小西葫蘆黃花葉病毒rt-lamp檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】一種小西葫蘆黃花葉病毒RT?LAMP檢測試劑盒及檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟：S1使用由10％的乙酸乙酯、2～10％的二甲基甲硫胺和1M Tris?HClpH7.5構成的快速提取液，從待測樣品中提取總RNA，并作為RNA模板；S2使用設計的上游引物、下游引物及環(huán)引物，構建RT?LAMP反應體系；S3將所述RT?LAMP反應體系，置于61℃水域中，反應60分鐘，得到反應液；S4對所述反應液進行檢測。
【專利說明】
小西葫蘆黃花葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒及檢測方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種小西萌蘆黃花葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒及檢測方法，具體涉及 馬鈴薯Y病毒屬小西萌蘆黃花葉病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)RT_LAMP引物 組的篩選，ZYMV RT-LAMP檢測試劑盒的應用。
【背景技術】
[0002] 小西萌蘆黃花葉病毒(ZYMV)屬馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒屬的一員，為正單鏈 RNA病毒，病毒全長約9.6kb，主要侵染萌蘆科作物，在作物上部葉片產生明脈、花葉，是這些 作物上的主要病毒之一。該病毒主要通過摩擦接種、蚜蟲以非持久性途徑傳播，在我國的發(fā) 生有加重的趨勢，它與馬鈴薯X病毒屬病毒有協(xié)生作用，一旦復合侵染會引起寄主的嚴重癥 狀，導致大量減產甚至絕收。
[0003] 環(huán)介導的等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是根 據目的基因的6個特異區(qū)域，設計4-6條特異性引物，利用Bst DNA聚合酶在60~65°C等溫條 件下特異地擴增目的基因。LAMP擴增反應可在60分鐘之內完成，其擴增產物是和靶標反向 重復的莖環(huán)結構以及多環(huán)的菜花樣結構，反應過程中產生大量焦磷酸根離子，并形成焦磷 酸鎂白色沉淀。LAMP方法可以通過多種方法判斷結果，如反應后體系內是否存在白色沉淀 物、電泳結果是否具有梯狀條帶、加入SYBR Green I是否變成綠色等，具有檢測靈敏度高， 檢測方法簡單快速、儀器要求不高等特點。然而就引物設計方面，目前報道的文獻多是以在 線方式(Primer Explore)設計引物，應用范圍受到限制，根據LAMP原理自行設計多組引物 組，通過實驗結果選取最適引物組，構建LAMP檢測方法，這樣將會大大增加 LAMP的適用范 圍，具有更為廣泛的應用前景。
[0004] 自LAMP技術建立以來，該技術已經廣泛應用于對病菌、寄生蟲等的檢測，近年來在 動物病毒的檢測研究中逐漸推廣起來，然而對于植物病毒如小西萌蘆黃花葉病毒還沒有相 應的檢測試劑盒的報道，因此開發(fā)一種針對小西萌蘆黃花葉病毒的RT-LAMP試劑盒具有重 要的應用價值。

【發(fā)明內容】

[0005] ZYMV 檢測主要有 0了81八』1^八、1?1'-?〇?、1?1'-1168七6(1?〇?、代31-^1116 1?1'-?〇?等方法。 DTBIA靈敏度較低；而RT-PCR、RT-nested PCR和real-time RT-PCR核酸檢測技術需要昂貴 的專業(yè)儀器，且核酸擴增的時間較長。
[0006] 本發(fā)明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種快速小西萌蘆黃花葉 病毒RT-LAMP檢測方法。本發(fā)明人在堅持不懈的努力之下，發(fā)明了一種快速提取RNA待測樣 品的方法，并結合自己設計的引物，使用RT-LAMP檢測方法，能夠快速有效地檢測出小西萌 蘆黃花葉病毒。
[0007] 本發(fā)明提供
[0008] (1)一種小西萌蘆黃花葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括RT-LAMP引 物，所述RT-LAMP引物為：
[0009]
[0010] (2)如（1)所述的試劑盒，還包括小西萌蘆黃花葉病毒的RNA的快速提取液，所述快 速提取液由10%的乙酸乙酯、2~10%的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5構成。
[0011] (3)如(2)所述的試劑盒，其中，所述二甲基甲硫胺的體積濃度為6%。
[0012] 本發(fā)明還提供如下檢測小西萌蘆黃花葉病毒的方法，
[0013] (4) 一種小西萌蘆黃花葉病毒RT-LAMP檢測方法，其特征在于，包括以下步驟
[0014] S1使用由10%的乙酸乙酯、2~10%的二甲基甲硫胺和1M Tris-HCl pH7.5構成的 快速提取液，從待測樣品中提取總RNA，并作為RNA模板；
[0015] S2使用如（1)所述試劑盒，構建RT-LAMP反應體系，所述反應體系為20yL，包括:2 X 反應緩沖液(1?〇1(^1^，酶溶液化]\〇0.841^，40?111〇1/^上游引物卩1?0.841^，40?111〇1/^上游引 物81?0.841^，1(^111〇1/^1^下游引物卩3 0.441^，1(^111〇1/^1^下游引物83 0.441^，濃度均為 20pmolAiL的環(huán)引物LB0 · 8yL，RNA 模板 1 · 6yL，及去離子水(DW) 4 · 4yL;
[0016] S3將所述RT-LAMP反應體系，置于61°C水域中，反應60分鐘，得到反應液；
[0017] S4對所述反應液進行檢測。
[0018] (5)如(4)所述的RT-LAMP檢測方法，其中，所述二甲基甲硫胺的體積濃度為6%。
[0019] (6)如(4)所述的RT-LAMP檢測方法，其中所述S4步驟中是在所述反應液中加入加 入鈣黃綠素熒光染料，通過反應管內所產生的顏色變化判斷檢測結果。
[0020] 本發(fā)明根據ZYMV的基因序列設計RT-LAMP引物，通過實驗最終建立了 ZYMV的RT-LAMP檢測方法，為ZYMV的檢測提供了一種快速高效、特異靈敏的新方法，靈敏度高，比普通 RT-PCR靈敏度高10倍;并可通過肉眼觀察濁度或顏色反應直接進行結果判斷。該方法適用 于現場ZYMV的快速檢測。本研究的目的就是研制該病毒的快速高效、靈敏特異的檢測技術， 與以往研究的方法形成一個不同層次的檢測體系，使檢測人員根據不同條件和目的可以進 行廣泛有效的選擇，為萌蘆科作物種苗檢驗檢疫及生產田的病害監(jiān)測提供有效的技術支 持。
【附圖說明】
[0021] 圖1 RT-LAMP反應體系中，以本發(fā)明的RNA提取方法2提取的總RNA為模板，本發(fā)明 設計的4組引物反應后，反應液的凝膠電泳圖。
[0022 ]圖2最佳反應溫度擴增曲線。
[0023]圖3特異性實驗中擴增曲線結果。
[0024]圖4特異性試驗中顏色反應結果。
【具體實施方式】
[0025] 為解決上述技術問題，設計4套用于檢測ZYMV的引物組，包括引物組1的正向外引 物F3-1的序列為SEQ ID N0.1，反向外引物B3-1的序列為SEQ ID勵.2;正向內引物？1?-1的 序列為SEQIDN0.3，反向內引物BIP-l的序列為SEQIDN0.4;引物組2的正向外引物F3-2 的序列為SEQIDN0.5，反向外引物B3-2的序列為SEQIDN0.6 ;正向內引物FIP-2的序列為 SEQIDN0.7，反向內引物BIP-2的序列為SEQIDN0.8;引物組3的正向外引物F3-3的序列 為SEQIDN0.9，反向外引物B3-3的序列為SEQIDN0.10 ;正向內引物FIP-3的序列為SEQ IDN0.11，反向內引物BIP-3的序列為SEQIDN0.12;引物組4的正向外引物F3-4的序列為 SEQIDN0.13，反向外引物B3-4的序列為SEQIDN0.14;正向內引物FIP-4的序列為SEQID N0.15，反向內引物BIP-4的序列為SEQIDN0.16，以及環(huán)引物LB，具體序列見表1。
[0026] 表1引物序列
[0027]
[0028] Loopamp RNA擴增反應試劑盒、Loopamp反應管、Loopamp FD焚光檢測試劑購自日 本榮研化學株式會社，RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，其他試劑均為常 規(guī)分析純試劑。采用日本榮研化學株式會社生產的LA-320C實時濁度儀。
[0029]試驗例1核酸提取
[0030] 分別稱取感染ZYMV病毒或未感染的(對照用）的南瓜新生葉片O.lg，或者用鑷子獲 取相當于0. lg大小的南瓜新生葉片作為實驗用材料。
[0031] RNA提取方法1:使用RNA快速提取試劑盒（離心柱型）提取樣品總RNA，具體操作按 試劑盒說明進行。本試驗具體使用了QIAGEN Rneasy Mini kit提取RNA，也可以采取其它試 劑盒進行提取，或者通常實驗室提取方法提取RNA。
[0032] RNA提取方法2:采用本發(fā)明的試劑盒，更加快速簡便地提取RNA粗提液。具體是用 鑷子取南瓜新生葉片約o.lg，迅速置于研砵中，研砵中預先加入含有10%的乙酸乙酯、2~ 10%的二甲基甲硫胺和1M Tris-HClpH7.5構成的提取液5mL，并迅速研磨3min，然后靜置 2min，取1.6yL作為RNA模板。所述鑷子、研砵、研磨棒及其它試驗用具需要在DEPC水中浸泡 12小時后，150度烘烤6小時，然后取出放置于4°C冷藏備用。含有10%的乙酸乙酯、2~10% 的二甲基甲硫胺的1M Tris-HClpH7.5溶液為事先配好，高溫高壓消毒處理后，放置于4°C冷 藏備用。移液搶的槍頭以及各種反應管均使用RNase-free產品。
[0033]所述10%的乙酸乙酯的濃度是指100ml溶液中，含有10g乙酸乙酯，二甲基甲硫胺 的濃度同樣。
[0034]試驗例2RT-LAMP體系的建立及優(yōu)化
[0035] RT-LAMP反應體系按照Loopamp RNA擴增試劑盒說明，反應體系為20yL，包括：2X 反應緩沖液(RM) 1 OyL，酶溶液(EM) 0 · 8yL，40pmo 1 /yL 引物FIP 0 · 8yL，40pmo 1ΛΛ BIP0 · 8yL， lOpmol/yL F3 0.4yL，10pmolAxL B3 0.4yL，LB(濃度均為20pmolAiL)0.8yL，RNA模板 1·6μ L，及去離子水(DW)4.4yL。反應溫度分別設為59、61、63和65°(：，反應時間為6〇11^11。擴增反應 在實時濁度儀上進行，根據60min內出現擴增曲線的最短時間確定最佳反應溫度。
[0036] 小西萌蘆黃花葉病毒(ZYMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草脈帶 花葉病毒(TVBMV)及陰性對照(NC)的總RNA和水(作為空白對照，用BC表示)為模板進行RT-LAMP反應，體系中同時加入1 .OyL鈣黃綠素熒光染料（即Loopamp FD熒光檢測試劑），驗證該 方法的特異性。
[0037] RT-LAMP擴增產物（1)實時擴增曲線檢測:擴增進行時，如果有產物出現，反應液會 產生一定的濁度；濁度儀會將濁度信號收集，以擴增曲線的形式反映，從而對結果進行判 斷。（2)染料顏色反應檢測:在LAMP反應體系中加入lyL Loopamp FD試劑，反應結束后，肉眼 觀察反應液的熒光顏色反應。顯綠色判斷為陽性反應;若顯橙色判斷為陰性反應。
[0038]結果與分析 [0039 ] 1.最佳提取液的確定
[0040] 分別配制二甲基甲硫胺濃度為2%、4%、6%、8%、10%的并含有10%乙酸乙酯的 1M Tri s-HCl (pH7.5)溶液，配制方法為在100mL的容量瓶中，加入10g乙酸乙酯，以及2、或4、 或6、或8、或10g的二甲基甲硫胺，然后加入已經配好的1M Tris-HCl(pH7.5)并定容，得到二 甲基甲硫胺濃度為2% (或4%、或6%、或8%、或10%)的并含有10%乙酸乙酯的1M Tris-HCl(pH7.5)溶液。按照上述RNA提取方法2進行提取，并使用分光光度計測量A260和A280的 值，計算A260/A280比值，Rneasy Mini kit提取RNA作為陽性對照，其結果見表2。
[0041 ] 表2不同方法得到的RNA溶液的A260/A280比值
[0042]
[0043] 因此，本實施例中均使用二甲基甲硫胺濃度為6 %并含有10 %乙酸乙酯的1M Tr i s-HCl (pH7.5)溶液提取樣品RNA，但這并不限定于該濃度，本領域技術人員應該理解，其 它濃度的溶液所提取到的RNA同樣可以用于本發(fā)明的檢測，并取得同樣檢測效果。
[0044] 2.最佳引物組的確定
[0045]分別以RNA提取方法1和RNA提取方法2得到的RNA粗提液為模板，使用表1中4個引 物組，加入到試驗例2中的RT-LAMP反應體系，反應溫度設為61°C，反應60分鐘。結果無論是 明P種方法提取的RNA作為模板，引物組3擴增的梯狀條帶最清晰、最亮，因此選用引物組3為 最佳引物組，圖1顯示的是RNA提取方法2得到的RNA粗提液為模板得到的結果，圖1中符號Μ 是標記；1至4分別表示第1至4引物組。
[0046] 2.最佳反應溫度的確定
[0047]以RNA提取方法2得到的總RNA為模板，進行RT-LAMP反應，實時濁度儀輸出的擴增 時間曲線結果如圖2。由圖中曲線可以看出，RT-LAMP在59、61、63和65°C的反應溫度下，分別 在約42、34、40和48min時產生了擴增曲線。根據現場檢測時間盡可能短的要求，確定61°C為 最佳反應溫度。
[0048] 3 .RT-LAMP特異性實驗
[0049] 小西萌蘆黃花葉病毒(ZYMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草脈帶 花葉病毒(TVBMV)陽性材料及健康南瓜新生葉片（陰性對照，用NC表示)為臨沂大學生物試 驗中心保存的標本，從_30°C冰箱中取出這些標本，直接用鑷子取出約O.lg葉片，按照本發(fā) 明的RNA提取方法2得到總RNA。以總RNA為模板進行RT-LAMP反應，溫度為61 °C，時間為 60min。體系中加入鈣黃綠素熒光染料以使得反應結束后可以通過反應管內所產生的顏色 變化判斷是否擴增，結果如圖3所示。由圖3可以看出，只有ZYMV能夠檢測到擴增曲線，其他 樣品在反應時間內都未檢測到擴增曲線。反應結束后，加入ZYMV總RNA的反應管顯綠色，判 斷為陽性;而其他反應管均顯橙色，判斷為陰性，結果如圖4所示。擴增曲線結果與顏色反應 的結果一致，表明本研究所建立的RT-LAMP檢測方法具有高度的特異性，檢測結果十分準 確。
[0050] 本發(fā)明在建立ZYMV的RT-LAMP檢測方法過程中，采用了日本Eiken Chemical公司 研發(fā)配制的LoopampRNA擴增試劑盒，簡化了實驗反應前的準備工作，同時保證了實驗的質 量。在結果分析方面，研究使用了LA-320C實時濁度儀，可對實驗結果定量分析。另外，通過 在RT-LAMP反應體系中加入試劑盒配套的鈣黃綠素熒光染料，使得不開蓋也可觀察到反應 所產生的顏色變化，避免了二次污染，保證了結果的準確性。另外，使用本發(fā)明的RNA快速提 取液，可以在現場快速檢測，并現場得到結果，而不需要進入實驗室使用Rneasy Mini kit 提取RNA。本發(fā)明的RNA快速提取液為二甲基甲硫胺濃度為6 %并含有10 %乙酸乙酯的1M Tri s-HCl (pH7.5)溶液，雖然在本發(fā)明中能夠快速提取ZYMV病毒RNA的機理還不明確，但是 根據分析，由于其具有高極性，能夠使ZYMV病毒RNA快速釋放，并在RNA分解前加入到RT-LAMP反應體系，從而能夠順利作為模板，進行RT-LAMP擴增。該機理將在今后的試驗中作進 一步的闡明。
[0051 ]在建立針對某種病毒LAMP檢測方法時，最重要的是特異引物的設計，而引物是否 特異決定于所選序列的比對結果是否特異。因此，一定要在引物設計的前期做好充足的準 備工作，利用序列分析軟件將目的序列篩選好，然后將序列進行手動處理后再上傳至引物 設計服務器設計引物，才能夠得到較為理想的引物組。在進行結果檢測方面，若有條件盡量 使用實時濁度儀，可以對結果進行定量分析，保證結果的準確性;同時，在進行結果檢測時， 一定盡量避免開蓋檢測，防止產生二次污染導致假陽性結果出現。
【主權項】
1. 一種小西萌蘆黃花葉病毒RT-LAMP檢測試劑盒，其特征在于，包括RT-LAMP引物，所述 RT-LAMP引物為： 上游外引物FIP序列SEQIDN0.11;上游內引物BIP序列SEQIDN0.12; 下游外引物F3序列SEQ ID N0.9;下游外引物B3序列SEQ ID N0.10; 以及環(huán)引物LB序列SEQ ID NO. 17。2. 如權利要求1所述的試劑盒，還包括小西萌蘆黃花葉病毒的RNA的快速提取液， 所述快速提取液由10%的乙酸乙酯、2~10%的二甲基甲硫胺和1M Tris-HCl pH7.5構 成。3. 如權利要求2所述的試劑盒，其中，所述二甲基甲硫胺的濃度為6%。4. 一種小西萌蘆黃花葉病毒RT-LAMP檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 S1使用由10%的乙酸乙酯、2~10%的二甲基甲硫胺和1M Tris-HCl pH7.5構成的快速 提取液，從待測樣品中提取總RNA，并作為RNA模板； S2使用如權利要求1所述試劑盒，構建RT-LAMP反應體系，所述反應體系為20yL，包括:2 X反應緩沖液10yL，酶溶液0.8yL，40pmo 1/yL上游引物FIP 0.8yL，40pmo 1 AxL上游引物 BIP0 · 8yL，1 Opmo 1 /yL下游引物F3 0 · 4yL，1 Opmo 1 /VL下游引物B3 0 · 4yL，20pmo 1 /VL環(huán)引物 LBO. 8yL，RNA 模板 1.6yL，及去離子水4.4yL; S3將所述RT-LAMP反應體系，置于61°C水域中，反應60分鐘，得到反應液； S4對所述反應液進行檢測。5. 如權利要求4所述的RT-LAMP檢測方法，其中，所述二甲基甲硫胺的濃度為6 %。6. 如權利要求4所述的RT-LAMP檢測方法，其中，所述S4步驟中是在所述反應液中加入 加入鈣黃綠素熒光染料，通過反應管內所產生的顏色變化判斷檢測結果。
【文檔編號】C12Q1/70GK105969912SQ201610498696
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月29日
【發(fā)明人】王瑩
【申請人】臨沂大學