一種基于lncRNA-H19的慢性腎臟病腎功能診斷試劑盒及l(fā)ncRNA-H19的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于lncRNA?H19的慢性腎臟病腎功能診斷試劑盒及l(fā)ncRNA?H19的應(yīng)用。該試劑盒包括RNA提取試劑、lncRNA?H19引物、反轉(zhuǎn)錄體系和標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系。本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)lncRNA?H19在患者血清中的表達情況與慢性腎臟病腎功能進展成正相關(guān),lncRNA?H19的表達越高,患者的腎功能越好,治療后效果越好,患者預(yù)后越好,提示lncRNA?H19可作為一種檢查標(biāo)的來輔助對慢性腎臟病腎功能的診斷,因此lncRNA?H19能夠作為慢性腎臟病患者腎功能的診斷的相關(guān)指標(biāo),可用于制作慢性腎臟病腎功能診斷試劑和診斷試劑盒。
【專利說明】
一種基于I nCRNA-H19的慢性腎臟病腎功能診斷試劑盒及 lncRNA-H19 的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于慢性腎臟病診斷試劑領(lǐng)域,具體涉及一種基于lncRNA-H19的慢性腎臟 病腎功能診斷試劑盒及l(fā)ncRNA-H19的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢性腎臟病是指各種超過三個月的慢性損害引起的腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙,包括腎 小球濾過率的下降、腎臟病理的損傷,患者血液、尿液成分的異常以及腎臟影像學(xué)的異常。 引起慢性腎臟病的疾病主要包括各種原發(fā)的、繼發(fā)的腎小球腎炎,還有一些腎小管的損傷 和腎血管的病變。其中原發(fā)性腎小球腎炎是造成慢性腎功能不全甚至尿毒癥的最重要的病 因之一。在我國乃至世界范圍內(nèi),IgA腎病是最常見的原發(fā)腎小球疾病之一,以血尿為主要 臨床表現(xiàn),超過30%以上的患者在發(fā)病10~20年后進展至終末期腎病(尿毒癥),是引起我 國青年患者尿毒癥的常見原因。慢性腎臟病的診斷主要依靠腎活檢,并無其他替代方法,但 是腎活檢手術(shù)風(fēng)險大、花費高,而且一般只允許做一次,這很大程度上限制了后期對患者病 情的檢測以及對療效反應(yīng)、預(yù)后的評估。因此探索適合的非侵入性腎小球腎炎診斷方法、評 價治療效果及預(yù)后一直是腎臟疾病領(lǐng)域中最緊迫的課題之一。
[0003] LncRNA是一種長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNAs,LncRNA,1 incRNA),具有 mRNA樣結(jié)構(gòu),該分子不編碼蛋白,卻參與細胞內(nèi)多種過程的調(diào)控,如參與了X染色體沉默,基 因組印記以及染色質(zhì)修飾,轉(zhuǎn)錄激活,轉(zhuǎn)錄干擾,核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程。lncRNA-H19是在肝臟中被首次分離,并且研究發(fā)現(xiàn)其為母系遺傳。隨后,關(guān)于lncRNA-H19的研究逐 漸增多。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn),lncRNA-H19可參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,2015年Tumour Biol上一 篇文章指出lncRNA-H19可以促進膀胱癌細胞的增生及代謝,同年Oncol Lett也表明 lncRNA-H19的上調(diào)能促進EMT,進而加速食管癌的侵襲。南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015年 發(fā)表在Scientific Reports上的文章直接指出lncRNA-H19可以作為消化道腫瘤的新型分 子標(biāo)記物。同時也發(fā)現(xiàn)有文獻報道出lncRNA-H19的缺失表達與腎臟Wilms瘤和橫紋肌肉瘤 的發(fā)展密切相關(guān)。但目前尚無有關(guān)lncRNA-H19與腎炎的相關(guān)性的相關(guān)報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于lnCRNA-H19的慢性腎臟病腎功能診斷試劑盒及 lncRNA-H19的應(yīng)用,能夠有助于慢性腎臟病腎功能的診斷。
[0005] 為達到上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006] lncRNA-H19作為檢測標(biāo)的物在制備慢性腎臟病腎功能診斷試劑方面的應(yīng)用。
[0007] 所述的慢性腎臟病腎功能診斷試劑為腎小球腎炎的診斷試劑。
[0008] 所述的慢性腎臟病腎功能診斷試劑為腎小球纖維化程度的診斷試劑。
[0009] 所述的慢性腎臟病腎功能診斷試劑為腎小球濾過率的診斷試劑。
[0010] lncRNA-H19作為檢測標(biāo)的物在制備慢性腎臟病腎功能診斷試劑盒方面的應(yīng)用。
[0011] -種基于1 n c RN A - Η19的慢性腎臟病腎功能診斷試劑盒,包括R ΝΑ提取試劑、 lncRNA-H19引物、反轉(zhuǎn)錄體系和標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系,其中l(wèi)ncRNA-H19引物包括1^1^1^^-!119-F和LincRNA-H19-R,LincRNA-H19-F的核苷酸序列如SEQ· ID · N0 · 1 所示,LincRNA-H19-R的核 苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
[0012] 所述的反轉(zhuǎn)錄體系包括5XPrimeScript RT Master Mix 2yL,所述的標(biāo)準(zhǔn)PCR反 應(yīng)體系包括SYBRIOyL、無 RNA酶水6yL和反轉(zhuǎn)錄的cDNA2yL,所述的lncRNA-H19引物的含量為 LincRNA-H19-FlyL、LincRNA-H19-R lyL〇
[0013] 相對于現(xiàn)有技術(shù),本發(fā)明的有益效果為:
[0014] 本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)lncRNA-H19在患者血清中的表達情況與慢性腎臟病腎功能 進展成正相關(guān),lncRNA-H19的表達越高,患者的腎功能越好,治療后效果越好,患者預(yù)后越 好,提示lncRNA-H19可作為一種檢查標(biāo)的來輔助對慢性腎臟病腎功能的診斷,因此lncRNA-H19能夠作為慢性腎臟病患者腎功能的診斷的相關(guān)指標(biāo),可用于制作慢性腎臟病腎功能診 斷試劑和診斷試劑盒。
[0015] 進一步的,本發(fā)明通過體外實驗結(jié)果證實,腎小管上皮細胞低氧損傷后,lncRNA-H19顯著降低,提示lncRNA-H19可能與低氧保護相關(guān)。動物體內(nèi)實驗結(jié)果提示:用腺相關(guān)病 毒上調(diào)lncRNA-H19的表達進行腎臟的原位注射可減輕腎臟的間質(zhì)纖維化。提示lncRNA-H19 可作為一種檢查標(biāo)的來輔助對腎小球腎炎,尤其是IgA腎病的診斷。
[0016] 本發(fā)明提供的基于1 n c RN A - Η19的慢性腎臟病腎功能診斷試劑盒中包含檢測 lncRNA_H19的相關(guān)引物及real time PCR反應(yīng)體系,使用該試劑盒即可通過real time PCR 技術(shù)檢查患者血清中l(wèi)ncRNA-H19的表達情況,有助于對慢性腎臟病患者腎功能的評估。使 用該試劑盒診斷評估慢性腎臟病腎功能情況,具有創(chuàng)傷性小、檢驗方便、靈敏度及特異度良 好的優(yōu)點,與傳統(tǒng)的腎活檢相比,風(fēng)險及費用均明顯降低。
【附圖說明】
[0017] 圖1是病例組與對照組的組織中l(wèi)ncRNA-H19表達結(jié)果對比圖(a)和R0C曲線(b)。
[0018] 圖2是病例組與對照組血清中l(wèi)incRNA-H19的表達結(jié)果對比圖(a)和ROC曲線(b)。
[0019] 圖3是血清中l(wèi)ncRNA-H19不同程度表達的患者的腎臟存活率。
[0020] 圖4是IgA患者血清中l(wèi)ncRNA-H19的表達以及腎小球濾過率相關(guān)性分析結(jié)果。
[0021] 圖5是IgA患者治療前后血清中l(wèi)ncRNA-H19的表達(a)和腎小球濾過率的變化結(jié)果 (b) 〇
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實驗和附圖對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0023]本發(fā)明通過qRT-PCR定量不同Lee氏分級的單純I gA腎病、膜性腎病、輕度系膜增生 性腎小球腎炎等慢性腎臟病患者和正常健康人的血清中l(wèi)ncRNA-H19的表達,并進行統(tǒng)計學(xué) 比較,登記治療效果、建立隨訪系統(tǒng),判斷l(xiāng)ncRNA-H19在IgA腎病等CKD患者診斷、治療及評 價預(yù)后中的作用。
[0024] 為了檢測血清中l(wèi)ncRNA-H19的表達,本發(fā)明提供了一種基于lncRNA-H19的慢性腎 臟病腎功能診斷試劑盒,該試劑盒能夠針對腎病患者外周血中IncRNA-Hl 9的表達情況進行 檢測,能夠快速、準(zhǔn)確的得出腎病患者外周血中l(wèi)ncRNA-H19的表達水平,從而有助于醫(yī)生對 患者病情的診斷。
[0025] 本發(fā)明提供的基于lncRNA-H19的慢性腎臟病腎功能診斷試劑盒具體包括以下內(nèi) 容:RNA提取試劑、lncRNA-H19引物(引物由生工》合成,未包含酶切位點,未進行修飾,具體 的核苷酸引物見表1)、反轉(zhuǎn)錄體系(5XPrimeScript RT Master Mix和RNase Free dH2〇) 和標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系(SYBR: 10yL;無 RNA酶水:6yL;引物R鏈及F鏈各lyL;反轉(zhuǎn)錄的cDNA: 2μ L)〇
[0026] 表1引物核苷酸序列
[0028] 注:0-actin:0-肌動蛋白,內(nèi)參。
[0029] 先進行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購買自Takara?',反轉(zhuǎn)錄體系中5 XPrimeScript RT Master Mix2yL,其中含有定量RT-PCR的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所需的所有試劑:PrimeScript RTase、 RNase Inhibitor、Random 6mers、01igo dT Primer、dNTP Mixture、反應(yīng)Buffer(含有Mg2 + );PCR反應(yīng)體系中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗體的Hot Start用DNA聚合酶, 染料為SYBR Green,SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus 2X)的量為 10yL〇
[0030] 本發(fā)明提供的基于lncRNA-H19的慢性腎臟病腎功能診斷試劑盒的具體使用方法 為:抽取全血3mL,2500rpm離心15min取上清,利用RNA提取試劑提取血清中的總RNA,之后利 用反轉(zhuǎn)錄試劑進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用PCR反應(yīng)體系以及l(fā)ncRNA-H19引物進行擴增,根據(jù) PCR結(jié)果進行病情分析。
[0031] 本發(fā)明提供的基于lncRNA-H19的慢性腎臟病腎功能診斷試劑盒具有以下優(yōu)點:引 物具有特異性,反轉(zhuǎn)錄體系中含有預(yù)先混好的Premix形式,只需加入模板RNA和水即可反 應(yīng),含有Random 6mers和Oligo dT Primer 2種反轉(zhuǎn)錄引物,可在較短時間內(nèi)高效合成 cDNA〇
[0032] 使用本發(fā)明提供的基于lncRNA-H19的慢性腎臟病腎功能診斷試劑盒來檢測血清 中l(wèi)incRNA-H19的表達情況的具體步驟為:
[0033] 1)血液標(biāo)本:抽取全血3mL后,2小時內(nèi)2500rpm離心15min,并取上層血清,加入有 lmL的Trizol液的EP管中,充分混合均勻。
[0034] 2)室溫放置5min,待其裂解完全。然后加入200yL的氯仿,蓋緊EP管并劇烈搖蕩15 秒鐘。
[0035] 3)4°C下12000rpm離心20min(4°C離心機),取上層水相于一新的EP管中(千萬不要 將中間的沉淀層和下層液混入,否則重新離心分離),加入等體積異丙醇,溫和顛倒混勻。然 后同樣4 °C下12000rpm離心15min。
[0036] 4)小心地棄去上清液(此時EP管底部已有少量RNA析出),加入lmL的75%乙醇,渦 旋混勾,4 °C下12000rpm離心1 Omin。重復(fù)操作一次。
[0037] 5)棄去上清液(底部則為全部析出的RNA),室溫或真空干燥5~lOmin(注意不要干 燥過分,否則會降低RNA的溶解度)。用30yL DEPC處理過的水將RNA溶解。RNA可進行mRNA分 離,或貯存于70%乙醇并保存于_70°C。
[0038] 6)測定提取的RNA濃度及分光光度:取0.2mL EP管,加入lyL的RNA和99yL的DEPC 水,在機子上(BIO-RAD核酸蛋白測定儀SmartSpec plus)測定所提取的血清RNA濃度。
[0039] 7)根據(jù)相應(yīng)濃度配制20yL體系的lncRNA-H19反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(TAKARA試劑盒),并按 照37<€6〇111;[11,95<€5111;[11條件在反轉(zhuǎn)錄機子上進行反轉(zhuǎn)錄。
[0040] 8)制定相應(yīng)的lincRNA-H19引物(通過生工公司合成),并配制標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系 (SYBR: 1 OyL;無 RNA酶水:6yL;引物R鏈及F鏈各lyL;反轉(zhuǎn)錄的cDNA: 2yL)在PCR機子上(Bi〇-Rad ClOOOTouch? PCR儀)按照95°ClOmin熱啟動,95°C 15s,60°Clmin擴增40個循環(huán)的條件 進行,每次均設(shè)去離子水為模板的陰性。PCR擴增結(jié)果即可體現(xiàn)血清中l(wèi)incRNA-H19的表達 情況。
[0041 ]本發(fā)明進行了下列實驗來判定lncRNA-H19與慢性腎小球腎炎的相關(guān)性。
[0042] 收集50例慢性腎小球腎炎患者血液標(biāo)本發(fā)現(xiàn):同正常對照相比,lncRNA-H19在IgA 腎病患者血液中表達降低,同時,與IgA腎病患者已做的病理結(jié)果對比,血清中l(wèi)ncRNA-H19 的表達與腎小球纖維化程度呈負相關(guān),與腎小球濾過率呈正相關(guān),可用以檢測腎功能。結(jié)果 如圖1-圖5所示。
[0043] 圖1為病例組與對照組的組織中l(wèi)ncRNA-H19表達結(jié)果對比圖(a)和R0C曲線(b)。采 用real time PCR方法檢測正常對照組和IgA患者腎臟組織中l(wèi)ncRNA-H19的表達情況。(NT: 正常組織;IgAN: IgA患者組織;每一個▲代表一個樣本。)從圖1中可以看出IgA患者腎臟組 織中l(wèi)ncRNA-H19的表達量降低。
[0044] 圖2為病例組與對照組Serum(血清)中l(wèi)incRNA-H19的表達結(jié)果對比圖(a)和R0C曲 線(b)。采用real time PCR方法檢測正常對照組和IgA患者血清中l(wèi)ncRNA-H19的表達情況。 圖中Scr(血肌酐)、BUN(尿素氮)、Cys C(胱抑素)是臨床上腎病檢測指標(biāo)。R0C曲線是受試者 工作特征曲線,也稱感受性曲線,以敏感性為縱坐標(biāo)代表真陽性率,(1-特異性)為橫坐標(biāo), 代表假陽性率,R0C曲線下的面積AUC最大則診斷價值最好。從表2中可以看出lncRNA-19測 試下的AUC低于臨床上腎病指標(biāo)Scr檢測下的AUC,高于BUN、Cys C。(圖2中NT表示正常組血 清;IgAN表示IgA患者血清;每一個▲代表一個樣本。)從圖2中可以看出IgA患者血清中 lncRNA-H19的表達量降低。
[0045]表2圖2中R0C曲線中的相關(guān)指標(biāo)
[0047] 圖3為血清中l(wèi)ncRNA_H19不同程度表達的患者的腎臟存活率。經(jīng)Kaplan-Meier method計算,血清lncRNA-H19高表達組患者1年腎臟生存率為63.9%、中位生存時間為12土 0.487個月,P〈0.001;低表達組患者1年腎臟生存率為20.5%、中位生存時間為10± 1.242個 月,Ρ〈0·001。
[0048] 圖4為IgA患者血清中l(wèi)ncRNA-H19的表達以及eGFR(腎小球濾過率)相關(guān)性分析結(jié) 果。每一個?代表一個樣本。腎小球濾過率是指單位時間內(nèi)兩腎生成濾液的量。從圖4中可 以看出IgA患者血清中IncRNA-Hl 9的表達與eGFR(腎小球濾過率)呈線性相關(guān)。
[0049] 圖5為IgA患者治療前后血清中l(wèi)ncRNA-H19的表達(a)和eGFR的變化結(jié)果(bhpre- treat表示治療前、post-treat表示治療后,每一個〇、▼代表一個樣本。從圖5中可以看出, IgA患者在治療前后血清中l(wèi)ncRNA-H19的表達情況和腎小球濾過率的變化基本一致。
[0050]上述結(jié)果充分肯定了 lncRNA-H19與慢性腎臟病尤其是IgA腎病之間的關(guān)系。因此 可以通過對可疑腎病患者外周血中l(wèi)ncRNA-H19的檢測來為診斷腎臟疾病提供更加可靠的 臨床實驗證據(jù)。
【主權(quán)項】
1. lncRNA-H19作為檢測標(biāo)的物在制備慢性腎臟病腎功能診斷試劑方面的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述的慢性腎臟病腎功能診斷試劑為腎小球 腎炎的診斷試劑。3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述的慢性腎臟病腎功能診斷試劑為腎小球 纖維化程度的診斷試劑。4. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述的慢性腎臟病腎功能診斷試劑為腎小球 濾過率的診斷試劑。 5. lncRNA-H19作為檢測標(biāo)的物在制備慢性腎臟病腎功能診斷試劑盒方面的應(yīng)用。6. -種基于lncRNA-H19的慢性腎臟病腎功能診斷試劑盒,其特征在于:包括RNA提取試 劑、IncRNA-Hl9引物、反轉(zhuǎn)錄體系和標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系,其中IncRNA-Hl9引物包括LincRNA-H19-F和LincRNA-H19-R,LincRNA-H19-F的核苷酸序列如SEQ · ID · NO · 1 所示,LincRNA-H19-R 的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 2所示。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于lncRNA-H19的慢性腎臟病腎功能診斷試劑盒,其特征在 于:所述的反轉(zhuǎn)錄體系包括5XPrimeScript RT Master Mix 2yL,所述的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系 包括SYBRIOyL、無 RNA酶水6yL和反轉(zhuǎn)錄的cDNA 2yL,所述的lncRNA-H19引物的含量為 LincRNA-H19-FlyL、LincRNA-H19-R lyL〇
【文檔編號】C12Q1/68GK105969897SQ201610578875
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月21日
【發(fā)明人】何麗潔, 景蕊, 張曉敏, 胡晉平, 車明文, 石田田, 趙麗娟, 婁未娟
【申請人】中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)