新疆野扁桃tp-m13-ssr核心引物及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種新疆野扁桃TP?M13?SSR核心引物及其應(yīng)用，該引物具有擴(kuò)增穩(wěn)定、電泳條帶清晰、多態(tài)性豐富的優(yōu)點(diǎn)，利用在TP?M13?SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)過(guò)程中的一種基于熒光測(cè)序技術(shù)的高通量低成本分析技術(shù)體系，本發(fā)明公開(kāi)了新疆野扁桃TP?M13?SSR引物，它包括12對(duì)引物，本發(fā)明篩選出的12對(duì)TP?M13?SSR核心引物在新疆野扁桃基因組中分布均勻，帶型清晰容易判讀，同時(shí)適合普通變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)平臺(tái)和毛細(xì)管熒光檢測(cè)平臺(tái)檢測(cè)；多態(tài)性高；擴(kuò)增重復(fù)性好，可完全適用于新疆野扁桃遺傳多樣性分析、品種鑒定以及聚類(lèi)分析等方面的研究。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
新疆野扁桃TP-M13-SSR核心引物及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及的是基于新疆野扁桃全基因組序列開(kāi)發(fā)的TP-M13-SSR核心引物及其 應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]新疆野扁桃（Prunus tenella Batsch.syn Amygdalus nana L.or Amygdalus ledebouriana Schlecht.)屬于薔薇科李亞科桃屬扁桃亞屬植物，俗語(yǔ)稱(chēng)新疆野巴旦木，分 布于氣候寒冷、干旱的亞歐大陸中心地帶，我國(guó)僅在新疆北部的塔城和阿勒泰等地區(qū)的山 區(qū)有分布。新疆野扁桃已被列入中國(guó)優(yōu)先保護(hù)物種名錄和中國(guó)瀕危二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物，作 為一種野生珍稀瀕危植物資源，新疆野扁桃豐富了我國(guó)的物種基因?qū)殠?kù)，具有重要研究?jī)r(jià) 值。
[0003] 簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeats,縮寫(xiě)為T(mén)P_M13_SSRs)，又稱(chēng)微衛(wèi)星，普 遍并大量的隨機(jī)存在于生物群體的基因組中?？赏ㄟ^(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，縮寫(xiě)為PCR)擴(kuò)增并進(jìn)行檢測(cè)，是鑒定基因型常用的分子標(biāo)記方法之一。熒光分析 技術(shù)和多重PCR(multiplex PCR)技術(shù)的首次結(jié)合，是將尾巴引物(Tailed primer)引入到 短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat,STR)標(biāo)記體系中，獲得了比銀染等方法更加精確的觀 測(cè)結(jié)果。之后，在這一基礎(chǔ)上進(jìn)一步完善，通過(guò)將M13引物作為尾巴引物和通用引物，完美的 結(jié)合了焚光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)和TPHVI13-SSR技術(shù)，TP-M13_SSR(simple sequence repeat with tailed primer M13)技術(shù)就此成型。該技術(shù)不僅是TP-M13-SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)體系，同時(shí) 結(jié)合了常規(guī)的熒光測(cè)序技術(shù)，具有高通量、低成本、自動(dòng)化高、擴(kuò)增流程簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于，提供一種新疆野扁桃TP-M13-SSR核心引物及其應(yīng)用，該引物 具有擴(kuò)增穩(wěn)定、電泳條帶清晰、多態(tài)性豐富的優(yōu)點(diǎn)，利用在TP-M13-SSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)過(guò)程中 的一種基于熒光測(cè)序技術(shù)的高通量低成本分析技術(shù)體系，本發(fā)明公開(kāi)了新疆野扁桃TP-M13-SSR引物，它包括12對(duì)引物，本發(fā)明篩選出的12對(duì)TP-M13-SSR核心引物在新疆野扁桃基 因組中分布均勻，帶型清晰容易判讀，同時(shí)適合普通變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)平臺(tái)和 毛細(xì)管熒光檢測(cè)平臺(tái)檢測(cè)；多態(tài)性高;擴(kuò)增重復(fù)性好，可完全適用于新疆野扁桃遺傳多樣性 分析、品種鑒定以及聚類(lèi)分析等方面的研究。
[0005] 本發(fā)明所述的一種新疆野扁桃TP-M13-SSR核心引物，該核心引物為12對(duì)引物序 列：

[0042]注:下劃線部分序列為5 '端M13接頭。
[0043] 所述新疆野扁桃TP-M13-SSR核心引物的用途，利用12對(duì)TP-M13-SSR引物對(duì)96份新 疆野扁桃進(jìn)行PCR擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳。
[0044] 本發(fā)明所述的新疆野扁桃TP-M13-SSR核心引物，該12對(duì)TP-M13-SSR引物，是從引 物庫(kù)中篩選出的150對(duì)引物中挑選出來(lái)的，引物名稱(chēng)按照新疆野扁桃的拉丁名首字母縮寫(xiě) 加數(shù)字的順序編號(hào)的方式進(jìn)行命名。
[0045] 本發(fā)明所述新疆野扁桃TP-M13-SSR核心引物，本試驗(yàn)共使用3條引物進(jìn)行TP-M13- SSR的PCR擴(kuò)增，分別為T(mén)P-M13引物、SSR正向引物和熒光引物。本試驗(yàn)所用的SSR正向引物， 是基于野扁桃全基因組重測(cè)序設(shè)計(jì)的引物。其中，TP-M13引物是將初選的SSR引物的正向引 物分別和Ml 3的正向引物相連合成帶有Ml 3尾巴的引物，它包括12對(duì)引物，分別為:？1'-1、卩1'- 2、PT-3、PT-4、PT-5、PT-6、PT-7、PT-8、PT-9、PT-10、PT-11、PT-12，其核苷酸序列如附錄 I。熒 光引物為4種5'端帶有不同熒光標(biāo)記的M13正向引物，它包括4種熒光引物，分別為:FAM、 冊(cè)父、了411^、1?(^，其核苷酸序列如附錄11 ;
[0046]熒光引物序列表
[0047] 引物名稱(chēng):FAM
[0048] 序列：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0049] 引物名稱(chēng):HEX
[0050] 序列：TGTAAAACGACGGCCAGT [0051 ] 引物名稱(chēng):TAMRA
[0052] 序列：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0053] 引物名稱(chēng):R0X
[0054] 序列：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0055] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所述的新疆野扁桃TP-M13-SSR核心引物，篩選出的12 對(duì)TP-M13-SSR核心引物組在新疆野扁桃基因組中分布均勻、帶型清晰容易判讀，同時(shí)適合 普通變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)平臺(tái)和毛細(xì)管熒光檢測(cè)平臺(tái)檢測(cè)；多態(tài)性高;擴(kuò)增重復(fù) 性好，可用于新疆野扁桃遺傳多樣性分析、品種鑒定、聚類(lèi)分析等研究。
【具體實(shí)施方式】
[0056] 實(shí)施例1
[0057]準(zhǔn)備新疆野扁桃植物種質(zhì)材料：
[0058] a、早春季，選取健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的新疆野扁桃五個(gè)不同分布居群的材料樣本的新 鮮嫩葉，每份樣本以液氮冷凍后放入溫度一 70°C超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?，五個(gè)居群分布地 區(qū)，表1;
[0059] 表1新疆野扁桃五個(gè)居群分布地區(qū)
[0062] b、新疆野扁桃葉片基因組DNA的提?。?br>[0063] 采用改良的CTAB法提取新疆野扁桃葉片的基因組DNA，該方法對(duì)于干旱區(qū)生長(zhǎng)的 新疆野扁桃葉片材料DNA的提取有良好的效果，已申請(qǐng)并被授權(quán)了發(fā)明專(zhuān)利，專(zhuān)利號(hào)為ZL 2013 1 0236983.4。
[0064] 新疆野扁桃基因組TP-M13-SSR引物的開(kāi)發(fā)：
[0065] c、新疆野扁桃基因組序列的獲得:新疆野扁桃全基因組測(cè)序結(jié)果在LINUX系統(tǒng)中 自主開(kāi)發(fā)完成，生成數(shù)據(jù)庫(kù)約14.7M，共包含23627條序列；
[0066] d、新疆野扁桃全基因組序列中TP-M13-SSR序列的鑒定：在全數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行TP-M13-SSR位點(diǎn)搜索，搜索條件為：構(gòu)成重復(fù)基元的核苷酸數(shù)在2-3個(gè)，PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度在 100-400bp之間，從滿(mǎn)足條件的引物中隨機(jī)挑選出150對(duì)引物，在左引物前插入18bp的M13引 物后，對(duì)所選的150對(duì)引物進(jìn)行合成；
[0067] 新疆野扁桃基因組TP-M13-SSR引物的篩選：
[0068] e、選擇10份來(lái)自不同居群的新疆野扁桃樣品，用于檢測(cè)新疆野扁桃基因組TP-M13-SSR標(biāo)記的擴(kuò)增情況及多態(tài)性；
[0069] f、采用合成的150對(duì)引物，以10份材料的混合基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果， 篩選可穩(wěn)定擴(kuò)增、帶型清晰的引物；
[0070] PCR擴(kuò)增采用13yL反應(yīng)體系，含每種模板DNA 1.4yL(6ngAiL)，熒光引物1.6pmol，2 X Taq Mix 6yL，反引物1.6pmol，正引物0.4pmol，超凈水2yL，反應(yīng)程序?yàn)?溫度95°C預(yù)變性 5min;溫度95°C變性40s，溫度55°C退火45s，溫度72°C延伸40s，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán);溫度95°C 變性40s，溫度53°C退火45s，溫度72°C延伸40s，共10個(gè)循環(huán);溫度72°C延伸lOmin，溫度4°C 保存，獲得12對(duì)引物組；
[0071] 12對(duì)引物序列表

[0108]注:下劃線部分序列為5 '端M13接頭。
[0109] 實(shí)施例2
[0110] 利用12對(duì)TP-M13-SSR核心引物對(duì)96份新疆野扁桃進(jìn)行PCR擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳：
[0111] PCR擴(kuò)增在型號(hào)為ABI2720的PCR儀器上進(jìn)行，擴(kuò)增采用13yL反應(yīng)體系，含每種模板 DNA lyL(6ng/yL)，焚光引物 1.6pmol，2XTaq Mix 6yL，反引物 1.6pmol，正引物0.4pmol，超 凈水2.2yL。反應(yīng)程序?yàn)?溫度95°C預(yù)變性5min;溫度95°C變性40s，溫度55°C退火45s，溫度 72 °C延伸40s，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán);溫度95 °C變性40s，溫度53 °C退火45s，溫度72 °C延伸40s，共 1〇個(gè)循環(huán);溫度72°(：延伸1〇1^11，溫度4°(：保存；
[0112] 毛細(xì)管電泳按照以下步驟進(jìn)行:將FAM和HEX熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物用超純水稀釋30 倍，TAMRA和R0X熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物稀釋10倍;分別取等體積的上述4種稀釋后溶液混合，從 混合液中吸取lyL加入到DNA分析儀專(zhuān)用深孔板孔中，板中各孔分別加入lyL LIZ500分子量 內(nèi)標(biāo)和8.9yL去離子甲酰胺;將樣品在PCR儀上溫度95°C變性5min，取出，立即置于碎冰上， 冷卻lOmin以上，瞬時(shí)離心10s后置放到DNA分析儀上，DNA分析儀型號(hào)為:ABI3730XL;
[0113] 分析毛細(xì)管電泳結(jié)果:使用GeneMarker(V2.2.0)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，將TP-M13-SSR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度錄入EXCEL中，在參考TP-M13-SSR重復(fù)序列的寡核苷酸數(shù)目后，將數(shù)據(jù)換 成對(duì)應(yīng)的等位位點(diǎn)數(shù)據(jù)，通過(guò)MicroSatellite工具對(duì)于取整后的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校對(duì)，并統(tǒng) 計(jì)每對(duì)引物中出現(xiàn)的等位變異頻率和數(shù)據(jù)缺失率，并剔除缺失率大于20 %的引物，根據(jù)引 物信息，從中挑選包含多態(tài)性信息最豐富的引物，共12對(duì)，見(jiàn)表2,最終得到12對(duì)多態(tài)性較強(qiáng) 的 TP-M13-SSR引物。
[0114] 表2確定的12對(duì)TP-M13-SSR引物多樣性信息
[0116] 注:重復(fù)單元數(shù)據(jù)的右下角角標(biāo)數(shù)字為該堿基對(duì)在TP-M13-SSR引物序列中的重復(fù) 次數(shù)。
[0117] Na =等位基因數(shù)目；Ne =有效等位基因數(shù)目；He =期望雜合度;Ho =觀測(cè)雜合度；I =香農(nóng)信息指數(shù);Pic=多態(tài)性信息含量指數(shù);F=固定指數(shù)。
[0118] 本試驗(yàn)從合成的150對(duì)TP-M13-SSR引物中篩選出12對(duì)多態(tài)性較好的TP-M13-SSR引 物，引物序列長(zhǎng)度在134-292bp之間，多數(shù)引物為兩個(gè)堿基重復(fù)，只有PT-2是三堿基重復(fù);其 中，引物PT-1的擴(kuò)增片段最小，為134bp，其有效等位基因數(shù)、期望雜合值、觀測(cè)雜合值、香農(nóng) 指數(shù)等均為最低。引物PT-12的擴(kuò)增片段最大，為292bp，引物PT-6的有效等位基因數(shù)和香農(nóng) 指數(shù)為最尚；
[0119] 12對(duì)引物共檢測(cè)到等位基因數(shù)(Na)140,每對(duì)引物可檢測(cè)到的等位基因數(shù)平均為 12，范圍從7到19，不同的引物擴(kuò)增后所得的等位基因數(shù)相差不大。12對(duì)TP-M13-SSR引物的 期望雜合值(He)范圍為0.656-0.859，觀測(cè)雜合值(Ho)在0-0.281之間，期望雜合值的平均 數(shù)(0.760)比觀測(cè)雜合值的平均數(shù)(0.115)大。有效等位基因數(shù)(Ne)在3.796至9.580之間； 香農(nóng)指數(shù)（I)在1.213-2.014之間；固定指數(shù)(F)最小值為-0.164，最大值1。12對(duì)引物共檢測(cè) 到等位基因數(shù)(Na)65,每對(duì)引物可檢測(cè)到的等位基因數(shù)平均為5,范圍從4到8,不同的引物 擴(kuò)增后所得的等位基因數(shù)相差不大;共得到有效等位基因數(shù)(Ne)54個(gè)，其范圍為3-7,平均 值為4;其中，引物PT-25的所有數(shù)據(jù)指標(biāo)均為最高；
[0120] 用來(lái)衡量某基因位點(diǎn)等位變異程度高低的指標(biāo)，被稱(chēng)作多態(tài)性信息含量指數(shù) (PIC)，其中，高度多態(tài)位點(diǎn)的范圍為:PIC彡0.5;中度多態(tài)位點(diǎn)的范圍為:0.25<PIC<0.5; 低度多態(tài)位點(diǎn)的范圍為:PIC彡0.25。本試驗(yàn)自主開(kāi)發(fā)的12對(duì)TP-M13-SSR引物擴(kuò)增產(chǎn)物的位 點(diǎn)多態(tài)性信息含量在〇 . 605-0.843范圍內(nèi)，PIC最高為引物PT-6，最低為引物PT-3，平均值 0.791;其中有12個(gè)TP-M13-SSR引物的PIC值超過(guò)0.5的范圍，屬于高度多態(tài)性位點(diǎn)，在總位 點(diǎn)中占了 100%，表明這12對(duì)引物攜帶了大量的多態(tài)性信息。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種新疆野扁桃TP-M13-SSR核心引物，其特征在于該核心引物為12對(duì)引物序列： 引物名稱(chēng):PT-1 TP-M13引物序列（5'-3,）：TGTAAAACGACGGCCAGTGCACCGAATTCTCTCAGACC SSR正向引物序列（5 ' -3 '）： TTAATTAAACGCCGCCAAGA 引物名稱(chēng):PT-2 TP-M13引物序列（5'-3,）：TGTAAAACGACGGCCAGTCCCACCTATTATTTCAGCCAA SSR正向引物序列（5 ' -3 '）： TTGGAATGGAGCTTGGAAGT 引物名稱(chēng):PT-3 TP-M13引物序列（5'-3,）：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGACTTGCCTCAACAGAC SSR正向引物序列（5 '-3 '）： TCTTCTTTGTCTCTCGCTTGTG 引物名稱(chēng):PT-4 TP-M13引物序列（5 '-3 '）：TGTAAAACGACGGCCAGTGCGTGCATCTCTCTGGGTT SSR正向引物序列（5'-3,）：CATAACTGTAATCATCTTAAGTCTGGG 引物名稱(chēng):PT-5 TP-M13引物序列（5 '-3 '）：TGTAAAACGACGGCCAGTAATTCTCTCTGGGCTTTGGC SSR正向引物序列（5 ' -3 '）： GGACTGTAACCAGACACCTCATT 引物名稱(chēng):PT-6 TP-M13引物序列（5'-3,）：TGTAAAACGACGGCCAGTTGCATGATTGGCATGTATGTT SSR正向引物序列（5'-3,）：CATCAATCTGTGTATGCGGG 引物名稱(chēng):PT-7 TP-M13引物序列（5'-3,）：TGTAAAACGACGGCCAGTGGAAGTATTGCTTTGGTTTCCT SSR正向引物序列（5'-3,）：AAATGTGTCCTTATAGTCCCTTCG 引物名稱(chēng):PT-8 TP-M13 引物序列（5 ' -3 '）： TGTAAAACGACGGCCAGTAGACATCATTAGTTGCACCCAC SSR正向引物序列（5 ' -3 '）： GCTTCTCAAAGGAAGTGGCA 引物名稱(chēng):PT-9 TP-M13引物序列（5'-3,）：TGTAAAACGACGGCCAGTTTGGCAGCAGACTTGTTGAC SSR正向引物序列（5'-3,）:AGGACCATGGATAGTGCTCG 引物名稱(chēng):PT-10 TP-M13引物序列（5'-3,）：TGTAAAACGACGGCCAGTATCTGCCGAAGACTTGCATC SSR正向引物序列(5 ' -3 '）: AAAGAAGATGACCTGCCACG 引物名稱(chēng):PT-11 TP-M13引物序列（5'-3,）：TGTAAAACGACGGCCAGTCTTGCATGCTTAAATTAGGGC SSR正向引物序列(5 ' -3 '）: AAGCCTGAGCATCAGAAACAA 引物名稱(chēng):PT-12 TP-M13 引物序列（5 ' -3 '）： TGTAAAACGACGGCCAGTTTGATGTTTGAATAGGTCGAAGA SSR正向引物序列（5 ' -3 '）： CCACATGAACAAGGTGCAAG 注:下劃線部分序列為5 '端M13接頭。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述新疆野扁桃TP-M13-SSR核心引物的用途，其特征在于利用12對(duì) TP-M13-SSR引物對(duì)96份新疆野扁桃材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105969902SQ201610600667
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月27日
【發(fā)明人】曾斌, 劉夢(mèng)雯, 王建友, 夏江宏, 關(guān)鵬
【申請(qǐng)人】新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)