhuǎn)錄PCR，即RT-PCR簡易的基因型檢測方法，并且該引物翻譯的產(chǎn)物系僅僅 針對HLA-B*5801的序列。
[0011]本發(fā)明的一目的在于提供一種使用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測HLA-B*5801基因表達(dá)的檢 測方法，所述檢測方法包含如下步驟：
[0012] ⑴提取樣本的RNA;
[0013] (2)將所獲得的RNA進(jìn)行RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄成一 cDNA片段；
[0014] (3)設(shè)計針對該cDNA片段的cDNA特異性引物和一對內(nèi)參引物；
[0015] (4)在熒光PCR儀上進(jìn)行熒光Q-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或與該特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反 應(yīng)；
[0016] (5)根據(jù)目的基因及內(nèi)參基因的CT值的差值，或通過瓊脂糖凝膠電泳分析是否有 預(yù)定的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，判斷目的基因 HLA-B*5801是否為陽性。
[0017] 進(jìn)一步的，所述樣本為取自待測患者血液的白細(xì)胞，但不局限于白細(xì)胞，樣本可為 取自待測患者血液、組織等的各種細(xì)胞。作為優(yōu)選的，所述的樣本為取自待測患者血液的白 細(xì)胞。
[0018] 進(jìn)一步的，所述CDNA特異性引物包括上游引物，含有以下至少80 %相似序列：5'_ GGGGAGACACGGAACATGAAG-3 '（SEQ ID NO. 1)及下游引物，含有以下至少80%相似序列：5'_ GTTGTAGTAGCGGAGCGCGA-3'（SEQIDN0.2)。作為優(yōu)選的，所述的特異性引物包含SEQID NO. 1與2所示的特異性引物對85%、90%、95%或99%相似的序列。
[0019] 進(jìn)一步的，所述內(nèi)參引物包括上游引物，含有以下至少80 %相似序列：5'_ AGAAAATCTGGCACCACACC-3 '（ SEQ ID N0.3)及下游引物，含有以下至少80 %相似序列：5'_ AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3'（SEQIDN0.4)。作為優(yōu)選的，所述內(nèi)參引物包含SEQIDN0.3與 4所示的內(nèi)參引物對，或含有85%、90%、95%或99%相似的序列。
[0020] 進(jìn)一步的，所述熒光Q-PCR擴(kuò)增反應(yīng)方法為可應(yīng)用于任何熒光Q-PCR法，例如，但不 局限于SYBR Green法或Eva Green法等焚光Q-PCR方法。作為優(yōu)選的，可應(yīng)用于所述焚光Q-PCR擴(kuò)增反應(yīng)方法的熒光染料，包括，但不局限于SYBR Green、Eva Green、RTGreen等。
[0021] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測HLA-B*5801基因轉(zhuǎn)錄序列的cDNA片段的RT-PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包含一對針對該cDNA片段的特異性引物和一對內(nèi)參引物，及用 于進(jìn)行定量熒光PCR反應(yīng)或一般PCR反應(yīng)的酶和試劑組合。
[0022]進(jìn)一步的，所述的特異性引物包含SEQ ID NO. 1與2所示的特異性引物對，或含有 至少80%相似序列，且該內(nèi)參引物包含SEQ ID N0.3與4所示的內(nèi)參引物對，或含有至少 80%相似序列。作為優(yōu)選的，所述的特異性引物包含SEQ ID NO. 1與2所示的特異性引物 對，或含有85%、90%、95%或99%相似的序列，且該內(nèi)參引物包含SEQ ID N0.3與4所示的 內(nèi)參引物對，或含有85%、90%、95%或99%相似的序列。
[0023] 進(jìn)一步的，所述用于進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)的酶和試劑包括Buffer(10X)、熱啟動酶、 UNG酶、dNTP、EVA Green(20X)、MgCl2,其最終濃度分別為 1Χ、0·01 ~1·〇υ/μ1、0·001 ~0.1U/ yl、0.01~0.1mM、0.25X~2X、0.5~5.0mM。
[0024]本發(fā)明的又一目的在于提供一種檢測HLA-B*5801基因轉(zhuǎn)錄序列的cDNA片段的引 物組合，該引物組合包含選自以下至少80%相似序列：SEQ ID NO.1與2、SEQ ID N0.5與6所 示的特異性引物對。作為優(yōu)選的，該引物組合包含SEQ ID NO. 1與2或SEQ ID NO. 5與6所示 的特異性引物對，或含有85%、90%、95%或99%相似的序列。
[0025]進(jìn)一步的，該引物組合進(jìn)一步包含SEQ ID N0.3與4所示的內(nèi)參引物對，或含有至 少80 %相似序列。作為優(yōu)選的，所述的內(nèi)參引物對包含SEQ ID N0.3與4所示的內(nèi)參引物對， 或含有85%、90%、95%或99%相似的序列。
[0026] 進(jìn)一步的，所述的用于進(jìn)行定量熒光PCR反應(yīng)的熒光標(biāo)記系統(tǒng)包括所有可能用以 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明使用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測HLA-B*5801基因表達(dá)的檢測方法的目標(biāo)的所有系統(tǒng)。 作為優(yōu)選的，所述的焚光染料包括，但不局限于SYBR Green、Eva Green、RTGreen等。
[0027] 術(shù)語"HLA-B*5801抗原"為一種白細(xì)胞分化抗原，存在于所有有核細(xì)胞表面，B基因 座位上的58家族成員，與別嘌呤醇的用藥過敏存在直接相關(guān)性。
[0028]術(shù)語"逆轉(zhuǎn)錄PCR"或"RT-PCR"在本文中是指一種用于檢測目的基因的cDNA的檢測 方法，通過在檢測方法中加入熒光素，觀察熒光信號的強(qiáng)弱，判斷目的基因的表達(dá)量。
[0029]在以下說明及附屬的圖式，將詳細(xì)列述本發(fā)明的一或多項(xiàng)具體實(shí)施例。本發(fā)明的 其他特征、目的與優(yōu)點(diǎn)，將從這些詳細(xì)描述與圖式，以及從權(quán)利要求中顯而易見。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明HLA-B*5801特異性引物用Q-PCR方法檢測5個陽性樣本與5個陰性樣 本獲取的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0031] 其中，曲線?-1、？-2、？-3、？-4、？_5分別為5個陽性樣本的熒光擴(kuò)增曲線，曲線^1、 N-2、N-3、N-4、N-5分別為5個陰性樣本的熒光擴(kuò)增曲線。
[0032] 圖2為內(nèi)參引物β-actin用Q-PCR方法檢測陽性樣本與陰性樣本獲取的熒光曲線 圖；
[0033]其中，曲線P1-P5分別為5個陽性樣本的熒光擴(kuò)增曲線，曲線N1-N5分別為5個陰性 樣本的熒光擴(kuò)增曲線。
[0034]圖3為SYBR Green法Q-PCR檢測一個陽性樣本和一個陰性樣本獲取的熒光擴(kuò)增曲 線圖；
[0035] 其中：1為陽性樣本內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線、2為陰性樣本內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線、3為陽性 樣本目的基因擴(kuò)增曲線、4為陰性樣本目的基因擴(kuò)增曲線。
[0036] 圖4為EVA Green法Q-PCR檢測一個陽性樣本和一個陰性樣本獲取的熒光擴(kuò)增曲線 圖；
[0037] 其中：1為陽性樣本內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線、2為陰性樣本內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線、3為陽性 樣本目的基因擴(kuò)增曲線、4為陰性樣本目的基因擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0038] l.Trizol 提取 RNA
[0039] 取l-2ml EDTA抗凝血加入紅細(xì)胞裂解液，10分鐘后于250g離心5min，收集離心管 底白細(xì)胞，收集的白細(xì)胞加入lml Trizol，充分吹打，使細(xì)胞沉淀溶解，室溫靜置5分鐘。（加 完一管即吹打，勿將標(biāo)本全部加完后再吹打，尤其標(biāo)本含紅細(xì)胞時。）每使用lml Trizol加 入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置2-3分鐘后，于2_8°C 12000g離心15分鐘。離心后，樣 品分為三層:底層為紅色有機(jī)相(酚-氯仿相），上層為無色水相和一個中間層，RNA主要在水 相中。小心吸出上層水相(通常取到450-500μ1)轉(zhuǎn)移到新的無 Rnase的EP微量離心管中。用 異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用lml TRizol加入0.5ml異丙醇，"8"字法顛倒混勻，室溫放 置10分鐘后，于2-8°C 12000g離心10分鐘。離心前常看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出 現(xiàn)膠狀沉淀，移去上清。用無 RNA酶的75 %乙醇洗滌RNA沉淀，混勻。每使用lml Trizol加 lml 75 %乙醇，2-8°C不超過7500g離心5分鐘，棄上清，盡量吸干。室溫(或超凈工作臺）放置干燥 RNA沉淀后，加入20-50μ1 DEPC水，在55-60°C放置10分鐘使RNA完全溶解。另取ΙμL RNA在紫 外分光亮度計測定RNA的純度和濃度。RNA樣品的純度：1.8〈Α260/Α280〈2.0。
[0040] 2.逆轉(zhuǎn)錄 PCR 擴(kuò)增(RT-PCR)制備 cDNA
[0041] 使用前先將所有冷凍試劑解凍。開始實(shí)驗(yàn)前將所有試劑輕度離心。實(shí)驗(yàn)開始后保 持將所有試劑置于冰上。將無菌、無核酸酶、薄管壁的PCR管置于冰上，以20μ1反應(yīng)體系為 例，按照以下組分準(zhǔn)備模板-引物混合物。其中01ig〇(dT)18引物(瓶5)、隨機(jī)六聚核苷酸引物 (瓶6)購自德國羅氏公司。
[0043]^在65°C條件下加熱反應(yīng)管10分鐘，使模板-引物混合物變性。此步驟可確保RNA二 級結(jié)構(gòu)變性。立即將反應(yīng)管置于冰上冷卻。在含有模板-引物混合物的反應(yīng)管中加入下表中 其余的RT反應(yīng)液組分。其中，Trans crip tor逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液（5X)(瓶2)、Pro tec tor RNas e抑制劑(瓶3)、dNTP (瓶4)、Trans cr ip tor逆轉(zhuǎn)錄酶(瓶1)等購自德國羅氏公司。
[0044]
[0045] 在反應(yīng)管中將試劑小心混勻，反應(yīng)時使用帶加熱蓋的加熱模塊，防止液體揮發(fā)。用 以下程序進(jìn)行PCR。
[0047]獲得的cDNA產(chǎn)物將用于以下的方法，作為模板。
[0048] 3.SYBR Green法Q-PCR
[0049] 在本實(shí)施例中用于發(fā)明中所設(shè)計的序列特異性引物和內(nèi)參引物為：
[0050] HLA-B*5801 特異性引物：上游：5'-GGGGAGACACGGAACATGAAG-3'（SEQ ID N0.1);下 游：5'-GTTGTAGTAGCGGAGCGCGA-3'（SEQ ID N0.2)。
[0051] 內(nèi)參引物：上游：5'-AGAAAATCTGGCACCACACC-3'（SEQIDN0·3) ;下游：5'-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3'（SEQ ID N0.4)。
[0052] 將反應(yīng)管置于冰上，在20μ1單個反應(yīng)體系中，依次加入下表中的反應(yīng)液組分。其中 SYBR Green Ι(20Χ)購自康為世紀(jì)。
[0054] 用移液槍將混合液小心混勻，請勿漩渦。移取18μ1 PCR混合液至PCR反應(yīng)管或PCR 微板孔中。加入2μ1于前述第2步驟所獲得的cDNA產(chǎn)物作為模板。使用透光的PCR管蓋或用自 黏箱封閉PCR板。用以下程序進(jìn)行熒光PCR測定：
[0055]
[0056] 4.結(jié)果判讀
[0057] 本方法采用的是在熒光PCR儀器上直接觀察目的基因以及內(nèi)參基因的CT值的差 值，判斷結(jié)果是否為陽性，操作過程不需應(yīng)用到測序儀，時間較短，并且能直觀判斷結(jié)果。參 見圖1所示的結(jié)果，在本發(fā)明較佳的實(shí)驗(yàn)體系，使用內(nèi)參基因 β-actin作為內(nèi)對照，分析的樣 本用上述的特異性引物與內(nèi)參引物同時進(jìn)行Q-PCR，觀察目的基因的CT值與內(nèi)參基因的CT 值，若樣本的目的基因的CT值減去內(nèi)參基因 β-actin的CT值相減小于7，則判斷為陽性，若大 于7,或目的基因的CT大于35,則判斷為陰性，結(jié)果如圖3。
[0058] 5.EVA Green法Q-PCR
[0059] 本發(fā)明的檢測方法還可以采用EVA Green熒光染料操作系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)Q-PCR檢測。
[0060] HLA-B*5801 特異性引物：上游：5'-GGGGAGACACGGAACATGAAG-3'（SEQ ID N0.1);下 游：5'-GTTGTAGTAGCGGAGCGCGA-3'（SEQ ID N0.2)。
[0061] 內(nèi)參引物：上游：5'-AGAAAATCTGGCACCACACC-3'（SEQIDN0·3) ;下游：5'-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3'（SEQ ID N0.4)。
[0062] 將反應(yīng)管置于冰上，在20μ1單個反應(yīng)體系中，依次加入下表中的反應(yīng)液組分。其 中，熱啟動酶（5·OU/μΙ)購自TAKARA，UNG酶（lU/μΙ)購自Thermo，EVA Green(20Χ)購自美國 Biotium〇
[0064] 用移液槍將混合液小心混勻，請勿漩渦。移取18μ1 PCR混合液至PCR反應(yīng)管或PCR 微板孔中。加入2μ1于前述第2步驟所獲得的cDNA產(chǎn)物作為模板。使用透光的PCR管蓋或用自 黏箱封閉PCR板。用以下程序進(jìn)行熒光PCR測定：
[0065]
[0066] 結(jié)果判讀
[0067] 本方法采用的是在熒光PCR儀器上直接觀察目的基因以及內(nèi)參基因的CT值的差 值，判斷結(jié)果是否為陽性，操作過程不需應(yīng)用到測序儀，時間較短，并且能直觀判斷結(jié)果。參 見圖4所示的結(jié)果，于本發(fā)明較佳的實(shí)驗(yàn)體系，使用內(nèi)參基因 β-actin作為內(nèi)對照，分析的樣 本用上述的特異性引物與內(nèi)參引物同時進(jìn)行Q-PCR，觀察目的基因的CT值與內(nèi)參基因的CT 值，若樣本的目的基因的CT值減去內(nèi)參基因 β-actin的CT值相減小于7，則判斷為陽性，若大 于7,或目的基因的CT大于35,則判斷為陰性，結(jié)果如圖4。
[0068] 6.其他【具體實(shí)施方式】
[0069]除了上述的通過熒光PCR的方法，對HLA-B*5801的基因型直觀的判斷是否攜帶該 基因，還可以通過將前述第2步驟所獲得的cDNA產(chǎn)物作為模板，與同一段特異性的引物進(jìn)行 普通PCR，所得PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳，分析是否有75bp左右大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，而進(jìn)行 陽性或陰性結(jié)果的判斷。
[0070] 通過普通PCR結(jié)合凝膠電泳的方法，鑒定出針對cDNA的三個較為特異的引物序列， 其中包括上述所提及的HLA-B*5801特異性引物，還包括以下一對特異性引物：
[0071] 上游：5'-GGGAGACACGGAACATGAAGG-3'（SEQ ID N0.5);
[0072] 下游：5'-TTGTAGTAGCGGAGCGCGA-3'（SEQ ID N0.6)
[0073] 綜合上述，本發(fā)明是針對翻譯HLA-B*5801蛋白的cDNA序列上的多態(tài)性集中位點(diǎn) 設(shè)計的特異性引物，因此針對的是HLA-B*5801蛋白翻譯前的RNA序列，對比DNA序列，更能直 接的檢測到HLA-B*5801蛋白的表達(dá)。由于別嘌呤醇的藥物過敏主要是與HLA-B*5801的蛋白 功能相關(guān)，因而直接檢測HLA-B*5801蛋白的表達(dá)，更能直接且準(zhǔn)確的反映測試患者是否攜 帶 HLA-B*5801基因。
[0074] 本說明書中所揭示的全部特征可以任何組合方式組合。本說明書中所揭示的各別 特征可由依相同、相等或類似目的的替代特征取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示的 各特征僅為一系列同等物或類似特征的實(shí)例。
[0075]從前述的說明，習(xí)于該項(xiàng)技藝具有通常知識者可容易地確定本發(fā)明的基本特征， 且在未偏離其范圍下，可進(jìn)行本發(fā)明的各種改變與修飾，以使其適于各種不同用途與狀況。 因此，于權(quán)利要求內(nèi)亦包含其他【具體實(shí)施方式】。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種使用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測HLA-B*5801基因表達(dá)的檢測方法，其特征在于，所述檢測方 法包含如下步驟： (1) 提取樣本的1?嫩； (2) 將所獲得的RNA進(jìn)行RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄成一 cDNA片段； (3 )設(shè)計針對該cDNA片段的cDNA特異性引物和一對內(nèi)參引物； (4) 在熒光PCR儀上進(jìn)行熒光Q-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或與該特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； (5) 根據(jù)目的基因及內(nèi)參基因的CT值的差值，或通過瓊脂糖凝膠電泳分析是否有預(yù)定 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，判斷目的基因 HLA-B*5801是否為陽性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述cDNA特異性引物包括上游引物， 含有以下至少80%相似序列：5'-GGGGAGACACGGAACATGAAG-3'（SEQIDN0.1)及下游引物，含 有以下至少80%相似序列：5'-GTTGTAGTAGCGGAGCGCGA-3'（SEQ ID N0.2)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述內(nèi)參引物包括上游引物，含有以 下至少80%相似序列：5'-AGAAAATCTGGCACCACACC-3'（SEQ ID N0.3)及下游引物，含有以下 至少80%相似序列：5 ' -AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3 '（SEQ ID NO · 4)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述樣本為取自待測患者血液的白細(xì) 胞。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述熒光Q-PCR擴(kuò)增反應(yīng)方法為SYBR Green 法、Eva Green法或RTGreen法。6. -種檢測HLA-B*5801基因表達(dá)的RT-PCR檢測試劑盒，用于進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求1所述 的檢測方法的步驟(4)，其特征在于，所述試劑盒包含一對針對該cDNA片段的特異性引物和 一對內(nèi)參引物，及用于進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)或一般PCR反應(yīng)的酶和試劑組合。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述特異性引物包含SEQ ID NO. 1與2所示的特異性引物對，或含有至少80%相似序列;且該內(nèi)參引物包含SEQ ID NO. 3與 4所示的內(nèi)參引物對，或含有至少80%相似序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述用于進(jìn)行熒光PCR反應(yīng) 的熒光染料，包括SYBR Green、Eva Green或RTGreen。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述用于進(jìn)行熒光PCR反應(yīng) 的試劑為SYBR Green Master(ROX)。10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述用于進(jìn)行熒光PCR反應(yīng) 的酶和試劑包括Buffer(lOX)、熱啟動酶、UNG酶、dNTP、EVA Green(20X)、MgCl2,其最終濃度 分別為1)(、0.01~1.01]/^1、0.001~0.11]/^1、0.01~0.1111]\1、0.25父~2父、0.5~5.0111]\1。11. 一種檢測HLA-B*5801基因轉(zhuǎn)錄序列的cDNA片段的引物組合，其特征在于，所述引物 組合包含選自下列的特異性引物對，含有以下至少80%相似序列： (1) 上游引物5'- GGGGAGACACGGAACATGAAG-3'（SEQ ID N0.1)與下游引物5'-GTTGTAGTAGCGGAGCGCGA-3'（SEQ ID N0.2),或 (2) 上游引物5'-GGGAGACACGGAACATGAAGG-3'（SEQIDN0·5)與下游引物5'-TTGTAGTAGCGGAGCGCGA-3'（SEQ ID N0.6)。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的引物組合，其特征在于，所述引物組合還包含SEQ ID NO.3 與4所示的內(nèi)參引物對，或含有至少80%相似序列。
【文檔編號】C12N15/11GK105969895SQ201610557570
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月15日
【發(fā)明人】錢紅燕, 石桂秀, 劉源, 何幸, 陳鋒
【申請人】廈門敖依生物科技有限公司, 廈門金諾威生物科技有限公司