作為egfr-t790m激酶抑制劑的取代的嘧啶類(lèi)化合物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種新型的嘧啶類(lèi)化合物及其衍生物、藥學(xué)上可接受的鹽、前藥和水合物。本發(fā)明的這些化合物及及其組合物具有蛋白激酶抑制活性并且將有益于蛋白激酶介導(dǎo)的疾病或者病癥的治療。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
作為EGFR-T790M激酶抑制劑的取代的嘧啶類(lèi)化合物
[0001] 交叉引用
[0002] 本發(fā)明要求2014年2月4日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)申請(qǐng)?zhí)枮?1/965,584的權(quán)益， 并全文引入作為參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明針對(duì)激酶抑制劑及其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、水合物、前藥和代謝 物，其制備方法，以及這些化合物在治療激酶介導(dǎo)的諸如癌癥的疾病和病癥上的用途。
【背景技術(shù)】
[0004] 蛋白激酶代表了催化靶蛋白質(zhì)底物的磷酸化的一個(gè)大家族酶。磷酸化通常是指磷 酸基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)底物的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。由于它們?cè)谠S多細(xì)胞過(guò)程中都有活性，蛋白激 酶已經(jīng)成為重要的治療靶點(diǎn)。
[0005] 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)是在腫瘤中廣泛分布的一類(lèi)生長(zhǎng)因子，能夠刺激癌細(xì)胞 增生、阻斷細(xì)胞凋亡、激活侵襲和轉(zhuǎn)移以及刺激血管生成（C i t r i等， Nat · Rev · Mol .Cell.Biol.7:505，2006; Hynes等，Nat · Rev · Cancer 5:341，2005)。EGF受體 (EGFR或ErbB)是屬于四種相關(guān)受體家族的一種跨膜的酪氨酸激酶受體。大多數(shù)的人類(lèi)上皮 性腫瘤通過(guò)這類(lèi)家族的生長(zhǎng)因子和受體的功能性激活來(lái)標(biāo)記（Ciardiel 1〇等，New Eng. J.Med. 358:1160，2008)，因此EGF和EGFR是癌癥治療的天然靶體。人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受 體(HER)酪氨酸激酶家族是由四種結(jié)構(gòu)相關(guān)的細(xì)胞受體:表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR;HER1)、 HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4。
[0006] EGFR抑制劑埃羅替尼和吉非替尼以及雙重EGFR/HER2抑制劑拉帕替尼是FDA批準(zhǔn) 的對(duì)于多重實(shí)體瘤癌癥有效的癌癥藥物。然而，它們的療效同時(shí)受藥物抗性的限制，這些藥 物抗性隨著治療過(guò)程頻繁出現(xiàn)。EGFR的激酶區(qū)域的點(diǎn)突變以及旁路信號(hào)途徑的上調(diào)是在用 吉非替尼和埃羅替尼治療的患者中經(jīng)常觀察到抗性機(jī)制。守門(mén)基因位置的一個(gè)點(diǎn)突變，在 EGFR激酶區(qū)域的T790M，占獲得抗藥性的將近50%。
[0007] 因此，能夠?qū)σ种频鞍准っ?如EGFR T790M活性)具有提高的療效或克服藥物抗性 的化合物是極其渴望的。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明提供了具有通式I的化合物：
[0011] 或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥或者立體異構(gòu)體或者互變異構(gòu)體或 者代謝物，其中：
[0012] R1 為氫基、d-C6 烷氧基、F、C1 或 CF3;
[0013] R2 為 d-C6 烷基或-C(0)R3;
[0014] R3 為 d-C6 烷基；
[0015] 條件是當(dāng)R1為d-C6烷氧基時(shí)，R2不是-C(0)R 3。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含上述通式I的化合物和一種藥學(xué)上可接受的載體的藥物 組合物。
[0017] 本發(fā)明更近一步地提供了用于調(diào)節(jié)激酶信號(hào)傳導(dǎo)的方法，包括向一個(gè)哺乳動(dòng)物受 試者施用治療有效量的具有上述通式I的任意一種化合物。
[0018] 本發(fā)明的具體描述
[0019] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中提供了具有通式I的化合物：
[0021]或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥或者立體異構(gòu)體或者互變異構(gòu)體或 者代謝物，其中：
[0022] R1 為氫基、&_〇5 烷氧基、F、C1 或 CF3;
[0023] 1?2為&-〇5 烷基或-C(0)R3;
[0024] 護(hù)為&-〇5烷基；
[0025] 條件是當(dāng)#為&-〇5烷氧基時(shí)，R2不是-C(0)R3。
[0026] 在某些實(shí)施方式中，R1為氫基。在另外的實(shí)施方式中，R2為甲基或乙基。在其他的實(shí) 施方式中，R 3為甲基。在一些實(shí)施方式中，R1為甲氧基且R2為甲基或乙基。在另外的實(shí)施方式 中，通式I的化合物的氘豐度大約為1%。在另外的實(shí)施方式中，一些選定的化合物的氘豐度 至少1%。
[0027]在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了選自下組但不限制于下組的化合物：


[0031]
或者他們的藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥或 者代謝物。在一些實(shí)施方式中，這些選定的化合物以藥學(xué)上可接受的鹽的形式存在。在一些 實(shí)施方式中，這些選定的化合物以溶劑的形式存在。在其他的實(shí)施方式中，這些選定的化合 物以代謝物的形式存在。在一些實(shí)施方式中，這些選定的化合物以立體異構(gòu)體的形式存在。 在另外的實(shí)施方式中，這些選定的化合物以互變異構(gòu)體的形式存在。在其他的實(shí)施方式中， 這些選定的化合物以前藥的形式存在。在另外的實(shí)施方式中，這些選定的化合物的氘豐度 大約為1 %。在另外的實(shí)施方式中，這些選定的化合物的氘豐度至少1 %。
[0032] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，該藥物組合物包括本發(fā)明的 具有通式I的化合物和一種藥學(xué)上可接受的載體。在某些實(shí)施方案中，這些組合物用于治療 由蛋白激酶調(diào)控的一類(lèi)疾病。在某些實(shí)施方案中，這些組合物用于治療一種高度增殖性的 病癥。在另外的實(shí)施方案中，所述的藥物組合物適于口服給藥、腸胃外給藥或靜脈給藥。
[0033] 在一些實(shí)施方式中，具有通式I的化合物通過(guò)將該化合物作為藥物組合物用于治 療受試者。為了這個(gè)目的，在一個(gè)實(shí)施方式中，這些化合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦 形劑結(jié)合來(lái)形成一種合適的組合物，包括載體、稀釋劑或助劑，這些將在此詳細(xì)描述。
[0034] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)激酶信號(hào)傳導(dǎo)的方法，包括向哺乳動(dòng) 物受試者施用治療有效量的具有通式I的化合物。
[0035] 在其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于治療或預(yù)防一種HER激酶(包括所有 的突變激酶)街道的病癥，所述的方法包括向哺乳動(dòng)物受試者施用治療有效量的具有通式I 的化合物。
[0036] 在另外一個(gè)方面，本發(fā)明在此提供了一種抑制EGFR激酶的方法，所述的方法包括 向哺乳動(dòng)物受試者施用治療有效量的具有通式I的化合物。
[0037] 在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于治療腫瘤的方法，包括向需要治療的哺 乳動(dòng)物受試者施用治療有效量的具有通式I的化合物。在某些實(shí)施方案中，所述的腫瘤選自 肝癌、皮膚癌、白血病、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、胃腸道間質(zhì)癌、實(shí)體瘤癌、骨髓瘤、乳腺癌、胰腺 癌、非小細(xì)胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、肝細(xì)胞癌、甲狀腺癌、膀胱癌、結(jié)腸直腸癌和前列腺癌。 在某些實(shí)施方案中，所述的癌癥為非小細(xì)胞肺癌。在某些實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括施 用一種或多種抗腫瘤制劑。
[0038]在其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防一種高度增殖性的病癥，該 方法包括向哺乳動(dòng)物受試者施用治療有效量的具有通式I的化合物。
[0039]下述的定義將有助于理解描述在此的本發(fā)明。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"烷基"旨在包括線性的、分支的以及環(huán)狀的碳?xì)浠鶊F(tuán)，它們僅僅包含單一的 碳-碳鍵且可以是未被取代的或者任選地被一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)所取代。烷基基團(tuán)優(yōu)選的鏈 長(zhǎng)為1到6個(gè)碳原子。Q-C6烷基旨在包括&、(：2、(： 3、〇4、(：5和(：6烷基基團(tuán)。烷基可以是被取代的 或者未被取代的。典型的取代烷基基團(tuán)包括環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、羥基、烷氧基、芳 氧基、巰基、烷硫基、芳硫基、氰基、鹵素、羰基、硫代羰基、0-氨甲?；?、N-氨甲?；?-硫代 氨甲?；?、N-硫代氨甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、C-駿基、〇-駿基、硝基、娃烷基、氨基和-NR XRY，其中，Rx和RY各自獨(dú)立地選自氫基、烷基、環(huán)烷基、芳基、羰基、乙?；?、磺酰基、三氟甲 磺酰基以及結(jié)合的五元或六元雜脂環(huán)。說(shuō)明性的取代烷基基團(tuán)包括但不限于氟甲基、二氟 甲基、三氟甲基、氨甲基、氨乙基、羥甲基、甲氧基甲基、2-氟乙基和2-甲氧基乙基等。
[0041] 術(shù)語(yǔ)"烷氧基"指的是一個(gè)-0_(烷基)和一個(gè)-0_(未取代的環(huán)烷基)基團(tuán)。C1-C6烷 氧基旨在包括Q-C6烷基基團(tuán)，其中，&-〇5烷基的定義如上所述。代表性的實(shí)例包括但不限 于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環(huán)丙氧基、環(huán)丁氧基、環(huán)戊氧基、環(huán)己氧基等等。
[0042]鹵素指氟、氯、溴和碘。
[0043] 本發(fā)明還包括本發(fā)明的化合物的同位素標(biāo)記化合物，其中，一個(gè)或多個(gè)原子被具 有相同原子序數(shù)、但原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)與自然界中普遍發(fā)現(xiàn)的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同的原 子取代。適于包含在本發(fā)明的化合物中的同位素的實(shí)例包括氫（如氘)和碳(如 13c)的同位 素。本發(fā)明的某些同位素標(biāo)記的化合物，例如，那些包含一種放射性同位素的化合物在藥物 和/或基體組織分布研究中是非常有用的。用較重同位素（如到)置換可能提供一定的治療 優(yōu)勢(shì)，這是由更大的代謝穩(wěn)定性引起的；例如，體內(nèi)半衰期的增加或者是劑量要求的降低， 因此在一些情況下會(huì)更加優(yōu)選。本發(fā)明中的同位素標(biāo)記的化合物一般可以用本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的傳統(tǒng)方法或者和表述在此的方法類(lèi)似的過(guò)程進(jìn)行制備，使用一種適當(dāng)?shù)耐凰貥?biāo) 記的試劑代替所用的非標(biāo)記的試劑。
[0044] 術(shù)語(yǔ)"包括"是指開(kāi)放性的，包括指出的組分，但是不排除其他的元素。
[0045] 當(dāng)用于具有通式I的一種化合物時(shí)，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的"是指該化合物的這樣 一種形式，該形式對(duì)于受試者的給藥是安全的。例如，本發(fā)明化合物的游離堿、鹽形式、溶劑 化物、水合物、前藥或者是衍生物的形式是藥學(xué)上可接受的，它們已經(jīng)被政府機(jī)構(gòu)或者監(jiān)管 機(jī)構(gòu)(如美國(guó)食品和藥物管理局FDA)批準(zhǔn)通過(guò)口服給藥或者其他給藥路徑用于哺乳動(dòng)物。
[0046] 術(shù)語(yǔ)"衍生物"在此被廣泛地解釋?zhuān)抑荚诎景l(fā)明的化合物的鹽形式、本發(fā)明 的化合物的酯形式、或者是任何其他的化合物，當(dāng)向患者施用該其他的化合物時(shí)能夠提供 (直接或間接)本發(fā)明的化合物、或者本發(fā)明化合物的代謝物或殘留物，利用調(diào)控某激酶活 性的能力進(jìn)行表征。
[0047] 在此使用的術(shù)語(yǔ)"代謝物"指當(dāng)將一種新型的化合物給藥于哺乳動(dòng)物受試者時(shí)由 該化合物的代謝產(chǎn)生的生理活性化合物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)對(duì)化合物的代謝物進(jìn) 行鑒定。
[0048]在此使用的術(shù)語(yǔ)"前藥"指示一種化合物，當(dāng)將該化合物給藥于受試者時(shí)能夠提供 (直接或者間接)本發(fā)明的化合物。藥物前體的實(shí)例包括酯化的或者羥基化的化合物，其中， 所述的酯基或者羥基基團(tuán)能夠在體內(nèi)斷裂，如在腸道內(nèi)，從而產(chǎn)生一種依據(jù)通式I的化合 物。在此使用的一種"藥學(xué)上可接受的藥物前體"指的是一種在藥學(xué)上是可接受的藥物前 體。
[0049]在此使用的術(shù)語(yǔ)"賦形劑"指除了活性藥物成分(API)外的任何藥學(xué)上可接受的添 加劑、載體、助劑或其他合適的輔料，通常出于制成制劑和/或給藥的目的將其包括在內(nèi)。 "稀釋劑"和"助劑"描述在下文中。
[0050] 在此使用的術(shù)語(yǔ)"治療（treat)"、"用于治療（treating)"、"治療（treatment)"和 "治療(therapy)"指的是治療，包括但不限于治愈性治療、預(yù)防性治療和防止性治療。預(yù)防 性治療一般包括預(yù)防患者中疾病的一起發(fā)生或者延遲病癥的臨床前明顯階段的發(fā)作。 [0051]詞語(yǔ)"治療有效量"是指量化每種藥劑的用量，經(jīng)過(guò)該用量的治療在疾病嚴(yán)重性和 發(fā)生頻次方面能夠達(dá)到改善的目標(biāo)，同時(shí)避免典型的與替代療法相關(guān)的副作用。在一種實(shí) 施方案中，所述的有效量是以單劑量的形式給藥或者是多劑量的形式給藥。
[0052]在標(biāo)準(zhǔn)參考書(shū)中描述了通過(guò)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)功能基團(tuán)、保護(hù)基團(tuán)本身以及保護(hù)基團(tuán) 的去除反應(yīng)(通常稱(chēng)作"去保護(hù)"），例如，J.F.W.McOmie的《有機(jī)化學(xué)中的保護(hù)基團(tuán)》，納姆出 版社，倫敦和紐約（1973);T.W.Greene的《有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)》，威利，紐約（1981);以及 《多肽》，第三卷，E. Gross和J. Meienhof er編輯，學(xué)術(shù)出版社，倫敦和紐約（1981)。
[0053]所有在此描述的合成步驟都可以在已知的反應(yīng)條件下進(jìn)行，優(yōu)選地在描述在此的 步驟下進(jìn)行，在不存在或者存在(通常情況下)溶劑或者稀釋劑的條件下進(jìn)行。
[0054]本發(fā)明進(jìn)一步包括"中間體"化合物，包括在得到最終希望的化合物前通過(guò)所描述 的合成步驟產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)，無(wú)論是否被分離出來(lái)。從執(zhí)行瞬態(tài)起始原料的步驟中產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)、 在所描述的方法中的任何階段的分支產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)、以及在反應(yīng)條件下形成初始原料的結(jié)構(gòu) 均包含在本發(fā)明的"中間體"中。更進(jìn)一步地，使用以活性衍生物或鹽形式的起始原料產(chǎn)生 的結(jié)構(gòu)、或者依據(jù)本發(fā)明的方法可以獲得的化合物產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)、以及在原位處理本發(fā)明的 化合物產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)都在本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。
[0055]新的起始原料和/或中間體，以及他們的制備方法同樣是本發(fā)明的主題。在選擇的 實(shí)施方案中，使用這些起始原料和選擇的反應(yīng)條件來(lái)得到希望的化合物。
[0056] 本發(fā)明的起始原料是已知的，或市場(chǎng)上可以買(mǎi)到的，或者是可以用類(lèi)似于本領(lǐng)域 熟知的方法進(jìn)行合成的。許多起始原料可以根據(jù)已知的方法進(jìn)行制備，尤其可以使用描述 在實(shí)例中的方法進(jìn)行制備。在合成起始原料中，在某些情況下功能基團(tuán)在必要時(shí)用合適的 保護(hù)基團(tuán)保護(hù)。前面描述了保護(hù)基團(tuán)的介紹和去除。
[0057] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的化合物還以多個(gè)互變異構(gòu)體的形式表示。本發(fā)明明確 包括所有描述在此的互變異構(gòu)體的形式。
[0058]在一種實(shí)施方案中的化合物還以順式-或反式-、E_或Z-雙鍵異構(gòu)體形式存在。所 有這種化合物的所述異構(gòu)體的形式均明確包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0059] 適應(yīng)癥
[0060] 本發(fā)明提供了可以調(diào)控一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的化合物，包括但不限于EGFR 和/或其所有的突變體，如EGFR-T790M。
[0061] 術(shù)語(yǔ)"調(diào)控"是指所述途徑(或者途徑的一部分)的功能活性在具有通式I的化合物 與沒(méi)有所述化合物時(shí)其正常的活性相比發(fā)生了變化。這種作用包括調(diào)控的任何特性或程度 的改變，包括:增加、激動(dòng)、加強(qiáng)、增強(qiáng)、促進(jìn)、刺激、降低、阻斷、抑制、減少、減弱、詰抗等。
[0062] 本發(fā)明的化合物還可以調(diào)控一種或多種下述過(guò)程，包括但不限于:例如，細(xì)胞生長(zhǎng) (包括，例如分化、細(xì)胞成活、和/或增殖）、腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(包括，例如，分化、細(xì)胞成活、和/或 增殖）、腫瘤退化、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)(包括，例如分化、細(xì)胞成活、和/或增殖）、血管生成(血管生 長(zhǎng)）、淋巴血管生成(淋巴血管生長(zhǎng)）、和/或血細(xì)胞生成(例如，T-或B-細(xì)胞發(fā)育、樹(shù)突狀細(xì)胞 的發(fā)育等）
[0063]盡管不希望被任何理論或作用機(jī)理束縛，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物具有調(diào)控激酶 活性的能力。然而，本發(fā)明的方法不限于任何具體的機(jī)理或者這些化合物是如何實(shí)現(xiàn)他們 的治療效果的。術(shù)語(yǔ)"激酶活性"是指在γ-磷酸基從三磷酸腺苷(ατρ)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)底物中 的一種氨基酸殘基(例如，絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸)上的催化活性。化合物可以調(diào)控激酶活 性，例如，通過(guò)直接與ΑΤΡ競(jìng)爭(zhēng)所述激酶的ΑΤΡ結(jié)合口袋來(lái)抑制激酶活性，通過(guò)在酶的結(jié)構(gòu)上 產(chǎn)生一個(gè)構(gòu)象變化從而影響它的活性(例如，通過(guò)破壞具有生物活性的三維結(jié)構(gòu)），通過(guò)結(jié) 合并封鎖所述激酶處于非活性構(gòu)象。
[0064]如以上所述，在本發(fā)明中定義的化合物具有生物活性。可以對(duì)這些特性進(jìn)行評(píng)估， 例如可以通過(guò)下文所列的一種或多種步驟進(jìn)行評(píng)估。
[0065]化合物的合成
[0066] 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員，具有通式I的化合物可以根據(jù)下面描述的方案中的步驟進(jìn) 行合成，其中，除非進(jìn)一步指明，取代基如上述通式I中所定義的。下述的合成方法僅是示例 性的，并且本發(fā)明的化合物還可以根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員的理解通過(guò)替換路線來(lái)合成。
[0067] 在本發(fā)明中，具有通式I的化合物的合成描述于方案1中?；衔顰的合成已經(jīng)被報(bào) 道用與描述于文獻(xiàn)(W02012061299)中類(lèi)似的方法進(jìn)行制備?；衔顱為商用的或按照文獻(xiàn) 的方法直接制備?；衔顰和B在溶劑中如二惡烷中與酸反應(yīng)如HC1或三氟乙酸反應(yīng)生成具 有通式I的化合物。
[0068] 方案 1
[0070] -種合成具有通式I的替代的方法可以通過(guò)描述于方案2中的反應(yīng)得到。商用的起 始原料C和D在醇類(lèi)溶劑如叔丁醇中的反應(yīng)得到化合物D。用化合物E取代化合物D中的氯將 得到具有通式I的化合物。
[0071] 方案 2
[0073] 化合物B的合成表述于方案3中。利用化合物4將化合物G的氟取代掉得到化合物Η。 化合物Η的硝基通過(guò)金屬如鐵的還原得到化合物Β。
[0074] 方案 3
[0076]【具體實(shí)施方式】說(shuō)明
[0077] 這些具體的描述僅以說(shuō)明性的目的提出，并非旨在作為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限 制。
[0078] 質(zhì)子NMR譜
[0079] 除非另外指明，所有的1H NMR光譜在瓦里安系列(Varian series)的Mercury 300 和400的儀器上或是布魯克系列400MHz的儀器上操作。鑒別如下，在所示的適宜溶劑中，所 有觀測(cè)的質(zhì)子都從四甲基硅烷(TMS)或其他內(nèi)標(biāo)至低場(chǎng)、以百萬(wàn)分之一 (ppm)形式記錄的。
[0080] 縮寫(xiě)
[0081 ] DMF是指N，N-二甲基甲酰胺。
[0082] DCM是指二氯甲烷。
[0083] DCE是指二氯乙烷。
[0084] DIPEA是指二異丙基乙胺。
[0085] THF指四氫呋喃。
[0086] TEA指三乙胺。
[0087] TFA指三氟乙酸。
[0088] EA指乙酸乙酯。
[0089] RT代表室溫。
[0090]實(shí)施例1:4-(4-乙基哌嗪-1-基)-2_甲氧基苯胺(化合物1)的制備。
[0092]步驟1、向 1-乙基哌嗪（1.68，14.0_〇1)和碳酸鉀(3.28,23.4!11111〇1)的01^(101^)的 溶液中加入4-氟-2-甲氧基-1-硝基苯(2.0g，11.7mmol)。反應(yīng)混合物在100°C下攪拌3天，然 后冷卻至室溫，用H 20稀釋并用乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，然后過(guò)濾和濃縮。 粗產(chǎn)物1-乙基-4-(3-甲氧基-4-硝基苯基)哌嗪不用進(jìn)一步純化直接用于下一步驟。
[0093] 步驟2、將1-乙基-4-(3-甲氧基-4-硝基苯基）哌嗪和NH4CI (1 · 3g，23 · 4mmol)溶解 于乙醇（20mL)和水(20mL)中。將反應(yīng)混合物加熱至50 °C，然后加入鐵(2.6g，46.8mmo 1)。得 到的反應(yīng)混合物加熱回流4小時(shí)，冷卻至50°C，過(guò)濾，然后用乙醇清洗殘留物。收集的濾液在 真空下蒸發(fā)，從而去除一些溶劑(至少一半）。將得到的溶液的pH調(diào)節(jié)至8-9并用乙酸乙酯萃 取(6x30mL)。合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥，然后濃縮。用快速柱色譜法在硅膠柱上純化 得到4-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基苯胺(720mg)。
[0094]實(shí)施例2:4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯胺(化合物2)的制備。
[0096] 向 1_乙基哌嘆（2.1g，18.Ommol，1 · 2eq)和碳酸鐘（2 · lg，18 ·Ommol，1 · 2eq)的DMF (1 OmL)的溶液中加入1 -溴-4-硝基苯(3 · Og，15 · Ommo 1，1 · Oeq)反應(yīng)混合物在100 °C下攪拌3 天，然后冷卻至室溫，用H20稀釋并用乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，然后過(guò)濾和 濃縮。得到的殘留物用快速柱色譜法在硅膠柱上純化得到黃色油狀的1-乙基-4-(4-硝基苯 基)哌嗪(3.2g)。
[0097] 將1-乙基-4-(4-硝基苯基）哌嗪（3.28，11.9111111〇1，1.〇69)和冊(cè)4(：1(1.3 8， 23.8mmol，2.0eq)溶于乙醇（30mL)和水（30mL)。將反應(yīng)混合物加熱至50°C，然后加入鐵 (2.7g，47.6mmo 1，4. Oeq)。得到的反應(yīng)混合物加熱回流3小時(shí)，冷卻至50 °C，過(guò)濾，然后用乙 醇清洗殘留物。收集的溶液的溶劑大部分在真空下蒸發(fā)，然后將得到的溶液的pH調(diào)節(jié)至8-9。得到的溶液用乙酸乙酯萃取(3x100 mL)。合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。用 快速柱色譜法在硅膠柱上純化得到4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯胺(1.2g)。
[0098]實(shí)施例3:1 _(4_( 4-氨基苯基)哌嗪-1 -基）乙酮(化合物3)的制備方法。
[0100]向 1_(哌嘆-1-基）乙酬（2 · 3g，18 · Ommol，1 · 2eq)和碳酸鐘（4.2g，30 · Ommol, 2. Oeq) 的DMF(1 OmL)的溶液中加入1-溴-4-硝基苯(3 · Og，15 · Ommo 1，1 · Oeq)。反應(yīng)混合物在100 °C下 攪拌3天，然后冷卻至室溫，用H20稀釋并用乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，然后 過(guò)濾和濃縮。得到的殘留物用快速柱色譜在硅膠柱上純化得到黃色油狀的1-(4-(4-硝基苯 基)哌嗪-1-基）乙酮（1.8g)。收集的溶液的溶劑大部分在真空下蒸發(fā)，然后將得到的溶液的 pH調(diào)節(jié)至8-9。得到的溶液用乙酸乙酯萃取(3x 1 OOmL))。
[0101] 將 1-(4-(4-硝基苯基）哌嗪-1-基）乙酮（1.8g，7.2mmol，1.0eqWPNH4Cl(770mg， 14.4111111 〇1，2.0叫)溶解于乙醇(351^)和水(351^)中。將反應(yīng)混合物加熱至50°(：，然后加入鐵 (1.6g，28.8mmol，4.0eq)。得到的反應(yīng)混合物加熱回流4小時(shí)，冷卻至50°C，過(guò)濾，然后用乙 醇清洗殘留物。合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。用快速柱色譜法在硅膠柱上 純化得到1 _(4-( 4-氨基苯基)哌嗪-1 -基）乙酮（1.2g)
[0102] 實(shí)施例4:4-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-氟苯胺(化合物4)的制備。
[0104] 將2,4-二氯_卜硝基苯（2.(^，12.6111111〇1，1.〇69)加入到1-乙基哌嗪（1.78， 15.1臟〇1，1.269)和碳酸鉀(3.58,25.2臟〇1，2.069)的01^(1011^)溶液中。反應(yīng)混合物在100 °C下攪拌3天，然后冷卻至室溫，用H 20稀釋并用乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥， 然后過(guò)濾和濃縮。得到的殘留物用快速柱色譜法在硅膠柱上純化得到黃色油狀的ι-乙基-4-(3-氟-4-硝基苯基)哌嗪(2.9g)。
[0105] 將 1-乙基-4-(3-氟-4-硝基苯基）哌嗪（2.9g，11.5mmol，1.0eqWPNH4Cl(1.2g， 23.0111111 〇1，2.0叫)溶解于乙醇（151^)和水（151^)中。將反應(yīng)混合物加熱至50°(：，然后加入鐵 (2.6g，45.8mmol，4.0)。得到的反應(yīng)混合物加熱回流3小時(shí)，冷卻至50°C，過(guò)濾，然后用乙醇 清洗殘留物。收集的溶液的溶劑大部分在真空下蒸發(fā)，然后將得到的溶液的pH調(diào)節(jié)至8-9。 得到的溶液用乙酸乙酯萃取(3x100 mL)。合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。用快 速柱色譜法在硅膠柱上純化得到4-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-氟苯胺(1.3g)。
[0106] 實(shí)施例5:1-(4-(4-氨基-3-氟苯基)哌啶-1-基)乙酮(化合物5)的制備。
[0108] 將2,4_二氯-1-硝基苯(2.(^，12.5謹(jǐn)〇1，1.(^)加入至丨」1-(哌嗪-1-基）乙酮（1.6 8， 12.5mmol，1.0eq)和碳酸鉀（3.58,25.0_〇1，2.069)的01^(2011^)溶液中。反應(yīng)混合物在100 °C下攪拌過(guò)夜，然后冷卻至室溫，用H 20稀釋并用乙酸乙酯萃取。有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥， 然后過(guò)濾和濃縮。得到的殘留物用快速柱色譜法在硅膠柱上純化得到黃色油狀的1-(4-(3-氟-4-硝基苯基)哌嗪-1 -基）乙酮(2.4g)。
[0109] 將 1-(4-(3-氟-4-硝基苯基）哌嗪-1-基）乙酮（2.4g，8.96mmol，1.0eqWPNH4Cl (961mg，17·9mmol，2·Oeq)溶解于乙醇（35mL)和水（35mL)中。將反應(yīng)混合物加熱至50°C，然 后加入鐵(2. Og，35.8mmol，4. Oeq)。得到的反應(yīng)混合物加熱回流4小時(shí)，冷卻至50°C然后用 硅藻土過(guò)濾。濾餅用乙醇清洗。得到的溶液的溶劑大部分在真空下去除。隨后將溶液的pH調(diào) 節(jié)至8-9并用用乙酸乙酯萃取(3x100 mL)。合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。得 到的粗產(chǎn)品用快速柱色譜法在硅膠柱上純化得到1-(4-(4-氨基-3-氟苯基)哌啶-1-基）乙 酮(1.0g) 〇
[0110]實(shí)施例6:2-氯-4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯胺(化合物6)的制備。
[0112] 標(biāo)題化合物利用類(lèi)似于實(shí)施例4的方法制備，起始原料用1_(3_氯_4_硝基苯基)_ 4-乙基哌嗪和1-乙基哌嗪替代。
[0113] 實(shí)施例7:1-(4-(4-氨基-3-氯苯基)哌嗪-1-基)乙酮(化合物7)的制備。
[0115] 標(biāo)題化合物利用類(lèi)似于實(shí)施例5的方法制備，起始原料使用2-氯-4-氟-1-硝基苯 和1_(哌嗪-1-基）乙酮。
[0116] 實(shí)施例8:n-[3-[[2-[4-(4-乙酰基哌嗪-1-基)苯胺]-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基]氨 基]苯基]丙-2烯酰胺(化合物8)的制備。
[0118]在 0 °C 下向 2，4-二氯-5-(三氟甲基）嘧啶（325 · 5mg，1 · 5mmo 1，1 · Oeq)的 DCE/t-Bu0H (8mL/lmL)溶液中加入ZnCl2的乙醚（1 · 0M，3 · 3mL，3 · 3mmo 1，2 · 2eq)溶液。反應(yīng)混合液在0 °C 下攪拌1小時(shí)，然后加入1-(4-(4-氨基苯基）哌嗪-1-基）乙酮(400mg，1.84mmol，1.2eq)的 DCE/t-Bu0H(2mL/2mL)溶液，隨后逐滴加入DIPEA(213mg，1.65mmol，1. leq)。將反應(yīng)物在室 溫下攪拌兩天并用TLC監(jiān)控。在減壓條件下去除溶劑，然后將殘留物溶解于水/乙醇（26mL， 25%)并加熱到90°C。將溶液冷卻至室溫兩小時(shí)以上，過(guò)濾并干燥得到l-[4-[4-[[4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基]苯基]哌嗪-1-基]乙酮(560mg)。
[0119] 在0°C下向l-[4-[4-[[4-氯-5-(三氟甲基）嘧啶-2-基]氨基]苯基]哌嗪-1-基]乙 酮(400mg，1 .Ommol，1 .Oeq)和N-(3_甲甲基苯基）丙_2_稀酰胺（192mg，1 .Ommol，1 .Oeq)的1， 4-二惡烷(10mL)溶液中加入TFA(催化劑量）。反應(yīng)混合物加熱至室溫并攪拌過(guò)夜。用水猝滅 反應(yīng)。反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)至8-9,然后用乙酸乙酯（3x50mL)萃取混合物。合并有機(jī)層，用無(wú) 水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。用快速柱色譜法在硅膠柱上用EA純化粗產(chǎn)品得到粗產(chǎn)品 240mg。粗產(chǎn)品用乙醇（20mL)清洗得到N- [ 3- [ [ 2- [ 4- (4-乙?；哙?1 -基)苯胺]-5-(三氟 甲基）嘧啶-4-基]氨基]苯基]丙-2 烯酰胺（leOmgyH-NMRGOOMHzJMSO-dfOJlOJOppnKs， 1H)，9.51(s，lH)，8.73(s，lH)，8.32(s，lH)，7.74(s，lH)，7.63-7.65(d，J=8.4Hz，lH)， 7·33-7.40(m，3H)，7·13(s，1H)，6.68(s，1H)，6.44-6.48(m，lH)，6.25-6.29(d，J=16.4Hz， 1H)，5 · 76-5·78(d，J=10·0Hz，lH)，3.55-3.56(m，4H)，2.92-2·99(m，4H)，2.04(s，3H) .MS m/z 526[M+1],
[0120] 實(shí)施例9:N-[3-[[2-[4-(4-乙基哌嗪-1-基）苯胺]-5-(三氟甲基）嘧啶-4-基]氨 基]苯基]丙-2-稀酰胺(化合物9)的制備。
[0122] 在0°C下，向2，4-二氯-5-(三氟甲基）嘧啶（434mg，2 · Ommol，1 · Oeq)的DCE/t-Bu0H (8mL/ lmL)溶液中加入ZnCl2的乙醚(4.4mL，4.4mmo 1，2.2eq)溶液。在0 °C下將反應(yīng)溶液攪拌 1 小時(shí)并加入4-(4-乙基哌嗪-1-基）苯胺（410mg，2 .Ommol，1 .Oeq)的DCE/t_Bu0H(2mL/2mL) 溶液，隨后逐滴加入三乙胺（222mg，2.2mmol，1. leq)。將反應(yīng)物在室溫下攪拌過(guò)夜并用TLC 監(jiān)測(cè)。用水(30mL)猝滅反應(yīng)，然后用乙酸乙酯（3x50mL)萃取混合物。合并有機(jī)層，用無(wú)水硫 酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。用快速柱色譜法在硅膠柱上純化粗產(chǎn)品得到4-氯-N-[4-(4-乙基哌 嗪-1-基)苯基]-5-(三氟甲基)嘧啶-2-胺(200mg)。
[0123] 在0°C下，向4-氯-N-[4_(4-乙基哌嗪-1-基）苯基]-5-(三氟甲基）嘧啶-2-胺 (184mg，0.48mmol，1 · Oeq)和N-(3_氨基苯基）丙-2稀酰胺（91 · 5mg，0 · 48mmol，1 · Oeq)的 1，4_ 二惡烷（10mL)溶液中加入TFA(催化劑量）。反應(yīng)混合物加熱至室溫并攪拌過(guò)夜。用水猝滅反 應(yīng)并將反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)至8-9。得到的溶液用乙酸乙酯（3x30mL)萃取。合并有機(jī)層，用 無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。用快速柱色譜法在硅膠柱上用EA純化粗產(chǎn)品得到N-[3-[[2-[4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯胺]-5-(三氟甲基）嘧啶-4-基]氨基]苯基]丙-2稀酰胺（160mg)。 ? lH-NMR(400MHz，DMS0-d6)Jl0.02ppm(s，lH)，9.61(s，lH)，8.49(s，lH)，8.31(s，lH)，7.67 (s，lH)，7·37-7.29(m，4H)，7.04-7.00(m，lH)，6.90(d，J=8Hz，2H)，6·50-6.43(m，lH)， 6.28-6.23(m，lH)，5.76(d，J = 2Hz，lH)，4.12-4.08(m，lH)，3.19-3.11(m，7H)，2.4h2.36 (m，2H)，1.05(t，J = 7.2Hz，3H).MS m/z 512[Μ+1]·
[0124] 實(shí)施例10:N-[3-[[2-[4_(4-乙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-苯胺]-5-(三氟甲基）嘧 啶_4_基]氨基]苯基]丙-2-稀酰胺(化合物10)的制備。
[0126] 在0 °C 下向 2，4-二氯-5-(三氟甲基）嘧啶（434mg，2 · Ommo 1，1 · Oeq)的DCE/t-BuOH (8mL/ lmL)的溶液中加入ZnCl 2的乙醚(4.4mL，4.4mmo 1，2.2eq)溶液。反應(yīng)混合液在0 °C下攪 拌l小時(shí)，然后加入4-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-苯胺(470mg，2·0mmol，l·0eq的DCE/t-BuOH(2mL/2mL)溶液，隨后逐滴加入三乙胺（222mg，2 · 2mmol，1 · 1 eq)。將反應(yīng)物在室溫下攪 拌過(guò)夜并用TLC監(jiān)控。用水(30mL)猝滅反應(yīng)并用乙酸乙酯（3x30mL)萃取。合并有機(jī)層，用無(wú) 水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。用快速柱色譜法在硅膠柱上純化粗產(chǎn)品得到4-氯-N-[4-(4-乙 基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-苯基]-5-(三氟甲基)嘧啶-2-胺(200mg)。
[0127] 在0°C下向4-氯-N-[4_(4-乙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-苯基]-5-(三氟甲基）嘧啶-2 -胺（184mg，0 ·48mmol，1 · Oeq)和N-(3_氨基苯基）丙_2_稀酰胺（91 · 5mg，0 ·48mmol，1 ·Oeq) 的1，4-二惡烷（10mL)溶液中加入TFA(催化劑量he反應(yīng)混合物加熱至室溫并攪拌過(guò)夜。用 水猝滅反應(yīng)。反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)至8-9。得到的混合物用乙酸乙酯（3x30mL)萃取。合并有 機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并濃縮。用快速柱色譜法在硅膠柱上用EA純化粗產(chǎn)品得到N-[3-[[2-[4-(4_乙基哌嗪-1-基)-2-甲氧基-苯胺]-5-(三氟甲基嘧啶-4-基]氨基]苯基]丙-2-#_K(160mg)< 31H-MMR(400MHz，CDCl3)j8.32ppm(s，lH)，7.99-8.02(d，J = 7.2，lH)， 7.93(s，lH)，7.52(s，lH)，7.33-7.37(t，J = 8.0，lH)，7.22(s，2H)，6.88(s，lH)，6.55(d，J = 2.4，lH)，6.45-6.50(m，2H)，6.23-6.30(m，lH)，5.79-5.82(m，lH)，3.89(s，3H)，3.19-3.22 (t，J = 5.0,4H)，2.64-2.66(t，J = 5.0,4H)，2.51-2.53(m，2H)，2.04(s，3H)，1.15-1.18(t，J = 7.2,3H).MSm/z 542[M+l],
[0128] 實(shí)施例ll:N-[3-[[2-[4-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-氟-苯胺]-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基]氨基]苯基]丙-2-稀酰胺(化合物11)的制備。
[0130] 標(biāo)題化合物用類(lèi)似描述于實(shí)施例8中的步驟進(jìn)行合成。起始原料使用2,4_二氯-5-(三氟甲基)嘧啶和1-(4-(4-氨基-3-氟-苯基)哌嗪-1-基）乙酮。
[0131] 實(shí)施例12:N-[3-[[2-[4-(4-乙基哌嗪-1-基)-2-氯-苯胺]-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基]氨基]苯基]丙-2-稀酰胺(化合物12)的制備。
[0133] 標(biāo)題化合物用類(lèi)似描述于實(shí)施例8中的步驟進(jìn)行合成。起始原料使用2,4_二氯-5-(三氟甲基)嘧啶和1-[4-(4_氨基-3-氯-苯基)哌嗪-1-基]乙酮。
[0134] 實(shí)施例13:N-[3-[[2-[2-氯-4-(4-乙基哌嗪-1-基）苯胺]-5-(三氟甲基）嘧啶-4-基]氨基]苯基]丙-2-稀酰胺(化合物13)的制備。
[0136] 標(biāo)題化合物用類(lèi)似描述于實(shí)施例9中的步驟進(jìn)行合成。起始原料使用2,4_二氯-5-(三氟甲基)嘧啶和2-氯-4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯胺。
[0137] 實(shí)施例14:N-[3-[[2-[4-(4-乙基哌嗪-1-基)-2_氟-苯胺]-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基]氨基]苯基]丙-2-稀酰胺(化合物14)的制備。
[0139] 標(biāo)題化合物用類(lèi)似描述于實(shí)施例9中的步驟進(jìn)行合成。起始原料使用2,4_二氯-5-(三氟甲基)嘧啶和4-(4-乙基哌嗪-1-基)-4_氟-苯胺。
[0140] 生物學(xué)測(cè)試：
[0141] 如以上所述，在本發(fā)明中定義的化合物具有抗增殖活性?？梢詫?duì)這些特性進(jìn)行評(píng) 估，例如可以通過(guò)下文所列的一種或多種步驟進(jìn)行評(píng)估：
[0142] 測(cè)定受試化合物抑制EGFR (T790M/L858R)激酶活性的能力的體外試驗(yàn)：
[0143] 在衍生自BL21菌株的E.coli宿主中制備激酶標(biāo)記的T7噬菌體菌株。使E.coli生長(zhǎng) 至對(duì)數(shù)期并用T7噬菌體感染，然后在32°C下振動(dòng)培養(yǎng)直至裂解。離心得到的裂解物并過(guò)濾 去除細(xì)胞碎片。剩下的激酶在HEK-293細(xì)胞中生產(chǎn)并隨后用DNA標(biāo)記用于qPCR檢測(cè)。鏈霉親 和素包裹的磁珠用生物素化的小分子配體在室溫下處理30min，從而生成用于激酶檢測(cè)的 親和樹(shù)脂。用過(guò)量的生物素封閉配體磁珠然后用封閉液（SeaBl 〇Ck(PierCe)，l%BSA， 0.05%Tween20, ImM DTT)清洗以去除未結(jié)合的配體并減少非特異性結(jié)合。通過(guò)在lx結(jié)合緩 沖液（20%36381〇^^，0.171?83,0.05%了￥661120,6111101'1')中結(jié)合激酶、配體親和磁珠和 測(cè)試化合物來(lái)評(píng)價(jià)結(jié)合反應(yīng)。所有的反應(yīng)均在聚苯乙烯96孔板中進(jìn)行，終體積為0.135ml。 測(cè)試板在室溫下震蕩培養(yǎng)lh，然后用清洗緩沖液（lx roS，0.05 % Tween 20)清洗親和磁珠。 然后將磁珠重新分散于洗脫緩沖液（lx PBS，0.05 % Tween 20，0.5μΜ非生物素話(huà)的親和配 體），然后在室溫下震蕩培養(yǎng)30min。洗出液中的激酶濃度用qPCR進(jìn)行測(cè)量。
[0144] 每個(gè)測(cè)試化合物的11個(gè)點(diǎn)3倍連續(xù)稀釋液用100 %DMS0以100倍終測(cè)試濃度進(jìn)行配 制，然后在測(cè)試時(shí)稀釋到1 X (終DMS0濃度=1 % )。心值使用化合物的最高濃度=10，000ηΜ 來(lái)測(cè)定。如果初始的Kd測(cè)量值<0.5ηΜ(測(cè)試的最低濃度），則用一系列稀釋液從一個(gè)較低的 最高濃度開(kāi)始重新測(cè)量。當(dāng)Kd值為40,000ηΜ時(shí)表明Kd的測(cè)量值>30,000ηΜ。
[0145] 結(jié)合常數(shù)(Kds)使用希爾方程用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)劑量反應(yīng)曲線進(jìn)行測(cè)定：響應(yīng)值=背景 值+(信號(hào)值-背景值)/(l + (Kd_^/劑量希爾斜率設(shè)定為-1。使用非線性最小二乘 法結(jié)合結(jié)合Levenberg-Marquardt算法進(jìn)行曲線擬合。
[0146] 下面的表A列出了本發(fā)明代表性的化合物其在EGFR( T790M/L858R)測(cè)試中的活性。
[0147] 表A: EGFR (T7 90M/L8 58R)測(cè)試結(jié)果
[0149] 用于測(cè)定待測(cè)化合物抑制EGFR或EGFR(E746-A750del)激酶活性的能力的體外測(cè) 試在同上文描述的用于測(cè)定待測(cè)化合物抑制EGFR(E746-A750del)激酶活性的能力的體外 測(cè)試相似的條件下進(jìn)行。
[0150] 下面的表格B列出了本發(fā)明代表性的化合物和它們?cè)贓GFR和EGFR(E746-A750del) 激酶測(cè)試的活性。
[0151] 表B: EGFR(E746-A750de 1)測(cè)試結(jié)果
[0152]
[0153] 使用細(xì)胞增殖試驗(yàn)測(cè)定代表數(shù)量的化合物對(duì)于癌癥細(xì)胞系NCI-H1975的作用：
[0154] 1、在96孔板的每個(gè)孔中接種100μΙ含有5 X 103個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基，這里所述培養(yǎng)基 含有5%的FBS。
[0155] 2、24小時(shí)后，向每個(gè)孔中加入含有不同濃度的化合物的100μΙ新鮮培養(yǎng)基，其中， 在此加入的培養(yǎng)基不含F(xiàn)BS。
[0156] 3、當(dāng)用這些化合物處理細(xì)胞72小時(shí)后，向每個(gè)孔中加入20μ1 MTT(5mg/ml)，然后 將所述分析板在37°C下再培養(yǎng)4小時(shí)。
[0157] 4、在800g下離心所述分析板lOmin。吸去培養(yǎng)基，向每個(gè)孔中加入150μ1 DMS0。輕 輕地?fù)u晃分析板10分鐘。
[0158] 5、在酶標(biāo)儀中測(cè)量在570nm下的吸光度。
[0159] 6、IR% = (WC-WT)/W0100%。
[0160] 下面的表C中列出了代表本發(fā)明的化合物和它們?cè)诩?xì)胞試驗(yàn)中的活性。
[0161] 表C:細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0162]
[0163] 體內(nèi)異種移植試驗(yàn)：
[0164] 用于體外試驗(yàn)的一個(gè)典型的方法如下所示，用于建立皮下A549 NCI-H1975細(xì)胞系 異種移植模型從而用來(lái)評(píng)價(jià)所述化合物的體內(nèi)治療效果:將NCI-H1975細(xì)胞在含有10%胎 牛血清、1%L-谷氨酸、100U/mL盤(pán)尼西林G和100yg/mL鏈霉素的RPMI1640中培養(yǎng)。收獲處于 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞然后重分散于1 XPBS用于移植。
[0165] 在無(wú)菌條件下通過(guò)皮下注射按5X106/每只小鼠將腫瘤細(xì)胞注射到小鼠的右側(cè)腹 來(lái)進(jìn)行腫瘤移植。當(dāng)腫瘤到達(dá)合適的尺寸（100-200mm 3)時(shí)，隨機(jī)將小鼠按每6只分成一組 (對(duì)照組為8只）。用卡尺在兩個(gè)維度上測(cè)量腫瘤，即長(zhǎng)度(a)和寬度(b)。腫瘤體積按照如下 公式根據(jù)單個(gè)腫瘤的二維尺寸的測(cè)量結(jié)果來(lái)計(jì)算：
[0166] 腫瘤體積(mm3) = (aXb2)/2
[0167] 腫瘤的尺寸和動(dòng)物的體重每周測(cè)量?jī)纱?。每天觀察小鼠的臨床癥狀。在最后治療 后的2小時(shí)后采集血液樣品，準(zhǔn)備血漿樣品并在-80°C下儲(chǔ)存。分離腫瘤組織，稱(chēng)重，拍照然 后在-80°C下儲(chǔ)存用于后續(xù)分析。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照中醫(yī)大學(xué)的動(dòng)物使用和保護(hù)規(guī)章 進(jìn)行操作。體內(nèi)效力評(píng)價(jià)的參數(shù)根據(jù)SFDA的規(guī)程進(jìn)行計(jì)算。百分比T/C(%)用下述公式進(jìn)行 計(jì)算:T/C( % ) = (TRTV/CRTV) X 100%，其中，TRTV和CRTV分別代表治療組和溶劑對(duì)照組的相對(duì) 腫瘤體積。相對(duì)腫瘤體積(RTV)用如下公式計(jì)算:RTV = Vt/Vo，其中，Vt代表測(cè)試日的體積，Vo 代表治療第一天的體積。腫瘤生長(zhǎng)抑制率(TGI，％ )按照TGI( % ) = 100%-T/C( % )來(lái)計(jì)算。
[0168] 在研究終點(diǎn)，采集血液后，通過(guò)頸椎脫臼法對(duì)小鼠實(shí)行安樂(lè)死，首先收集腫瘤組 織，然后打開(kāi)腹腔，切除肝臟和脾臟，然后在移除膽囊后分別對(duì)各個(gè)器官稱(chēng)重。比較治療組 和對(duì)照組的器官重量。在第14天，化合物8和化合物9在NCI-H1975異體移植研究中表現(xiàn)出了 好的療效。且與C0-1686相比，化合物9表現(xiàn)出了好的腫瘤生長(zhǎng)抑制性。
[0169] 下面的表D列出了本發(fā)明代表性的化合物以及它們?cè)谏鲜龅穆闶笃は翹CI-H1975 細(xì)胞系異體移植中的活性。表D:在NCI-H1975異體移植模型中的腫瘤生長(zhǎng)抑制率(TGI，％)
[0170]
[0171] 用于建立在裸鼠中皮下A431細(xì)胞系異體移植模型的體內(nèi)試驗(yàn)的代表性協(xié)議以及 評(píng)價(jià)這些化合物的體內(nèi)治療效果與上文描述的用于評(píng)價(jià)裸鼠皮下NCI-H1975細(xì)胞系異體移 植模型的協(xié)議類(lèi)似。在第7天，化合物9在20mg/kg(TGI=48.2%)的劑量下表現(xiàn)出比C0-1686 在100mg/kg(TGI = 38.7%)的劑量下較好的腫瘤抑制率。
[0172] 下面的表E列出了本發(fā)明代表性的化合物和它們?cè)谄は翧431細(xì)胞系異種移植模型 的活性。
[0173] 表E:在A431異種移植模型腫瘤生長(zhǎng)抑制(TGI，％)
[0174]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種如通式I的化合物：或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或者前藥或者立體異構(gòu)體或者互變異構(gòu)體或者代 謝物，其中： R1為氨基、&-C6烷氧基、F、C1或C的； R2為C廣C6烷基或-C(0)R3; R3為&-C6烷基； 條件是當(dāng)Ri為C廣C6烷氧基時(shí)，R2不是-C(0)R3。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Ri選自由氨基和C1-C6烷氧基組成的組。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Ri為氨基。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Ri為氨基且R2為C1-C6烷基。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，Ri為C1-C6烷氧基且R2為C1-C6烷基。6. -種選自下組的化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、藥物前體或者立體異 構(gòu)體或者互變異構(gòu)體或者代謝物，該組包括：7. -種藥物組合物，該藥物組合物包括上述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)中的一種化合物和一 種藥學(xué)上可接受的載體。8. 權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的化合物作為藥劑的用途。9. 權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的化合物在治療或預(yù)防高度增殖性的病癥上的用途。10. 權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的化合物在調(diào)節(jié)激酶信號(hào)傳導(dǎo)上的用途。11. 權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的化合物在治療或預(yù)防EGFR激酶和/或其突變體介導(dǎo)的 病癥上的用途。12. 權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的化合物在治療或預(yù)防EGFR-T790M激酶介導(dǎo)的病癥上的 用途。13. 權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的化合物在治療腫瘤上的應(yīng)用。14. 權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的化合物在治療非小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用。15. 權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的化合物聯(lián)合一種或多種抗癌制劑在治療腫瘤的用途。
【文檔編號(hào)】A61K31/16GK105980377SQ201580007044
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2015年2月3日
【發(fā)明人】張大為
【申請(qǐng)人】江蘇邁度藥物研發(fā)有限公司