用于瓦螨和蜂中的病毒控制的組合物和方法
【專利摘要】公開(kāi)了用于使用RNA干擾技術(shù)在瓦螨和蜂中提供病毒控制的組合物和方法，并且更具體地，公開(kāi)了通過(guò)提供靶向病毒序列的觸發(fā)多核苷酸對(duì)瓦螨和蜂中的病毒感染的預(yù)防和治療。
【專利說(shuō)明】用于瓦螨和蜂中的病毒控制的組合物和方法
[0001 ] 序列表
[0002]本申請(qǐng)含有已以電子版形式提交且特此以引用的方式整體并入的序列表。2014年 12月2日創(chuàng)建的所述序列表命名為P34159W000_SL. TXT并且大小為12，288字節(jié)。
[0003] 領(lǐng)域
[0004] 本實(shí)施方案總體涉及使用RNA干擾技術(shù)的用于降低蜂對(duì)傳染病的易感性的組合物 和方法，并且更具體地，涉及使用RNA干擾技術(shù)用于在瓦螨載體和蜂中減少病毒載量并抑制 病毒復(fù)制。
[0005] 背景
[0006] 蜜蜂，意大利蜜蜂(Apis mellifera)，是作物的有效傳粉所需要的，并因此對(duì)世界 農(nóng)業(yè)至關(guān)重要。蜜蜂還生產(chǎn)重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品，包括蜂蜜和蜂蠟。蜂群的健康和活力受到許多 寄生蟲(chóng)和病原體的威脅，這些寄生蟲(chóng)和病原體包括病毒、細(xì)菌、原生動(dòng)物和螨蟲(chóng)，它們各自 具有特征性的傳播模式。
[0007] -般來(lái)說(shuō)，病毒的傳播可以通過(guò)兩種途徑發(fā)生:水平傳播和垂直傳播。在水平傳播 中，病毒是在同一代個(gè)體間傳播，而垂直傳播發(fā)生在成年個(gè)體到他們的后代之間。傳播可以 通過(guò)多種路徑在社會(huì)生物體中發(fā)生(有關(guān)詳細(xì)綜述參見(jiàn)Chen Y P等人(2006)Appl Environ Microbiol. 72(1) :606-11)。最近，蜜蜂病毒的水平傳播在蜂群中已有記錄，例如，畸翅病毒 (deformed wing virus) (DWV)和克什米爾蜂病毒(Kashmir Bee Virus) (KBV)通過(guò)寄生螨 蟲(chóng)狄斯瓦螨(Varroa destructor)的傳播，以及在蜜蜂卵和年幼幼蟲(chóng)(不被瓦螨寄生的生命 階段)中的病毒的一些證據(jù)。
[0008]瓦螨(狄斯瓦螨)是管理蜜蜂(意大利蜜蜂)的頭號(hào)寄生蟲(chóng)，并且是商業(yè)養(yǎng)蜂最大的 全球性威脅(Rosenkranz等，2010)。瓦螨寄生蛹和成蟲(chóng)蜂在蛹育雛室中繁殖。螨蟲(chóng)用它們的 嘴巴刺穿外骨骼，并以蜂的血淋巴為食。在外骨骼的這些傷口部位有細(xì)菌感染，諸如引起歐 洲幼蟲(chóng)腐臭病的蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus pluton)。除了它們的寄生效應(yīng)之外，瓦螨 被懷疑充當(dāng)一些蜜蜂病原體的載體，這些蜜蜂病原體包括畸翅病毒(DWV)、克什米爾蜂病毒 (KBV)、急性蜂麻痹病毒(ABPV)和黑蜂王臺(tái)病毒(BQCV)，并可以削弱它們宿主的免疫系統(tǒng)， 使宿主容易受到感染。已知一些蜂病毒在螨蟲(chóng)中復(fù)制，由此顯著增加了病毒載量。如果不治 療瓦螨侵襲，通常會(huì)導(dǎo)致群體水平的死亡。
[0009]目前，養(yǎng)蜂人使用大量的方法來(lái)控制瓦螨的水平，包括各種化學(xué)殺螨劑，其中大多 數(shù)已失去效力，并且是有毒的和/或殘留在蜂蠟和蜂蜜中。其他方法包括施用草酸或甲酸、 單萜(百里酚)和各種其他管理措施，其結(jié)果是高度可變的，包括對(duì)治療群體的毒性。對(duì)瓦螨 有抵抗力的蜂的選育，諸如針對(duì)導(dǎo)致去除受侵襲幼蜂的衛(wèi)生行為的選擇，在實(shí)踐上取得了 有限的成功。
[0010]治療瓦螨侵襲的現(xiàn)行方法被證明是無(wú)效的，因?yàn)轵x(chóng)發(fā)展出了對(duì)現(xiàn)有殺螨劑的耐 藥性。另外，使用這類殺螨劑可能會(huì)在供人類消費(fèi)的蜂蜜中引入有害的化學(xué)物質(zhì)。
[0011] 概述
[0012] 本實(shí)施方案涉及用于在瓦螨和蜜蜂中控制病毒載量和/或病毒復(fù)制的組合物和方 法。
[0013] 本公開(kāi)提供了用于在狄斯瓦螨或在蜂群中減少病毒載量或抑制病毒復(fù)制的方法， 所述方法包括：向所述狄斯瓦螨或蜂群提供包含有效量的至少一種觸發(fā)多核苷酸的組合 物，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或基本 上互補(bǔ)的核酸序列，從而在狄斯瓦螨或在蜂群中降低病毒載量或抑制病毒復(fù)制。在一些實(shí) 施方案中，所述病毒選自由以下組成的組:急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅病毒(DWV)、克什米 爾蜂病毒(KBV)、黑蜂王臺(tái)病毒(BQCV)、囊狀幼蟲(chóng)病病毒(SBV)、慢性蜂麻痹病毒(CPV)、云翅 病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、無(wú)脊椎動(dòng)物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒 (VDV-1)、Kakugo病毒(KV)和西奈湖病毒(LSV)。
[0014] 本公開(kāi)還提供了用于向狄斯瓦螨、蜂或蜂群提供的組合物，所述組合物包含有效 量的觸發(fā)多核苷酸，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基 本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述組合物在狄斯瓦螨、蜂或蜂群 中降低病毒載量或抑制病毒復(fù)制。在一些實(shí)施方案中，所述組合物增加蜂或蜂群對(duì)蜂病毒 引起的疾病的耐受性。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸是單鏈DNA(ssDNA)、單鏈RNA(ssRNA)、雙鏈 RNA( dsRNA)、雙鏈DNA( dsDNA)或雙鏈DNA-RNA雜合體。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸下調(diào)病毒基因。在一些實(shí)施方案中，所述病 毒基因編碼外殼蛋白、RdRp、VPl、VP2或解旋酶。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含 與選自由SEQ ID ^):1-21組成的組的序列或其片段具有至少約80%、85%、88%、90%、 92%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性或互補(bǔ)性，或具有100%的序列同一性或 互補(bǔ)性的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)不 同的觸發(fā)多核苷酸的混合物，所述觸發(fā)多核苷酸靶向不同的病毒、或靶向相同病毒的不同 基因、或靶向病毒基因的不同片段。
[0017] 本公開(kāi)還提供了用于降低蜂群中的病毒載量的方法，所述方法包括:通過(guò)向蜂群 寄生蟲(chóng)提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物來(lái)減少所述寄生蟲(chóng)中的病毒載量，所述觸 發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的 核酸序列，從而抑制寄生蟲(chóng)中的病毒復(fù)制并降低蜂群中的病毒載量。在一些實(shí)施方案中，寄 生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。
[0018] 本公開(kāi)還提供了用于降低蜂對(duì)蜂病毒引起的疾病的易感性的方法，所述方法包 括：向蜂寄生蟲(chóng)提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病 毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而抑制寄生 蟲(chóng)中的病毒復(fù)制并降低蜂對(duì)蜂病毒引起的疾病的易感性。在一些實(shí)施方案中，疾病是蜂群 裝竭失調(diào)癥(CCD)。在一些實(shí)施方案中，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的所述組合物是通過(guò)噴灑瓦螨、 通過(guò)直接飼喂瓦螨、通過(guò)直接飼喂蜂群中的蜂或其任何組合來(lái)提供。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，提供了用于降低狄斯瓦螨中的病毒載量的方法。在一些實(shí)施 方案中，所述蜂病毒選自由以下組成的組:急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅病毒(DWV)、克什米 爾蜂病毒(KBV)、黑蜂王臺(tái)病毒(BQCV)、囊狀幼蟲(chóng)病病毒(SBV)、慢性蜂麻痹病毒(CPV)、云翅 病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、無(wú)脊椎動(dòng)物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒 (VDV-1)和Kakugo病毒(KV)。根據(jù)一些實(shí)施方案，提供了包含與蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù) 核苷酸的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列的觸發(fā)多核苷酸。根據(jù)一些實(shí)施方案， 提供了用于下調(diào)狄斯瓦螨中的病毒基因的表達(dá)的方法。
[0021 ]根據(jù)一些實(shí)施方案，提供了通過(guò)對(duì)針對(duì)蜂傳染性生物體和試劑(諸如DWV、IAPV、急 性蜂麻痹病毒和克什米爾蜂麻痹病毒）的瓦螨應(yīng)用RNA干擾技術(shù)來(lái)防止蜂疾病(諸如蜂群衰 竭失調(diào)癥)的傳播的方法和組合物。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，提供了用于增加蜂對(duì)蜂病毒引起的疾病的耐受性的 方法，所述方法包括向瓦螨提供有效量的觸發(fā)多核苷酸，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒 基因基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而減少瓦螨中的病毒載量并增加蜂對(duì)蜂病毒 引起的疾病的耐受性。在一些實(shí)施方案中，所述核酸與蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸 的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，提供了用于增加蜂群對(duì)蜂病毒引起的疾病的耐受性 的方法，所述方法包括向瓦螨提供有效量的觸發(fā)多核苷酸，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病 毒基因基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而減少瓦螨中的病毒載量并增加蜂群對(duì)蜂 病毒引起的疾病的耐受性。在一些實(shí)施方案中，所述核酸與蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核 苷酸的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)。
[0024] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了用于降低狄斯瓦螨中的病毒載量的方法，所述方法包 括：向狄斯瓦螨提供或施用包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷酸包含 與蜂病毒序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而抑制狄斯瓦螨中的病毒復(fù)制。在 一些實(shí)施方案中，所述蜂病毒序列是蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。
[0025] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了降低蜂群中的病毒載量的方法，所述方法包括:通過(guò)向 蜂群寄生蟲(chóng)提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物來(lái)減少所述寄生蟲(chóng)中的病毒載量，所 述觸發(fā)多核苷酸包含與病毒序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而抑制寄生蟲(chóng)中 的病毒復(fù)制并降低蜂群中的病毒載量。在一些實(shí)施方案中，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。在一些實(shí)施 方案中，蜂病毒序列是蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。
[0026] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了用于降低狄斯瓦螨中的病毒復(fù)制的方法，所述方法包 括：向狄斯瓦螨施用包含有效量的至少一種觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷酸包 含下調(diào)狄斯瓦螨中的蜂病毒基因表達(dá)的核酸序列，從而降低狄斯瓦螨中的病毒復(fù)制。在一 些實(shí)施方案中，所述核酸序列是與病毒基因或其片段基本上同一或基本上互補(bǔ)的觸發(fā)多核 苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述核酸序列與蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本 上同一或基本上互補(bǔ)。
[0027] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了降低蜂群中的病毒復(fù)制的方法，所述方法包括:通過(guò)向 蜂群寄生蟲(chóng)提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物來(lái)減少所述寄生蟲(chóng)中的病毒復(fù)制，所 述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而抑制寄生蟲(chóng) 中的病毒復(fù)制并降低蜂群中的病毒表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。在一些實(shí) 施方案中，蜂病毒序列是蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。
[0028] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了用于降低蜂對(duì)蜂病毒引起的疾病的易感性的方法，所 述方法包括：向蜂寄生蟲(chóng)提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷酸包 含與蜂病毒序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而抑制寄生蟲(chóng)中的病毒復(fù)制并降 低蜂對(duì)蜂病毒引起的疾病的易感性。在一些實(shí)施方案中，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。在一些實(shí)施方 案中，疾病是蜂群衰竭失調(diào)癥(CCD)。在一些實(shí)施方案中，蜂病毒序列是蜂病毒基因的至少 21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列。
[0029 ]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，蜂是蜜蜂。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，蜜蜂是采集蜂。
[0031 ]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，蜜蜂是巢蜂。
[0032] 幾個(gè)實(shí)施方案涉及包含有效量的一種或多種觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多 核苷酸包含與蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸 序列。在一些實(shí)施方案中，所述病毒選自由以下組成的組：急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅病 毒(DWV)、克什米爾蜂病毒(KBV)、黑蜂王臺(tái)病毒(BQCV)、囊狀幼蟲(chóng)病病毒(SBV)、慢性蜂麻痹 病毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、無(wú)脊椎動(dòng)物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)、Kakugo病毒(KV)和西奈湖病毒(LSV)。在一些實(shí)施方案中，病毒 是IAPV。在一些實(shí)施方案中，病毒是DWV。在一些實(shí)施方案中，所述病毒基因編碼外殼蛋白、 RdRp、VPl、VP2或解旋酶。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含與選自由SEQIDN0: 1-21組成的組的序列或其片段具有至少約80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、 98 %或99 %的序列同一性或互補(bǔ)性，或具有100 %的序列同一性或互補(bǔ)性的核酸序列。在一 些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)不同的觸發(fā)多核苷酸的混 合物，所述觸發(fā)多核苷酸靶向不同的病毒、或靶向相同病毒的不同基因、或靶向病毒基因的 不同片段。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含包括與DWV序列具有至少約80 %、85 %、 88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性或互補(bǔ)性，或具有100%的序 列同一性或互補(bǔ)性的核酸序列的一種或多種觸發(fā)多核苷酸;和包括與IAPV序列具有至少約 80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99% 的序列同一性或互補(bǔ)性，或具有 100%的序列同一性或互補(bǔ)性的核酸序列的一種或多種觸發(fā)多核苷酸。幾個(gè)實(shí)施方案涉及 包含有效量的一種或多種觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷酸包含與選自由SEQ ID 吣：11、13、14、17和18組成的組的核酸序列具有至少約80%、85%、88%、90%、92%、95%、 96%、97%、98%或99%的序列同一性或互補(bǔ)性，或具有100%的序列同一性或互補(bǔ)性的核 酸序列。幾個(gè)實(shí)施方案涉及包含有效量的一種或多種觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多 核苷酸包含與選自由SEQ ID N0:12、15、16、19和20組成的組的核酸序列具有至少約80%、 85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或99% 的序列同一性或互補(bǔ)性，或具有 100% 的序列同一性或互補(bǔ)性的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸是單鏈DNA (ssDNA)、單鏈 RNA(ssRNA)、雙鏈 RNA(dsRNA)、雙鏈 DNA(dsDNA)或雙鏈 DNA-RNA 雜合體。在一 些實(shí)施方案中，所述組合物包含一種或多種觸發(fā)多核苷酸和一種或多種賦形劑。在一些實(shí) 施方案中，所述賦形劑包括選自糖、溶劑、蛋白質(zhì)、蜂食物和其任何組合的一種或多種物質(zhì)。 在一些實(shí)施方案中，所述糖選自果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳糖、核糖和其任何組 合。在一些實(shí)施方案中，所述蜂食物選自蜂蜜、花粉、乳清酵母(Wheast)、大豆粉、酵母、酵母 產(chǎn)品和其任何組合。在一些實(shí)施方案中，所述組合物是選自由液體蜂可攝取組合物和固體 蜂可攝取組合物組成的組的蜂可攝取組合物。在一些實(shí)施方案中，液體蜂可攝取組合物為 糖漿。在一些實(shí)施方案中，固體蜂可攝取組合物為粉餅或干混合物。
[0033] 附圖簡(jiǎn)述
[0034]圖1繪不了 一些蜂病毒的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
[0035]圖2A繪示了示出用蜂病毒觸發(fā)混合物處理后的瓦螨的存活率的圖。
[0036] 圖2B繪示了示出在瓦螨直接飼喂實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)Q-PCR測(cè)定的處理后72h瓦螨中的 DWV水平的圖。
[0037] 圖3繪示了示出在每100只蜂不同（0-3或4-62)的瓦螨計(jì)數(shù)中，蜂中DWV水平對(duì)瓦螨 中DWV水平的圖。
[0038] 圖4繪示了示出在用dsRNA觸發(fā)物混合物(MIX)、非特異性dsRNA(SCR)或沒(méi)有dsRNA (對(duì)照(CON))飼喂蜂4天、8天和14天之后，蜂中DWV復(fù)制的圖。
[0039]圖5A繪示了示出在瓦螨直接飼喂實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)(>antiGenex測(cè)定的處理后3天的 瓦螨中DWV水平的圖。
[0040] 圖5B繪示了示出在瓦螨直接飼喂實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)C^iiantiGene"測(cè)定的處理后72h瓦 螨中IAPV水平的圖。
[0041] 圖6A繪示了示出通過(guò)QuamiGeneK測(cè)定的蜂處理后4天的蜜蜂中DWV表達(dá)的圖。
[0042] 圖6B繪示了示出通過(guò)QuantiGene"測(cè)定的蜂處理后4天的蜜蜂中DWV復(fù)制的圖。 [0043]圖7A繪示了示出通S'QuantiGene?測(cè)定的蜂處理后4天的蜜蜂中IAPV表達(dá)的圖。 [0044]圖7B繪示了示出通過(guò)QuantiGene 1(測(cè)定的蜂處理后4天的蜜蜂中IAPV復(fù)制的圖。
[0045]圖8繪示了示出通過(guò):QuantiGenek測(cè)定的蜂處理后4天的蜜蜂中LSV表達(dá)的圖。
[0046] 詳述
[0047] 除非另外定義，否則本文所用的技術(shù)性和科學(xué)性術(shù)語(yǔ)具有與本領(lǐng)域中技術(shù)人員通 常所理解的相同意思。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將了解很多方法可以在本公開(kāi)的實(shí)踐中使用。實(shí) 際上，本公開(kāi)決不限于所述方法和材料。本文中引用的任何參考文獻(xiàn)均以全文引用方式并 入本文。出于本公開(kāi)的目的，下文定義以下術(shù)語(yǔ)。
[0048] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"約"是指± 10 %。
[0049] 因此，除非上下文另外明確指出，否則如在本文中使用，單數(shù)形式"一個(gè)(種)"和 "所述"包括多個(gè)指示物。例如，術(shù)語(yǔ)"一種化合物"或"至少一種化合物"可以包括多種化合 物，包括其混合物。
[0050] 除非另外規(guī)定，否則本說(shuō)明書(shū)文本中的核酸序列當(dāng)從左向右閱讀時(shí)是以5'至3'方 向給出。應(yīng)當(dāng)理解，在本申請(qǐng)中公開(kāi)的任何序列識(shí)別號(hào)（SEQ ID N0)根據(jù)SEQ ID N0被提及 的語(yǔ)境，可以指DNA序列或RNA序列，即使該SEQ ID NO只以DNA序列格式或RNA序列的格式被 表達(dá)。此外，如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的，核酸序列的公開(kāi)也公開(kāi)了其反向互補(bǔ)的序 列，因?yàn)橐徽弑厝幌薅硪徽摺Ｈ绻g(shù)語(yǔ)是以單數(shù)形式提供，那么本
【發(fā)明人】也預(yù)期由所述術(shù) 語(yǔ)的復(fù)數(shù)形式描述的本發(fā)明的方面。
[0051 ]蜂易受大量的病毒感染。到目前為止，已經(jīng)鑒定了24種蜂病毒。大部分是正鏈RNA 病毒，其含有RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)。已經(jīng)鑒定出具有兩種主要結(jié)構(gòu)形式的兩個(gè)蜂病 毒系統(tǒng)發(fā)育家族。參見(jiàn)圖1。使用QuamiGene l:分析針對(duì)9種不同的蜂病毒篩查美國(guó)的蜂現(xiàn) 場(chǎng)樣品顯示了畸翅病毒(DWV)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、急性蜂 麻痹病毒(ABPV)和克什米爾蜂病毒(KBV)的高流行率。西奈湖病毒(LSV)，包括西奈湖病毒-l(LSV-l)和西奈湖病毒-2(LSV-2)，是在蜂箱中發(fā)現(xiàn)的其他病毒。已證明通過(guò)下調(diào)特定的病 毒基因產(chǎn)物進(jìn)行的病毒感染的治療可以成功地消除蜂中病毒引發(fā)的感染(參見(jiàn)美國(guó)專利公 開(kāi)2009/0118214)。本發(fā)明人現(xiàn)在公開(kāi)了用于治療瓦螨和蜂中的病毒感染的方法和組合物。 本發(fā)明人還公開(kāi)了通過(guò)降低寄生瓦螨的病毒載量進(jìn)行的蜂病毒感染的治療。
[0052]根據(jù)一些實(shí)施方案，RNA干擾技術(shù)用于降低狄斯瓦螨和蜂中的病毒載量。瓦螨寄生 蛹和成蟲(chóng)蜂在蛹育雛室中繁殖。螨蟲(chóng)用它們的嘴巴刺穿外骨骼，并以蜂的血淋巴為食。施用 給所述蜂以治療瓦螨侵襲的多核苷酸試劑出現(xiàn)在蜂的血淋巴中，從而可以為螨蟲(chóng)所用（參 見(jiàn)美國(guó)專利公開(kāi)2012/0258646)。
[0053]在本公開(kāi)的幾個(gè)實(shí)施方案中，RNA干擾技術(shù)用于降低狄斯瓦螨和蜂中的病毒復(fù)制。 在本公開(kāi)的幾個(gè)實(shí)施方案中，RNA干擾技術(shù)用于減少或阻止蜂病毒從蜂或蜂幼蟲(chóng)到以蜂或 蜂幼蟲(chóng)為食的狄斯瓦螨的傳播。在本公開(kāi)的幾個(gè)實(shí)施方案中，RNA干擾技術(shù)用于減少或阻止 蜂病毒從狄斯瓦螨到螨蟲(chóng)寄生的蜂或蜂幼蟲(chóng)的傳播。
[0054]在本公開(kāi)的一些實(shí)施方案中，RNA干擾技術(shù)用于降低蜂中的病毒載量。在一些實(shí)施 方案中，RNA干擾技術(shù)用于降低蜂群中的病毒載量。
[0055] 在本公開(kāi)的一些實(shí)施方案中，RNA干擾技術(shù)用于降低蜂中的病毒復(fù)制。在一些實(shí)施 方案中，RNA干擾技術(shù)用于降低蜂群中的病毒復(fù)制。
[0056] RNA干擾是指由小RNA介導(dǎo)的在動(dòng)物體內(nèi)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過(guò)程。在 植物中的對(duì)應(yīng)過(guò)程通常被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默或RNA沉默，并且在真菌中也被稱為靜息 (quelling)。雖然不受限于任何特定的理論，轉(zhuǎn)錄后基因沉默的過(guò)程被認(rèn)為是用于阻止外 來(lái)基因表達(dá)的進(jìn)化保守的細(xì)胞防御機(jī)制，并且通常由不同植物區(qū)系和門(mén)所共享。免遭外來(lái) 基因表達(dá)的所述保護(hù)可能已響應(yīng)于源于病毒性感染或轉(zhuǎn)位子元件通過(guò)特異性破壞同源單 鏈RNA或病毒基因組RNA的細(xì)胞反應(yīng)隨機(jī)整合至宿主基因組中的雙鏈RNA(dsRNA)產(chǎn)生而進(jìn) 化。在根據(jù)本公開(kāi)的方面，核酸組合物導(dǎo)致靶生物體中的RNA干擾。在某些方面，當(dāng)存在于宿 主生物體蜂或蜂幼蟲(chóng)中時(shí)，核酸組合物導(dǎo)致狄斯瓦螨中的RNA干擾。
[0057]短語(yǔ)"狄斯瓦螨"是指攻擊東方蜜蜂(Apis cerana)和意大利蜜蜂的外部寄生螨 蟲(chóng)。所述螨蟲(chóng)可以在成蟲(chóng)期從蜂中取食，或在幼蟲(chóng)期處于蜜蜂育雛室內(nèi)。
[0058]在本公開(kāi)的一些實(shí)施方案中，蜂病毒選自由以下組成的組：急性蜂麻痹病毒 (ABPV)、畸翅病毒(DWV)、克什米爾蜂病毒(KBV)、黑蜂王臺(tái)病毒（BQCV)、囊狀幼蟲(chóng)病病毒 (SBV)、慢性蜂麻痹病毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒(IAPV)、無(wú)脊椎動(dòng)物虹 彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)、Kakugo病毒(KV)和西奈湖病毒(LSV)。
[0059]在本公開(kāi)的一些實(shí)施方案中，蜂病毒是正鏈RNA病毒。在一些實(shí)施方案中，蜂病毒 是負(fù)鏈RNA病毒。在一些實(shí)施方案中，蜂病毒是DWV。在一些實(shí)施方案中，蜂病毒是IAPV。在一 些實(shí)施方案中，蜂病毒是LSV。
[0060]如本文所用，"病毒載量"、"病毒水平"和"病毒表達(dá)"的測(cè)量是指蜂病毒序列的有 義鏈的檢測(cè)，并且其在本公開(kāi)中可互換使用。許多檢測(cè)方法在本領(lǐng)域中是已知的，包括但不 限于，定量PCR(Q-PCR)和puantiGeiie' 1測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，病毒載量或病毒表達(dá)測(cè) 量為平均熒光強(qiáng)度(MFI)，并用看家基因的MFI標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)表示在蜂、蜂群或瓦螨中病毒的存 在。在一些實(shí)施方案中，病毒載量是活性病毒感染的嚴(yán)重性的量度。
[0061] 如本文所用，"病毒復(fù)制"的測(cè)量是指蜂病毒序列的負(fù)鏈的檢測(cè)。在一些實(shí)施方案 中，病毒復(fù)制測(cè)量為平均熒光強(qiáng)度(MFI)，并用看家基因的MFI標(biāo)準(zhǔn)化來(lái)表示在蜂、蜂群或瓦 螨中病毒的復(fù)制。在一些實(shí)施方案中，病毒復(fù)制是活性病毒感染的嚴(yán)重性的量度。
[0062] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"病毒滴度"是指樣品中的病毒的濃度。在一些實(shí)施方案中，通過(guò) 病毒滴度來(lái)測(cè)量病毒載量。用于計(jì)算病毒滴度的許多方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且它們 包含在本申請(qǐng)中。
[0063] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"宿主"或"宿主生物體"是指居住了寄生蟲(chóng)并為寄生蟲(chóng)提供營(yíng)養(yǎng) 的生物體。"寄生蟲(chóng)"是與宿主生物體有非相互共生關(guān)系并以宿主生物體為代價(jià)受益的生物 體。在一些實(shí)施方案中，宿主生物體是蜂。在一些實(shí)施方案中，寄生蟲(chóng)是瓦螨。
[0064] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"蜂"是指成年蜂及其蛹細(xì)胞。根據(jù)一個(gè)方面，蜂在蜂箱中。成年 蜂被定義為幾種有翼的、身體有毛的、通常有刺的膜翅目（Hymenoptera)蜜蜂總科 (Apoidea)的昆蟲(chóng)任意一種，包括獨(dú)居物種和社會(huì)物種并且特征在于用于收集花蜜和花粉 的刺吸式口器和咀嚼式口器。蜂物種的實(shí)例包括但不限于蜜蜂屬(Apis)、熊蜂屬(Bombus)、 無(wú)刺蜂屬(Trigona)、壁蜂屬(Osmia)等。在一個(gè)方面，蜂包括但不限于熊蜂(歐洲熊蜂）、蜜 蜂（意大利蜜蜂）（包括采集蜂和巢蜂)和東方蜜蜂。本公開(kāi)提供并且包括，用于治療作為宿 主或作為寄生蟲(chóng)的昆蟲(chóng)的方法和組合物。
[0065] 根據(jù)一個(gè)方面，蜂是蜂群的部分。術(shù)語(yǔ)"蜂群"是指包括數(shù)十只到通常數(shù)萬(wàn)只合作 筑巢、收集食物和育雛飼養(yǎng)的蜂的一群蜂。一個(gè)蜂群通常有一只蜂王，其余的蜂是"工蜂" (雌性)或"雄蜂"（雄性）。蜂群的社會(huì)結(jié)構(gòu)是由蜂王和工蜂維護(hù)，并依賴于有效的溝通系統(tǒng)。 工蜂等級(jí)內(nèi)的勞動(dòng)分工主要取決于蜂的年齡，但是會(huì)隨著蜂群的需要而變化。繁殖和蜂群 能力取決于蜂王、食物貯存的數(shù)量和工蜂力量的大小。蜜蜂也可以被分類為："巢蜂"，通常 是工蜂一生中的第一部分，在此期間"巢蜂"在蜂巢內(nèi)執(zhí)行任務(wù);和"采集蜂"，工蜂一生中的 后半部分，在此期間"采集蜂"從蜂巢外定位和收集花粉和花蜜，并將花粉或花蜜帶入蜂巢 中食用和貯存。本公開(kāi)提供并且包括，用于治療昆蟲(chóng)群體的方法和組合物。
[0066] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"寄生蟲(chóng)"是指以其他宿主、生物體為代價(jià)直接受益的成年和不 成熟的生物體形式，例如以宿主的血液或體液為食、生活在宿主生物體細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)或生 活在宿主生物體的體內(nèi)。本公開(kāi)提供并且包括，用于治療寄生蟲(chóng)的方法和組合物。在一個(gè)方 面，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。
[0067]如本文所用，短語(yǔ)"RNA沉默"是指RNA分子介導(dǎo)的一組調(diào)節(jié)機(jī)制（例如，RNA干擾 (RNAi)、轉(zhuǎn)錄基因沉默(TGS)、轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)、靜息、共抑制和翻譯抑制），其導(dǎo)致對(duì) 應(yīng)病毒基因的表達(dá)抑制或"沉默"。RNA沉默已在許多類型的生物體觀察到，包括植物、動(dòng)物 和真菌。在本公開(kāi)的方面，核酸組合物提供RNA沉默。在某些方面，所述核酸組合物提供蜂寄 生蟲(chóng)中病毒基因的沉默。
[0068]本公開(kāi)提供了用于在狄斯瓦螨或在蜂群中減少病毒載量或抑制病毒復(fù)制的方法， 所述方法包括：向所述狄斯瓦螨或蜂群提供包含有效量的至少一種觸發(fā)多核苷酸的組合 物，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或基本 上互補(bǔ)的核酸序列，從而在狄斯瓦螨或在蜂群中降低病毒載量或抑制病毒復(fù)制。在一些實(shí) 施方案中，所述病毒選自由以下組成的組:急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅病毒(DWV)、克什米 爾蜂病毒(KBV)、黑蜂王臺(tái)病毒(BQCV)、囊狀幼蟲(chóng)病病毒(SBV)、慢性蜂麻痹病毒(CPV)、云翅 病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、無(wú)脊椎動(dòng)物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒 (VDV-1)、Kakugo病毒(KV)和西奈湖病毒(LSV)。
[0069] 本公開(kāi)還提供了用于向狄斯瓦螨、蜂或蜂群提供的組合物，所述組合物包含有效 量的觸發(fā)多核苷酸，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基 本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述組合物在狄斯瓦螨、蜂或蜂群 中降低病毒載量或抑制病毒復(fù)制。在一些實(shí)施方案中，所述組合物增加蜂或蜂群對(duì)蜂病毒 引起的疾病的耐受性。
[0070] 在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸是單鏈DNA(ssDNA)、單鏈RNA(ssRNA)、雙鏈 RNA( dsRNA)、雙鏈DNA( dsDNA)或雙鏈DNA-RNA雜合體。
[0071 ]在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸下調(diào)病毒基因。在一些實(shí)施方案中，所述病 毒基因編碼外殼蛋白、RdRp、VPl、VP2或解旋酶。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含 與選自由SEQ ID ^):1-21組成的組的序列或其片段具有至少約80%、85%、88%、90%、 92%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性或互補(bǔ)性，或具有100%的序列同一性或 互補(bǔ)性的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)不 同的觸發(fā)多核苷酸的混合物，所述觸發(fā)多核苷酸靶向不同的病毒、或靶向相同病毒的不同 基因、或靶向病毒基因的不同片段。
[0072] 本公開(kāi)還提供了用于降低蜂群中的病毒載量的方法，所述方法包括:通過(guò)向蜂群 寄生蟲(chóng)提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物來(lái)減少所述寄生蟲(chóng)中的病毒載量，所述觸 發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的 核酸序列，從而抑制寄生蟲(chóng)中的病毒復(fù)制并降低蜂群中的病毒載量。在一些實(shí)施方案中，所 述寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。
[0073] 本公開(kāi)還提供了用于降低蜂對(duì)蜂病毒引起的疾病的易感性的方法，所述方法包 括：向蜂寄生蟲(chóng)提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病 毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而抑制寄生 蟲(chóng)中的病毒復(fù)制并降低蜂對(duì)蜂病毒引起的疾病的易感性。在一些實(shí)施方案中，疾病是蜂群 裝竭失調(diào)癥(CCD)。在一些實(shí)施方案中，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。
[0074] 在一些實(shí)施方案中，包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的所述組合物是通過(guò)噴灑瓦螨、 通過(guò)直接飼喂瓦螨、通過(guò)直接飼喂蜂群中的蜂或其任何組合來(lái)提供。
[0075] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了用于在狄斯瓦螨中減少病毒載量或抑制病毒復(fù)制的方 法，所述方法包括：向狄斯瓦螨提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷 酸包含與病毒序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而在狄斯瓦螨中抑制病毒復(fù)制 或減少病毒載量。
[0076] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了用于在蜂或蜂群中減少病毒載量或抑制病毒復(fù)制的方 法，所述方法包括：向蜂或蜂群提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷 酸包含與病毒序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而在蜂或蜂群中抑制病毒復(fù)制 或減少病毒載量。
[0077] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了在蜂或蜂群中減少病毒載量或抑制病毒復(fù)制的方法， 所述方法包括:通過(guò)向蜂或蜂群寄生蟲(chóng)提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物來(lái)減少所 述寄生蟲(chóng)中的病毒載量或抑制病毒復(fù)制，所述觸發(fā)多核苷酸包含與病毒序列基本上同一或 基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而抑制寄生蟲(chóng)中的病毒復(fù)制并降低蜂群中的病毒載量。在一些 實(shí)施方案中，所述寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。
[0078] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了用于在狄斯瓦螨中減少病毒載量或抑制病毒復(fù)制的方 法，所述方法包括：向狄斯瓦螨施用包含有效量的至少一種觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸 發(fā)多核苷酸包含下調(diào)狄斯瓦螨中的病毒基因表達(dá)的核酸序列，從而在狄斯瓦螨中降低病毒 載量或抑制病毒復(fù)制。在一些實(shí)施方案中，所述核酸序列是與病毒基因或其片段基本上同 一或基本上互補(bǔ)的觸發(fā)多核苷酸。
[0079] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了用于在蜂群中減少病毒載量或抑制病毒復(fù)制的方法， 所述方法包括:通過(guò)向蜂群寄生蟲(chóng)提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物來(lái)減少所述寄 生蟲(chóng)中的病毒載量或抑制病毒復(fù)制，所述觸發(fā)多核苷酸包含與病毒序列基本上同一或基本 上互補(bǔ)的核酸序列，從而抑制寄生蟲(chóng)中的病毒復(fù)制并降低蜂群中的病毒表達(dá)。在一些實(shí)施 方案中，所述寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。
[0080] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了用于降低蜂對(duì)蜂病毒引起的疾病的易感性的方法，所 述方法包括：向蜂寄生蟲(chóng)提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷酸包 含與病毒序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而抑制寄生蟲(chóng)中的病毒復(fù)制并降低 蜂對(duì)蜂病毒引起的疾病的易感性。在一些實(shí)施方案中，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。在一些實(shí)施方案 中，疾病是蜂群衰竭失調(diào)癥(CCD)。
[0081] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"觸發(fā)物"或"觸發(fā)多核苷酸"是指一種生物活性的多核苷酸分 子，其與靶基因或由靶基因表達(dá)的RNA的多核苷酸序列或其片段基本上同源或互補(bǔ)，并且起 作用來(lái)抑制靶基因的表達(dá)或產(chǎn)生敲低表型。觸發(fā)多核苷酸能夠抑制或"沉默"靶基因的表 達(dá)。觸發(fā)多核苷酸通常與其"靶序列"相關(guān)地進(jìn)行描述。觸發(fā)多核苷酸可以是單鏈DNA (ssDNA)、單鏈RNA(ssRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、雙鏈DNA(dsDNA)或雙鏈DNA/RNA雜合體。觸發(fā) 多核苷酸可以包括天然存在的核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸、核苷酸類似物或其任何組合。在一 些實(shí)施方案中，觸發(fā)多核苷酸可以合并在更大的多核苷酸內(nèi)，例如合并在pri-miRNA分子 內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，觸發(fā)多核苷酸可以加工成小干擾RNA(siRNA)。在一個(gè)方面，觸發(fā)多 核苷酸能夠抑制病毒基因的表達(dá)。在另一個(gè)方面，觸發(fā)多核苷酸能夠被用于抑制病毒基因 的表達(dá)并從而減少宿主生物體的病毒載量的方法中。在某些方面，所述病毒基因是DWV、 VDV-1、IAPV、ABPV、KBV或LSV基因，并且所述宿主生物體是狄斯瓦螨。
[0082] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"祀序列"或"祀基因"是指出現(xiàn)在觸發(fā)多核苷酸被引導(dǎo)針對(duì)的基 因或基因產(chǎn)物中的核苷酸序列。在本上下文中，術(shù)語(yǔ)"基因"是指基因組序列中的可定位的 區(qū)域，對(duì)應(yīng)于遺傳的單位，其包括調(diào)節(jié)區(qū)（諸如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子）、5'非翻譯區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、3' 非翻譯區(qū)、轉(zhuǎn)錄區(qū)和在植物基因組中作為天然基因或轉(zhuǎn)基因存在的其他功能序列區(qū)域。根 據(jù)情況，術(shù)語(yǔ)靶序列或靶基因可以指被靶向用于抑制的基因或基因產(chǎn)物的全長(zhǎng)核苷酸序 列，或被靶向用于抑制的基因或基因產(chǎn)物的部分核苷酸序列。
[0083] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"來(lái)源于"是指可從特定的指定來(lái)源或物種獲得的指定核苷酸序 列，即使不一定直接來(lái)自所述指定來(lái)源或物種。
[0084] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"序列"、"核苷酸序列"或"多核苷酸序列"是指DNA分子、RNA分子 或其部分的核苷酸序列。
[0085] 術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"是指由核苷酸間鍵連接的單核苷酸的任何聚合物。多核苷酸可以 由天然存在的核糖核苷酸、天然存在的脫氧核糖核苷酸、天然存在的核苷酸的類似物（例 如，天然存在的核苷酸的對(duì)映體形式)或它們的任何組合構(gòu)成。如果多核苷酸是單鏈的，那 么其長(zhǎng)度可以核苷酸的數(shù)量的方式進(jìn)行描述。如果多核苷酸是雙鏈的，那么其長(zhǎng)度可以堿 基對(duì)的數(shù)量的方式進(jìn)行描述。
[0086]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"不可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸"是指不包含完整的聚合酶II轉(zhuǎn)錄單位的 多核苷酸。
[0087]術(shù)語(yǔ)"基因表達(dá)"是指經(jīng)由RNA聚合酶的酶促作用通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄將基因組DNA編碼 的遺傳信息轉(zhuǎn)化成RNA (例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)并且通過(guò)mRNA的翻譯轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì) 的過(guò)程?；虮磉_(dá)可在此過(guò)程中的許多階段加以調(diào)控。
[0088]在本文所述的實(shí)施方案中，病毒序列被選擇作為觸發(fā)多核苷酸的靶標(biāo)。在一些實(shí) 施方案中，靶序列因?yàn)榘虶/C含量而被選擇，因?yàn)榕cG/C含量高于55 %的那些相比，低G/ C含量的序列已經(jīng)被證明在介導(dǎo)基因沉默中更有效。在一些實(shí)施方案中，沿著靶基因的長(zhǎng)度 選擇幾個(gè)靶位點(diǎn)。
[0089]在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含與病毒基因或其片段基本上互補(bǔ)或基 本上同一的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基因的至少 21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上互補(bǔ)或基本上同一的核酸。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多 核苷酸包含與蜂病毒基因的至少 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)連續(xù)核 苷酸的序列基本上互補(bǔ)或基本上同一的核酸。在一些實(shí)施方案中，所述病毒基因編碼外殼 蛋白、RdRp、病毒蛋白1 (VP1)、VP2或解旋酶。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含與 DWV或IAPV基因或其片段基本上互補(bǔ)或基本上同一的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述 觸發(fā)多核苷酸包含與LSV基因或其片段基本上互補(bǔ)或基本上同一的核苷酸序列。在一些實(shí) 施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含與急性蜂麻痹基因或其片段基本上互補(bǔ)或基本上同一的 核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含與克什米爾蜂病毒基因或其片段 基本上互補(bǔ)或基本上同一的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含與黑 蜂王臺(tái)病毒基因或其片段基本上互補(bǔ)或基本上同一的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所 述觸發(fā)多核苷酸包含與慢性蜂麻痹病毒基因或其片段基本上互補(bǔ)或基本上同一的核苷酸 序列。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含與云翅病毒基因或其片段基本上互補(bǔ)或 基本上同一的核苷酸序列。
[0090] 多蜂病原體序列可以設(shè)計(jì)成包括適于產(chǎn)生有效針對(duì)多于一種蜂病毒的觸發(fā)多核 苷酸的序列。此類多蜂病原體dsRNA可以是長(zhǎng)或短變種，并且可以包括對(duì)應(yīng)于一類蜂病毒的 同源序列的序列。此外，可以設(shè)計(jì)多個(gè)序列包括相同蜂病原體的兩種或更多種dsRNA序列。
[0091] "基本上同一"或"基本上互補(bǔ)"意指生物活性多核苷酸觸發(fā)物(或雙鏈多核苷酸或 其部分的至少一條鏈、或單鏈多核苷酸的部分)在生理?xiàng)l件下與內(nèi)源性基因、從其轉(zhuǎn)錄的 RNA或其片段雜交，從而實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性基因的調(diào)控或抑制。例如，在一些實(shí)施方案中，與靶基因 或由靶基因轉(zhuǎn)錄的 RNA 中的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60或更多連續(xù)核苷酸的序列相比，生物活性多核苷酸觸發(fā)物具有 100% 的序列同一性或至少約 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98或99%的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，與靶基因或由靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA中的10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或 更多連續(xù)核苷酸的序列相比，生物活性多核苷酸觸發(fā)物具有100 %的序列互補(bǔ)性或至少約 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99% 的序列互補(bǔ)性。在 一些實(shí)施方案中，生物活性多核苷酸觸發(fā)物與給定靶基因（基因的編碼或非編碼序列）的一 個(gè)等位基因或一個(gè)家族成員具有100%的序列同一性或互補(bǔ)性。在一些實(shí)施方案中，生物活 性多核苷酸觸發(fā)物與給定靶基因的多個(gè)等位基因或家族成員具有至少約80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的序列同一性或互補(bǔ)性。在一些實(shí) 施方案中，生物活性多核苷酸觸發(fā)物與給定靶基因的多個(gè)等位基因或家族成員具有100% 的序列同一性或互補(bǔ)性。
[0092]如本文所用，當(dāng)從5'至3'讀取的核酸序列之一的每個(gè)核苷酸與從3'至5'讀取時(shí)的 另一個(gè)序列的每個(gè)核苷酸互補(bǔ)時(shí)，可稱所述核酸序列分子表現(xiàn)出"完全互補(bǔ)性"。與參考核 苷酸序列完全互補(bǔ)的核苷酸序列將表現(xiàn)出與參考核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列同一的序列。 [0093]應(yīng)當(dāng)理解，本公開(kāi)的觸發(fā)多核苷酸，例如dsRNA，不必限于僅含有天然核苷酸的那 些分子，而是還包括化學(xué)修飾的核苷酸和非核苷酸。本公開(kāi)的觸發(fā)多核苷酸試劑也可以包 括堿基修飾或取代。如本文所用，"未修飾的"或"天然的"堿基包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥(niǎo) 嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。經(jīng)修飾的堿基包括但不限于 其他合成和天然堿基，諸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的2-丙基和其 他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶）、4_硫尿 嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基和其他8-取代腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤、5-鹵基(特 別是5-溴）、5_三氟甲基和其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和7-脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和3-脫氮腺 嘌呤。另外的堿基包括公開(kāi)于美國(guó)專利號(hào)3,687,808中的那些、公開(kāi)于The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,第858-859頁(yè)，Kroschwitz，J.I·編 著John Wiley&Sons，1990中的那些、由Englisch等，Angewandte Chemie，International Edition, 1991,613公開(kāi)的那些以及由Sanghvi，Y.S.，第15章 ，Antisense Research and Applications，第289-2頁(yè)，Crooke，S · T ·和Lebleu，B ·編著，CRC Press，1993公開(kāi)的那些。此 類堿基特別適用于增強(qiáng)本公開(kāi)的低聚化合物的結(jié)合親和力。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮 雜嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔 基胞嘧啶。已顯示5-甲基胞嘧啶取代使核酸雙鏈體穩(wěn)定性增加0.6-1.2°(：(3 &1^^1￥5等 (1993)Antisense Research and Applications，CRC Press,Boca Raton 276-278)，并且 是目前優(yōu)選的堿基取代，尤其是當(dāng)與2'-0_甲氧基乙基糖修飾結(jié)合時(shí)。
[0094]本公開(kāi)的觸發(fā)多核苷酸在合成之后可任選地進(jìn)行純化。例如，多核苷酸可以通過(guò) 用溶劑或樹(shù)脂萃取、沉淀、電泳、色譜或其組合從混合物中純化?？商娲兀|發(fā)多核苷酸可 以在不純化或者最低純化下使用以避免由樣品加工造成的損失。觸發(fā)多核苷酸可以被干燥 存儲(chǔ)或溶解在水溶液中。所述溶液可以含有緩沖劑或鹽，以促進(jìn)雙螺旋鏈的退火和/或穩(wěn) 定。
[0095] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"同源性"和"同一性"當(dāng)涉及核酸使用時(shí)，描述兩個(gè)或更多個(gè)核 苷酸序列之間的相似程度。兩序列間的"序列同一性"百分比通過(guò)在比較窗比較兩個(gè)最優(yōu)對(duì) 準(zhǔn)的序列來(lái)確定，這樣相比于參考序列（其不包含添加或缺失），比較窗中的序列部分可包 含添加或缺失（即空位），以用于兩個(gè)序列的最優(yōu)比對(duì)。所述百分比是通過(guò)以下進(jìn)行計(jì)算:確 定兩個(gè)序列中出現(xiàn)同一的核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)以得到匹配位置數(shù)，用匹配位置 數(shù)除以比較窗口中的位置總數(shù)，并且將結(jié)果乘以100而得到序列同一性百分比。與參考序列 相比較時(shí)每個(gè)位置都同一的序列可稱是與參考序列同一，反之亦然。可以使用任何合適的 計(jì)算機(jī)程序來(lái)執(zhí)行兩個(gè)或更多個(gè)序列的比對(duì)。例如，廣泛使用和接受的用于執(zhí)行序列比對(duì) 的計(jì)算機(jī)程序是CLUSTALW vl.6(Thompson等Nucl.Acids Res. ,22:4673-4680,1994)。
[0096] 如本文所用，"對(duì)照生物體"是指不包含觸發(fā)多核苷酸或其他提供病毒感染或病毒 復(fù)制對(duì)照的核酸的生物體。對(duì)照生物體通常來(lái)自與治療生物體相同的物種，并且處于在相 同的生長(zhǎng)條件生長(zhǎng)的相同發(fā)育階段。類似地，"對(duì)照群體"意指不包含觸發(fā)多核苷酸或其他 提供病毒感染或病毒復(fù)制對(duì)照的核酸的生物體群體。對(duì)照生物體群體通常來(lái)自與治療生物 體群體相同的物種，并且處于在相同的生長(zhǎng)條件生長(zhǎng)的相同發(fā)育階段。
[0097]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"治療"包括病狀的消除、基本上抑制、減慢或逆轉(zhuǎn)其進(jìn)展，基本 上改善病狀的臨床或美學(xué)癥狀，或基本上預(yù)防病狀的臨床或美學(xué)癥狀的出現(xiàn)。在根據(jù)本公 開(kāi)內(nèi)容的一個(gè)方面，組合物可以用于治療生物體或生物體群體的病毒感染。在一個(gè)方面， dsRNA組合物可以用于治療宿主生物體或寄生蟲(chóng)的病毒感染。在一個(gè)方面，宿主生物體是 蜂，并且寄生蟲(chóng)是螨蟲(chóng)狄斯瓦螨。在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了用于治療蜂群衰竭失調(diào)癥 (CCD)的方法。
[0098]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"改善"、"改善的"、"增加"和"增加的"是指相比于對(duì)照生物體或 群體，以至少約2%、至少約3 %、至少約4%、至少約5 %、至少約10 %、至少約15 %、至少約 20 %、至少約25 %、至少約30 %、至少約35 %、至少約40 %、至少約45 %、至少約50 %、至少約 60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或更多增加的生物體或群體的總數(shù)，增加的生 物體或群體的生產(chǎn)率(例如，增加的蜂蜜產(chǎn)量），增加的生物體或群體的生長(zhǎng)率，或增加的繁 殖率。本公開(kāi)提供了通過(guò)提供抗病毒組合物改善生物體或群體的健康的方法。
[0099]如本文所用，在一些實(shí)施方案中"病毒載量"，也稱為"病毒負(fù)荷"、"病毒滴度"、"病 毒水平"或"病毒表達(dá)"，是病毒感染的嚴(yán)重性的量度，并且可以通過(guò)估計(jì)被感染的生物體、 有關(guān)的體液或受影響的群體中病毒的量進(jìn)行計(jì)算。它也可以通過(guò)估計(jì)或測(cè)量被感染的生物 體、有關(guān)的體液或受影響的群體中蜂病毒序列的有義鏈的量進(jìn)行計(jì)算。
[0100] 如本文所用，試劑(諸如蛋白質(zhì)或mRNA)水平的"減少"意指，相對(duì)于缺少能夠減少 所述試劑的觸發(fā)多核苷酸(例如dsRNA分子)的生物體或群體而言水平減少。也如本文所用， 關(guān)于病毒載量的"減少"意指，相對(duì)于缺少能夠降低病毒載量的核酸或其他dsRNA分子的生 物體或群體而言病毒載量減少。本公開(kāi)提供了并且包括，用于減少病毒蛋白或病毒基因表 達(dá)水平和減少病毒載量的方法和組合物。本公開(kāi)也提供了用于降低瓦螨或蜂中的病毒復(fù)制 水平的方法和組合物。
[0101] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)試劑(諸如蛋白質(zhì)或mRNA)水平的"至少部分減少"意指，相對(duì)于 缺少能夠減少所述試劑的觸發(fā)多核苷酸(例如dsRNA分子)的生物體或群體而言水平減少至 少25%。也如本文所用，關(guān)于病毒載量的"至少部分減少"意指，相對(duì)于缺少能夠降低病毒載 量的核酸或其他dsRNA分子的生物體或群體而言水平減少至少25%。本公開(kāi)提供了并且包 括，用于至少部分減少病毒蛋白或病毒基因表達(dá)水平和至少部分減少病毒載量的方法和組 合物。
[0102] 如本文所用，試劑(諸如蛋白質(zhì)或mRNA)水平的"實(shí)質(zhì)減少"意指，相對(duì)于缺少能夠 減少所述試劑的觸發(fā)多核苷酸(例如dsRNA分子)的生物體或群體而言水平減少，其中所述 試劑水平的減少是至少75%。也如本文所用，關(guān)于病毒載量的"實(shí)質(zhì)減少"意指，相對(duì)于缺少 能夠降低病毒載量的核酸或其他dsRNA分子的生物體或群體而言病毒載量減少至少75%。 本公開(kāi)提供了并且包括，用于實(shí)質(zhì)減少病毒蛋白或病毒基因表達(dá)水平和實(shí)質(zhì)減少病毒載量 的方法和組合物。
[0103] 如本文所用，試劑(諸如蛋白質(zhì)或mRNA)的"有效消除"是相對(duì)于缺少能夠減少所述 試劑的觸發(fā)多核苷酸(例如dsRNA分子）的生物體或群體而言的，其中所述試劑水平的減少 大于95%。觸發(fā)多核苷酸，優(yōu)選dsRNA分子，優(yōu)選能夠提供至少部分減少、更優(yōu)選實(shí)質(zhì)減少或 最優(yōu)選有效消除另外的試劑，諸如病毒蛋白或病毒基因的表達(dá)，或病毒，其中所述試劑使宿 主基因的表達(dá)水平基本上不受影響、實(shí)質(zhì)上不受影響或部分不受影響。也如本文所用，關(guān)于 病毒載量的"有效消除"意指，相對(duì)于缺少能夠減少病毒蛋白、病毒基因表達(dá)或病毒載量的 核酸或其他dsRNA分子的生物體或群體而言病毒載量減少至少95%。本公開(kāi)提供了并且包 括，用于有效消除病毒蛋白或病毒基因表達(dá)和有效消除病毒感染的方法和組合物。
[0104]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"抑制"、"壓制"和"下調(diào)"當(dāng)涉及核酸分子在生物體中的表達(dá)或 活性時(shí)，在本文中等同地使用，并且意指使用本公開(kāi)的方法后，所述核酸分子在生物體或群 體的細(xì)胞中的表達(dá)或活性的水平低于使用所述方法前其在生物體或群體的細(xì)胞中的表達(dá) 或活性，或低于缺少本公開(kāi)的核酸分子對(duì)照生物體或群體。本公開(kāi)提供了并且包括，用于在 生物體或群體中抑制、壓制和下調(diào)病毒蛋白或病毒基因表達(dá)水平以及抑制、壓制和下調(diào)病 毒感染水平的方法和組合物。本公開(kāi)還提供了用于在生物體或群體中抑制、壓制和下調(diào)病 毒復(fù)制水平的方法和組合物。在一些實(shí)施方案中，所述生物體是瓦螨。在一些實(shí)施方案中， 所述生物體是蜂。在一些實(shí)施方案中，所述群體是蜂群。
[0105] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"抑制"、"壓制"和"下調(diào)"是同義詞，并且在本文中意指靶向核 酸分子的表達(dá)或活性更低，優(yōu)選顯著更低。也如本文所用，關(guān)于病毒感染或病毒載量的"抑 制"、"壓制"和"下調(diào)"意指，相對(duì)于缺少能夠降低病毒基因表達(dá)的核酸或其他dsRNA分子的 生物體或群體而言感染水平或病毒載量更低，優(yōu)選顯著更低。本公開(kāi)提供了并且包括，用于 抑制、壓制和下調(diào)病毒蛋白或病毒基因的表達(dá)或活性以及抑制、壓制和下調(diào)病毒感染性的 方法和組合物。
[0106] 在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸是單鏈DNA(ssDNA)、單鏈RNA(ssRNA)、雙鏈 RNA(dsRNA)、雙鏈DNA(dsDNA)或雙鏈DNA-RNA雜合體。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷 酸是dsRNA。
[0107] 在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含與選自由SEQ ID NO: 1-21組成的組的 序列或其片段具有至少約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性，或具有 100% 的序列同 一性的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸包含與選自由SEQ ID N0:1-21組 成的組的序列或其片段具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99% 的序列互補(bǔ)性，或具有 100%的序列互補(bǔ)性的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸組合物包含與由選 自 SEQ ID 吣：1-21的序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59或60個(gè)連續(xù)核苷酸組成的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列。
[0108] 在某些方面，本公開(kāi)提供了dsRNA組合物，其包含與選自由SEQ ID NO:1-21組成的 組的序列或其片段具有至少約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性或序列互補(bǔ)性的 核苷酸序列。在某些方面，所述dsRNA組合物包含與選自SEQ ID NO :1-21的序列或其片段具 有100%同一性或互補(bǔ)性的核苷酸序列。在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了編碼至少一種dsRNA 前體的DNA，其包含與選自由SEQ ID NO: 1-21組成的組的序列或其片段具有100%同一性或 互補(bǔ)性，或與選自由SEQ ID N0:1-21組成的組的序列或其片段具有至少約80%、81 %、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%的序列同一性或序列互補(bǔ)性的核苷酸序列。在又一方面，本公開(kāi)提供了編 碼至少一種dsRNA前體的重組DNA，其包含選自由SEQ ID N0:1-21或其片段組成的組的核苷 酸序列、異源啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子序列。在另一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了編碼至少一種dsRNA 前體的重組DNA，其包含與選自由SEQ ID NO: 1-21組成的組的序列或其片段具有至少約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的序列同一性或序列互補(bǔ)性的核苷酸序列，并且還包含異源 啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0109]在幾個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供了包含至少一種觸發(fā)多核苷酸的組合物。在一些 實(shí)施方案中，所述組合物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種不同的觸發(fā)多核苷酸的混合物。 在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含2、3、4、5、6、7、8、9或10種不同的觸發(fā)多核苷酸的混合 物。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸可以靶向不同的病毒。在一些實(shí)施方案中，所述 觸發(fā)多核苷酸可以靶向同一病毒的不同基因。在一些實(shí)施方案中，所述觸發(fā)多核苷酸可以 靶向病毒序列或病毒基因的不同片段。
[0110]應(yīng)該理解的是，所述觸發(fā)多核苷酸，例如dsRNA，可以以各種各樣的方式遞送到害 蟲(chóng)或寄生蟲(chóng)。根據(jù)一個(gè)方面，所述觸發(fā)多核苷酸直接遞送到寄生蟲(chóng)(例如，通過(guò)噴灑螨蟲(chóng)侵 襲的蜂房）。觸發(fā)多核苷酸或編碼觸發(fā)多核苷酸的構(gòu)建體可以通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入螨蟲(chóng)的體內(nèi)。在 另一個(gè)方面，觸發(fā)多核苷酸通過(guò)宿主生物體間接地遞送(例如，通過(guò)向蜂提供包含觸發(fā)多核 苷酸的蜂食物）。在一個(gè)方面，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。在一個(gè)方面，宿主生物體是蜂。
[0111] 應(yīng)當(dāng)理解，由于許多寄生蟲(chóng)使用它們的嘴刺穿宿主節(jié)肢動(dòng)物的外骨骼并以節(jié)肢動(dòng) 物的血淋巴為食，本公開(kāi)設(shè)想遞送本公開(kāi)的觸發(fā)多核苷酸(例如dsRNA)至宿主節(jié)肢動(dòng)物，由 此使觸發(fā)多核苷酸呈現(xiàn)在宿主節(jié)肢動(dòng)物的血淋巴中從而為寄生蟲(chóng)可用。因此，根據(jù)另一個(gè) 方面，核酸試劑間接地遞送到寄生蟲(chóng)(例如經(jīng)由宿主蜂遞送到螨蟲(chóng)）。在某些方面，害蟲(chóng)或寄 生蟲(chóng)是狄斯瓦螨，并且宿主節(jié)肢動(dòng)物是蜂。
[0112] 根據(jù)一個(gè)方面，觸發(fā)多核苷酸(例如dsRNA)通過(guò)噴灑遞送到被侵襲的宿主。觸發(fā)多 核苷酸（例如dsRNA)或編碼觸發(fā)多核苷酸的構(gòu)建體可以通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入宿主的體內(nèi)。在某些 方面，害蟲(chóng)或寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨，并且宿主節(jié)肢動(dòng)物是蜂。
[0113] 根據(jù)另一方面，觸發(fā)多核苷酸(例如dsRNA)通過(guò)宿主的食物遞送到宿主。本發(fā)明人 認(rèn)為在攝取本公開(kāi)的觸發(fā)多核苷酸之后，觸發(fā)多核苷酸可以呈現(xiàn)在例如宿主節(jié)肢動(dòng)物的宿 主血淋巴中，從而為寄生蟲(chóng)(例如瓦螨)可用。
[0114] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)的多核苷酸可以在體外合成，并添加到食物中。例如雙鏈RNA 可以通過(guò)在基因片段的末端添加兩個(gè)相反的啟動(dòng)子(例如T7啟動(dòng)子)合成，其中緊靠基因5' 端放置啟動(dòng)子，并且在相反取向上緊靠基因片段的3'端放置啟動(dòng)子。然后，所述dsRNA可以 用T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄。
[0115] 根據(jù)本公開(kāi)的方面用于合成dsRNA的序列的非限制性實(shí)例在SEQ ID N0:1-21中提 供。這些序列的全長(zhǎng)或片段可以用作模板。
[0116] 本申請(qǐng)?zhí)峁┎⒐_(kāi)了包含觸發(fā)多核苷酸和賦形劑物質(zhì)的組合物。在一個(gè)方面，賦 形劑可以是一種或多種非活性成分的組合。在一些方面，賦形劑包含糖。糖的實(shí)例包括己 糖、二糖、三糖和更高級(jí)的糖。賦形劑糖包括，例如，果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳 糖、核糖。在其他方面，賦形劑包含糖和溶劑。在其他方面，賦形劑包含蛋白質(zhì)。在一個(gè)方面， 蛋白質(zhì)是大豆蛋白。在其他方面，賦形劑是花粉。在根據(jù)本公開(kāi)的方面，賦形劑是蜂食物。
[0117] 在一些實(shí)施方案中，賦形劑包括選自糖、溶劑、蛋白質(zhì)、蜂食物和其任何組合的一 種或多種物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，糖選自果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳糖、核糖 和其任何組合。在一些實(shí)施方案中，蜂食物選自蜂蜜、花粉、乳清酵母、大豆粉、酵母、酵母產(chǎn) 品和其任何組合。
[0118] 蜂飼喂是養(yǎng)蜂者中常見(jiàn)的做法，用于提供營(yíng)養(yǎng)和其他，例如，補(bǔ)充需求。蜂通常以 蜂蜜和花粉為食，但已知也攝取非天然飼料。蜂可以被飼喂各種食物，包括但不限于，乳清 酵母（生長(zhǎng)在低脂干酪（cottage cheese)上的乳制品酵母）、大豆粉、酵母(例如啤酒酵母 (brewer's yeast)、圓酵母(torula yeast))和單獨(dú)或組合地飼喂的酵母制品，以及作為蜂 巢內(nèi)的干混合物或濕餅或者作為蜂巢外敞開(kāi)式飼喂器中的干混合物飼喂的大豆粉。糖或糖 漿也是可用的。在飼喂給蜂的補(bǔ)充物中加入10至12%的花粉改善適口性。加入25至％的花 粉提高蜂用于生命活動(dòng)所需的必需營(yíng)養(yǎng)物的質(zhì)量和數(shù)量。甘蔗或甜菜糖、異構(gòu)化玉米糖漿 和50型糖漿是蜜蜂的自然飲食中蜂蜜的令人滿意的替代品。后兩種只能作為液體供應(yīng)給 蜂?？赏ㄟ^(guò)例如下列方法中的任一種將液體飼料供應(yīng)給蜂巢內(nèi)的蜂:靠摩擦擰緊蓋子的桶 (friction-top pail)、育卵室內(nèi)的蜂房、柜式飼喂器、boardman飼喂器等?？赏ㄟ^(guò)在倒置的 內(nèi)罩上放置一鎊或兩鎊來(lái)飼喂干糖。水的供應(yīng)必須是蜂一直都可獲取的。在一個(gè)方面，設(shè)想 了其中存在漂浮的支持物(例如木片、軟木塞或塑料海綿）的盤(pán)或托盤(pán)。蜂的補(bǔ)充飼料的詳 述可在例如由 Standifer 等 1977,標(biāo)題為"Supplemental Feeding of Honey Bee Colonies"的USDA出版物（USDA，Agriculture Information Bulletin Νο·413)中找到。
[0119] 在一些實(shí)施方案中，蜂飼喂包括向宿主蜂提供選自由液體蜂可攝取組合物和固體 蜂可攝取組合物組成的組的蜂可攝取組合物。
[0120]在根據(jù)本公開(kāi)的方面，觸發(fā)多核苷酸（例如dsRNA)與賦形劑組合。在一個(gè)方面，觸 發(fā)多核苷酸(例如dsRNA)可以以觸發(fā)多核苷酸與賦形劑的一定比率提供。在一個(gè)方面，比率 是1份觸發(fā)多核苷酸對(duì)4份賦形劑。在一個(gè)方面，觸發(fā)多核苷酸與賦形劑的比率是1:1、1: 2、 1:5或1:10。在其他方面，觸發(fā)多核苷酸與賦形劑的比率是1:20、1 :25、1:30、1:40或更多。在 一個(gè)方面，觸發(fā)多核苷酸與賦形劑的比率是1:50。在根據(jù)本公開(kāi)的方面，比率可以被確定為 體積對(duì)體積比（v/v)、重量:重量比(w/w)或重量:體積比(w/v)。在某些方面，比率可以被表 達(dá)為體積對(duì)體積比（V/V)、重量:重量比(w/w)或重量:體積比(w/v)。
[0121] 在根據(jù)本公開(kāi)的方面，組合物可以包含與賦形劑組合的一定重量的觸發(fā)多核苷酸 (例如dsRNA)。在一個(gè)方面，觸發(fā)多核苷酸占組合物總重量的一定百分比。在一個(gè)方面，觸發(fā) 多核苷酸按重量計(jì)占組合物的約0.1%。在一個(gè)方面，觸發(fā)多核苷酸按重量計(jì)占組合物的約 0.2 %。在一個(gè)方面，觸發(fā)多核苷酸按重量計(jì)占組合物的約0.3 %。在另一個(gè)方面，觸發(fā)多核 苷酸按重量計(jì)占組合物的約0.4%。在一個(gè)方面，觸發(fā)多核苷酸按重量計(jì)占組合物的多達(dá) 0.5 %。在一個(gè)方面，觸發(fā)多核苷酸按重量計(jì)占組合物的多達(dá)0.6 %。在一個(gè)方面，觸發(fā)多核 苷酸按重量計(jì)占組合物的多達(dá)0.7%。在一個(gè)方面，觸發(fā)多核苷酸按重量計(jì)占組合物的多達(dá) 0.8%。在另一個(gè)方面，觸發(fā)多核苷酸按重量計(jì)占組合物的多達(dá)1.0%。在其他方面，觸發(fā)多 核苷酸按重量計(jì)占組合物的多達(dá)1.5%。在另外其他方面，觸發(fā)多核苷酸按重量計(jì)占組合物 的多達(dá)2.0%，或者2.5%。
[0122] 本公開(kāi)提供了并且包括具有按重量計(jì)0.1 %至5 %的觸發(fā)多核苷酸的組合物。在其 他方面，組合物包含按重量計(jì)0.1至4%、0.1至3%、0.1至2%、0.1至1%、0.1至2%、0.1至 3 %或0.1至4 %的觸發(fā)多核苷酸。在一個(gè)方面，組合物包含按重量計(jì)0.2 %至5 %的觸發(fā)多核 苷酸。在其他方面，組合物包含按重量計(jì)〇. 2至4%、0.2至3%、0.2至2%、0.2至1 %、0.2至 2%、0.2至3%或0.2至4%的觸發(fā)多核苷酸。在其他方面，組合物包含多達(dá)1 %、多達(dá)2%、多 達(dá)3%、多達(dá)4%或多達(dá)5%的觸發(fā)多核苷酸。在其他方面，組合物包含多達(dá)7.5%、多達(dá)10% 或多達(dá)15%的觸發(fā)多核苷酸。
[0123] 本公開(kāi)提供了并且包括具有0.01至20mg/ml的觸發(fā)多核苷酸的組合物。在一些方 面，組合物包含0.01至0 · lmg/ml、0 · 01至1 · Omg/ml、0 · 01至2 .Omg/ml、0 · 01至2 · 5mg/ml、0 · 01 至5mg/ml、0 · 01至10mg/ml、0.01至15mg/ml或0 · 01至20mg/ml的觸發(fā)多核苷酸。在一些方面， 組合物包含0 · 1 至1 · 〇mg/ml、0 · 1至2 · Omg/ml、0 · 1至2 · 5mg/ml、0 · 1 至5mg/ml、0 · 1 至10mg/ml、 0· 1至15mg/ml或0· 1至20mg/ml的觸發(fā)多核苷酸。在某些方面，組合物包含至少0.01μg/ml觸 發(fā)多核苷酸。在某些方面，組合物包含至少〇. lμg/ml觸發(fā)多核苷酸。在某些其他方面，組合 物包含至少l.〇μg/ml觸發(fā)多核苷酸。在另外其他方面，組合物包含至少10μg/ml觸發(fā)多核苷 酸。在另外其他方面，組合物包含至少15μg/ml觸發(fā)多核苷酸。在另外其他方面，組合物包含 至少20μg/ml觸發(fā)多核苷酸。在一個(gè)方面，組合物包含0.01至0.5mg/ml觸發(fā)多核苷酸。在一 個(gè)方面，組合物包含0.5至10mg/ml觸發(fā)多核苷酸。在一些方面，組合物包含0.5至1.0mg/ml、 0·5至2·0mg/ml、0·5至2·5mg/ml、0·5至5mg/ml、0·5至10mg/ml、0·5至15mg/ml或0·5至20mg/ ml的觸發(fā)多核苷酸。在一個(gè)方面，組合物包含1.0至10mg/ml觸發(fā)多核苷酸。在其他方面，組 合物包含0 · 01至0 · 02mg/ml、0 · 02至0 · 03mg/ml、0 · 03至0 · 04mg/ml、0 · 04至0 · 05mg/ml、0 · 05 至0·06mg/ml、0·06至0·07mg/ml、0·07至0·08mg/ml、0·08至0·09mg/ml、0·09至0·lmg/ml、 0.1至0.2mg/ml、0.2至0.3mg/ml、0.3至0.4mg/ml、0.4至0.5mg/ml、0.5至0.6mg/ml、0.6至 0·7mg/ml、0·7至0·8mg/ml、0·8至0·9mg/ml、0·9至1·0mg/ml、1·0至2·0mg/ml、1·0至2·5mg/ ml、2·0至3·0mg/ml、3·0至4·0mg/ml、4·0至5·0mg/ml、5·0至6·0mg/ml、6·0至7·0mg/ml、7·0 至8·0mg/ml、8·0至9·0mg/ml、9·0至10·0mg/ml、10·0至12·0mg/ml、12·0至13·0mg/ml、13·0 至14·0mg/ml、14·0至15·0mg/ml、15·0至16·0mg/ml、16·0至17·0mg/ml、17·0至18·0mg/ml、 18·0至19·Omg/ml、19·0至20·Omg/ml、1·0至5mg/ml、1·0至lOmg/ml、1·0至15mg/ml或1·0至 20mg/ml觸發(fā)多核苷酸。在一些方面，組合物包含約0. lug/ml、約0.2ug/ml、約0.5ug/ml、約 1.Oug/ml、約2.0ug/ml、約5.0ug/ml、約10ug/ml、約0.02mg/ml、約0.05mg/ml、約0·lmg/ml、 約0·125mg/ml、約0·2mg/ml、約0·25mg/ml、約0·3mg/ml、約0·4mg/ml、約0·5mg/ml、約0·6mg/ mUtO.Tmg/mUtO.Smg/mUtO.gmg/mUtl.Omg/mUtl.Smg/mUtS.Omg/mUtS.Smg/ 1111、約3.〇11^/1111、約3.511^/1111、約4.〇11^/1111、約4.511^/1111、約5.〇11^/1111、約5.511^/1111、約6.〇11^/ 1111、約6.511^/1111、約7.〇11^/1111、約7.511^/1111、約8.〇11^/1111、約8.511^/1111、約9.〇11^/1111、約9.511^/ ml、約10mg/ml、約1lmg/ml、約12mg/ml、約13mg/ml、約14mg/ml、約15mg/ml、約16mg/ml、約 17mg/ml、約 18mg/ml、約 19mg/ml 或約20mg/ml 觸發(fā)多核苷酸。
[0124] 在一些方面，組合物包含每蜂群約lmg至約2000mg觸發(fā)多核苷酸。在某些方面，組 合物包含每蜂群約lmg至約100mg、約lmg至約200mg、約lmg至約300mg、約lmg至約400mg、約 lmg至約500mg、約lmg至約600mg、約lmg至約700mg、約lmg至約800mg、約lmg至約900mg、約 lmg至約 lOOOmg、約 lmg至約 1200mg、約 lmg至約 1500mg、約 lmg至約 1800mg、約 10mg至約 100mg、約 10mg 至約200mg、約 10mg 至約300mg、約 10mg 至約 400mg、約 10mg 至約500mg、約 10mg 至約 600mg、約 10mg 至約700mg、約 10mg 至約800mg、約 10mg 至約900mg、約 10mg 至約 lOOOmg、約 10mg至約1200mg、約10mg至約1500mg、約10mg至約1800mg或約10mg至約2000mg觸發(fā)多核昔 酸。在其他方面，組合物包含每蜂群約lmg、約5mg、約10mg、約15mg、約20mg、約25mg、約30mg、 約35mg、約40mg、約45mg、約50mg、約60mg、約70mg、約80mg、約90mg、約lOOmg、約125mg、約 15〇11^、約17511^、約20〇11^、約25〇11^、約30〇11^、約35〇11^、約40〇11^、約45〇11^、約50〇11^、約 550mg、約600mg、約650mg、約700mg、約750mg、約800mg、約850mg、約900mg、約950mg、約 lOOOmg、約llOOmg、約1200mg、約1300mg、約1400mg、約1500mg、約1600mg、約1700mg、約 1800mg、約1900mg或約2000mg觸發(fā)多核苷酸。
[0125] 本公開(kāi)提供了并且包括，用于降低生物體的病毒載量的方法。在一些實(shí)施方案中， 生物體是寄生蟲(chóng)。在一個(gè)方面，病毒載量是指每單個(gè)宿主的病毒數(shù)量。在一個(gè)方面，病毒載 量是指每100個(gè)宿主生物體的平均病毒數(shù)量。在一個(gè)方面，病毒載量是指每寄生蟲(chóng)宿主群體 的病毒數(shù)量。在另一個(gè)方面，病毒載量是通過(guò)測(cè)量宿主(例如蜂或瓦螨）中的病毒表達(dá)來(lái)確 定。在根據(jù)本公開(kāi)的方面，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨，且宿主是蜜蜂意大利蜜蜂。
[0126] 在一個(gè)方面，降低病毒感染的方法包括向寄生蟲(chóng)以其為食的宿主生物體提供有效 量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物。在另一個(gè)方面，降低病毒感染的方法包括直接向寄生蟲(chóng)生物 體提供有效量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物。在根據(jù)本公開(kāi)的方面，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨，且宿 主是蜜蜂意大利蜜蜂。本公開(kāi)的有效量的組合物會(huì)在一段時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致宿主和/或寄生蟲(chóng)中 的病毒感染降低。在一個(gè)方面，在提供有效量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物的一天之內(nèi)或兩天 之內(nèi)可以測(cè)量病毒感染的降低。在一個(gè)方面，可以在兩天后測(cè)量病毒感染。在一個(gè)方面，可 以在3天后測(cè)量病毒感染。在其他方面，可以在4天后、5天后、6天后、7天后、1周后、2周后、3 周后或1月后測(cè)量病毒感染。在另一個(gè)方面，可以多于一次地測(cè)量病毒感染，例如，每天、每2 天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每周、每?jī)芍堋⒚咳?、一周一次、一周兩次、一周?次、一月一次、一月兩次或一月三次。在根據(jù)本公開(kāi)的某些方面，可以測(cè)量病毒感染的降低 并將其與未處理的對(duì)照宿主生物體、寄生蟲(chóng)或群體比較。在根據(jù)本公開(kāi)的方面，寄生蟲(chóng)是狄 斯瓦螨，且宿主是蜜蜂意大利蜜蜂。
[0127] 在一個(gè)方面，降低病毒復(fù)制的方法包括向寄生蟲(chóng)以其為食的宿主生物體提供有效 量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物。在另一個(gè)方面，降低病毒復(fù)制的方法包括直接向寄生蟲(chóng)生物 體提供有效量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物。在根據(jù)本公開(kāi)的方面，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨，且宿 主是蜜蜂意大利蜜蜂。本公開(kāi)的有效量的組合物會(huì)在一段時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致宿主和/或寄生蟲(chóng)中 的病毒基因表達(dá)降低。在一個(gè)方面，在提供有效量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物的一天之內(nèi)或 兩天之內(nèi)可以測(cè)量病毒基因表達(dá)的降低。在一個(gè)方面，可以在兩天后測(cè)量病毒復(fù)制。在一個(gè) 方面，可以在3天后測(cè)量病毒復(fù)制。在其他方面，可以在4天后、5天后、6天后、7天后、或1周 后、2周后、3周后或1月后測(cè)量病毒復(fù)制。在另一個(gè)方面，可以多于一次地測(cè)量病毒復(fù)制，例 如，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每周、每?jī)芍堋⒚咳?、一周一次、一?兩次、一周三次、一月一次、一月兩次或一月三次。在根據(jù)本公開(kāi)的某些方面，可以測(cè)量病毒 復(fù)制的降低并將其與未處理的對(duì)照宿主生物體、寄生蟲(chóng)或群體比較。在根據(jù)本公開(kāi)的方面， 寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨，且宿主是蜜蜂意大利蜜蜂。
[0128] 在一個(gè)方面，降低病毒載量的方法包括向寄生蟲(chóng)以其為食的宿主生物體提供有效 量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物。在另一個(gè)方面，降低病毒載量的方法包括直接向寄生蟲(chóng)生物 體提供有效量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物。在根據(jù)本公開(kāi)的方面，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨，且宿 主是蜜蜂意大利蜜蜂。本公開(kāi)的有效量的組合物會(huì)在一段時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致宿主和/或寄生蟲(chóng)中 的病毒載量降低。在一個(gè)方面，在提供有效量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物的一天之內(nèi)或兩天 之內(nèi)測(cè)量病毒載量的降低。在一個(gè)方面，可以在兩天后測(cè)量病毒載量。在一個(gè)方面，可以在3 天后測(cè)量病毒載量。在其他方面，可以在4天后、5天后、6天后、7天后、1周后、2周后、3周后或 1月后測(cè)量病毒載量。在另一個(gè)方面，可以多于一次地測(cè)量病毒載量，例如，每天、每2天、每3 天、每4天、每5天、每6天、每7天、每周、每?jī)芍堋⒚咳?、一月一次、一月兩次或一月三次。?根據(jù)本公開(kāi)的某些方面，可以測(cè)量病毒載量的降低并將其與未處理的對(duì)照宿主生物體、寄 生蟲(chóng)或群體比較。在根據(jù)本公開(kāi)的方面，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨，且宿主是蜜蜂意大利蜜蜂。
[0129] 在根據(jù)本公開(kāi)的一些方面，在一段時(shí)間后病毒載量的降低或病毒感染的降低意味 著病毒滴度的降低。在一個(gè)方面，病毒滴度在測(cè)量之間降低約10%、20%、30%或更多。在另 一個(gè)方面，病毒滴度在測(cè)量之間降低約40%或更多。在另一個(gè)方面，病毒滴度在測(cè)量之間降 低約50%或更多。在另一個(gè)方面，病毒滴度在測(cè)量之間降低約60%或更多。在另一個(gè)方面， 病毒滴度在測(cè)量之間降低約70%或更多。在另一個(gè)方面，病毒滴度在測(cè)量之間降低約80% 或更多。在另一個(gè)方面，病毒滴度在測(cè)量之間降低約90%或更多。在一些實(shí)施方案中，與未 提供觸發(fā)多核苷酸的宿主生物體或寄生蟲(chóng)中的病毒滴度相比，提供了有效量的觸發(fā)多核苷 酸的宿主生物體或寄生蟲(chóng)中的病毒滴度降低至少約1〇%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%或90%。在一些實(shí)施方案中，在提供觸發(fā)多核苷酸1天內(nèi)、2天內(nèi)、2天后、3天后、4 天后、5天后、6天后、7天后、或1周后、2周后、3周后或1月后測(cè)量病毒滴度。在一些實(shí)施方案 中，多于一次地測(cè)量病毒滴度。在一些實(shí)施方案中，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6 天、每7天、每周、每?jī)芍堋⒚咳?、一月一次、一月兩次或一月三次測(cè)量病毒滴度。在一個(gè)方 面，宿主生物體是蜂。在一個(gè)方面，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。
[0130] 在根據(jù)本公開(kāi)的一些方面，在一段時(shí)間后病毒載量的降低或病毒感染的降低意味 著病毒表達(dá)的降低。在一個(gè)方面，病毒表達(dá)在測(cè)量之間降低約10%、20%、30%或更多。在另 一個(gè)方面，病毒表達(dá)在測(cè)量之間降低約40 %或更多。在另一個(gè)方面，病毒表達(dá)在測(cè)量之間降 低約50 %或更多。在另一個(gè)方面，病毒表達(dá)在測(cè)量之間降低約60 %或更多。在另一個(gè)方面， 病毒表達(dá)在測(cè)量之間降低約70%或更多。在另一個(gè)方面，病毒表達(dá)在測(cè)量之間降低約80% 或更多。在另一個(gè)方面，病毒表達(dá)在測(cè)量之間降低約90%或更多。在一些實(shí)施方案中，與未 提供觸發(fā)多核苷酸的宿主生物體或寄生蟲(chóng)中的病毒表達(dá)相比，提供了有效量的觸發(fā)多核苷 酸的宿主生物體或寄生蟲(chóng)中的病毒表達(dá)降低至少約1〇%、20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%或90%。在一些實(shí)施方案中，在提供觸發(fā)多核苷酸1天內(nèi)、2天內(nèi)、2天后、3天后、4 天后、5天后、6天后、7天后、或1周后、2周后、3周后或1月后測(cè)量病毒表達(dá)。在一些實(shí)施方案 中，多于一次地測(cè)量病毒表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6 天、每7天、每周、每?jī)芍?、每三周、一月一次、一月兩次或一月三次測(cè)量病毒表達(dá)。在一個(gè)方 面，宿主生物體是蜂。在一個(gè)方面，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。
[0131 ]在根據(jù)本公開(kāi)的一些方面，在一段時(shí)間后病毒載量的降低或病毒感染的降低意味 著病毒復(fù)制的降低。在一個(gè)方面，病毒復(fù)制在測(cè)量之間降低約10%、20%、30%或更多。在另 一個(gè)方面，病毒復(fù)制在測(cè)量之間降低約40%或更多。在另一個(gè)方面，病毒復(fù)制在測(cè)量之間降 低約50%或更多。在另一個(gè)方面，病毒復(fù)制在測(cè)量之間降低約60%或更多。在另一個(gè)方面， 病毒復(fù)制在測(cè)量之間降低約70%或更多。在另一個(gè)方面，病毒復(fù)制在測(cè)量之間降低約80% 或更多。在另一個(gè)方面，病毒復(fù)制在測(cè)量之間降低約90%或更多。在一些實(shí)施方案中，與未 提供觸發(fā)多核苷酸的宿主生物體或寄生蟲(chóng)中的病毒復(fù)制相比，提供了有效量的觸發(fā)多核苷 酸的宿主生物體或寄生蟲(chóng)中的病毒復(fù)制降低至少約10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70%、80%或90%。在一些實(shí)施方案中，在提供觸發(fā)多核苷酸1天內(nèi)、2天內(nèi)、2天后、3天后、4 天后、5天后、6天后、7天后、或1周后、2周后、3周后或1月后測(cè)量病毒復(fù)制。在一些實(shí)施方案 中，多于一次地測(cè)量病毒復(fù)制。在一些實(shí)施方案中，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6 天、每7天、每周、每?jī)芍?、每三周、一月一次、一月兩次或一月三次測(cè)量病毒復(fù)制。在一個(gè)方 面，宿主生物體是蜂。在一個(gè)方面，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。
[0132] 在根據(jù)本公開(kāi)的方面，在一段時(shí)間后病毒載量的降低導(dǎo)致蜂死亡率的降低。在一 個(gè)方面，蜂死亡率在測(cè)量之間降低10 %、20 %、30 %或更多。在另一個(gè)方面，蜂死亡率在測(cè)量 之間降低40%或更多。在另一個(gè)方面，蜂死亡率在測(cè)量之間降低50%或更多。在另一個(gè)方 面，蜂死亡率在測(cè)量之間降低60%或更多。在另一個(gè)方面，蜂死亡率在測(cè)量之間降低70%或 更多。在另一個(gè)方面，蜂死亡率在測(cè)量之間降低80 %或更多。在另一個(gè)方面，蜂死亡率在測(cè) 量之間降低90%或更多。在一些實(shí)施方案中，與未提供觸發(fā)多核苷酸的蜂群中蜂死亡率相 比，提供了有效量的觸發(fā)多核苷酸的蜂群中蜂死亡率降低至少約10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%或90%。在一些實(shí)施方案中，在提供觸發(fā)多核苷酸1天內(nèi)、2天內(nèi)、2天 后、3天后、4天后、5天后、6天后、7天后、或1周后、2周后、3周后或1月后測(cè)量蜂死亡率。在一 些實(shí)施方案中，多于一次地測(cè)量蜂死亡率。在一些實(shí)施方案中，每天、每2天、每3天、每4天、 每5天、每6天、每7天、每周、每?jī)芍?、每三周、一月一次、一月兩次或一月三次測(cè)量蜂死亡率。
[0133] 在根據(jù)本公開(kāi)的方面，有效量的觸發(fā)多核苷酸(例如dsRNA)可以周期性地或連續(xù) 地提供。在一個(gè)方面，有效量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物可以一天一次、兩次或三次提供。在 一個(gè)方面，有效量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物可以一天一次提供。在一個(gè)方面，有效量的觸 發(fā)（例如dsRNA)組合物可以每隔一天一次或多次提供。在一個(gè)方面，有效量的觸發(fā)（例如 dsRNA)組合物可以每?jī)商臁⒚咳?、每四天、每五天、每六天或一周一次提供。在一個(gè)方面， 有效量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物可以連續(xù)提供給有需要的生物體，例如通過(guò)提供連續(xù)的 食物來(lái)源。在一個(gè)方面，有效量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物可以作為蜂可攝取的組合物連續(xù) 提供。在一個(gè)方面，有效量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物可以提供給宿主生物體。在另一個(gè)方 面，有效量的觸發(fā)（例如dsRNA)組合物可以直接提供給寄生蟲(chóng)生物體。在根據(jù)本公開(kāi)的方 面，寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨，且宿主是蜜蜂意大利蜜蜂。
[0134] 本公開(kāi)提供了用于減少蜜蜂群的病毒載量的方法，所述方法包括向蜂群提供有效 量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物。本公開(kāi)的有效量的觸發(fā)多核苷酸組合物會(huì)在一段時(shí)間內(nèi)導(dǎo) 致病毒基因表達(dá)和病毒復(fù)制的降低。在一個(gè)方面，在提供有效量的觸發(fā)(例如dsRNA)組合物 的一天之內(nèi)或兩天之內(nèi)測(cè)量病毒復(fù)制或病毒表達(dá)的降低。在一個(gè)方面，可以在兩天后測(cè)量 病毒復(fù)制或病毒表達(dá)的降低。在一個(gè)方面，可以在3天后測(cè)量病毒復(fù)制或病毒表達(dá)的降低。 在其他方面，可以在4天后、5天后、6天后、7天后、1周后、2周后、3周后或1月后測(cè)量病毒復(fù)制 或病毒表達(dá)的降低。在另一個(gè)方面，可以多于一次地測(cè)量病毒復(fù)制或病毒表達(dá)的降低，例 如，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每周、每?jī)芍?、每三周、一月一次、一?兩次或一月三次。在根據(jù)本公開(kāi)的某些方面，可以測(cè)量病毒復(fù)制或病毒表達(dá)的降低并將其 與未處理的對(duì)照宿主生物體、寄生蟲(chóng)或群體比較。
[0135] 在一個(gè)方面，本公開(kāi)提供了用于減少蜂對(duì)病毒感染的易感性的方法和組合物。在 其他方面，本公開(kāi)提供了用于預(yù)防蜂群的病毒感染的方法和組合物。在另一個(gè)方面，本公開(kāi) 提供了用于減少由狄斯瓦螨傳播的蜜蜂的病毒感染的方法。
[0136] 以下實(shí)施例出于說(shuō)明的目的而呈現(xiàn)并且不應(yīng)該解釋為限制。
[0137] 實(shí)施例1
[0138] 為了測(cè)試靶向瓦螨中蜂病毒的dsRNA的效果，將螨蟲(chóng)放置在補(bǔ)充有dsRNA觸發(fā)物混 合物的飲食板上。與瓦螨基因沒(méi)有超過(guò)19個(gè)堿基對(duì)(bp)的序列同一性的非特異性dsRNA用 作非特異性對(duì)照（SCRAM;SEQIDN0 :24)。收集瓦螨，提取RNA，并使用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Q-PCR)分析DWV或IAPV的表達(dá)。
[0139] 實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
[0140]首先，制備如下表1的人工飲食：
[0141]表1:人工飲食成分
[0143] 在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，dsRNA觸發(fā)物混合物包含來(lái)自以下dsRNA序列的SEQIDN0:l-10的 混合物：
[0144] 表2:瓦螨直接飼喂測(cè)定中使用的dsRNA觸發(fā)物序列
[0148] 板冷卻后，每板上放置15只瓦螨。然后將板用吸水紙、石蠟?zāi)っ芊獠⒃?9°C的保溫 箱中孵育72KLB瓊脂處理72h后，對(duì)死的/活的螨蟲(chóng)計(jì)數(shù)。如圖2A所示，沒(méi)有觀察到蜂病毒觸 發(fā)物混合物對(duì)瓦螨死亡率的影響。
[0149] 將活的和死的瓦螨都收集起來(lái)用于RNA提取，并且通過(guò)Q-PCR或quantiGene? Plex 2.0(4€€711161：1^1的1^^測(cè)定平臺(tái)）分析蜂病毒水平和復(fù)制。圖213示出了在用蜂病毒觸 發(fā)物混合物處理后72h，與對(duì)照相比，通過(guò)Q-PCR分析的瓦螨中DWV水平下降。
[0150] 實(shí)施例2
[0151] 為了測(cè)試靶向蜂病毒的dsRNA對(duì)小型蜂箱環(huán)境中的蜜蜂和瓦螨的病毒載量（IAPV 或DWV)的效果，將蜜蜂放置在補(bǔ)充有一種或多種靶向蜂病毒的dsRNA觸發(fā)物(例如，SEQ ID NO: 1-10和21)的飲食中。與瓦螨基因沒(méi)有超過(guò)19bp的序列同一性的非特異性dsRNA用作非 特異性對(duì)照（SCRAM;例如SEQ ID N0:22、23或24)。空白對(duì)照不含dsRNA。
[0152] 鑒定出具有高病毒載量和瓦螨載量的蜂箱。然后，用來(lái)自所鑒定出的高瓦螨和高 病毒載量蜂箱的400-600只蜂(2杯(cup))、巢礎(chǔ)框和蜂王在帶有少量護(hù)衛(wèi)蜂的王臺(tái)中組裝 小型蜂箱。所述王臺(tái)用糖果密封。在裝填蜂箱的同時(shí)，收集零時(shí)間的蜂和瓦螨的樣品（每個(gè) 蜂巢的1杯蜂）。將樣品冷凍(_70°C)，從冷凍杯收集瓦螨，并且準(zhǔn)備蜂和瓦螨樣品用于Q-PCR 或QuantiGene 分析。在初始時(shí)間點(diǎn)確定蜜蜂和瓦螨中的病毒載量。
[0153]對(duì)小型蜂箱飼喂66%的蔗糖溶液和蛋白質(zhì)糕，并放置在暗蓋下的干凈房屋中24小 時(shí)以改善蜂王的居住。蜂王居住后，將暗蓋去除，并給蜂飼喂含有靶向多種蜂病毒的dsRNA 混合物(濃度為lyg/蜂至l〇yg/蜂)的糖溶液。
[0154] 收集蜂樣品，每4-5天每蜂箱10只蜂。使用QG(Af f ymetr iX的1 ex 2.0 RNA測(cè)定平臺(tái)）分析所收集的蜂以確定病毒載量。與飼喂補(bǔ)充了非特異性dsRNA的飲食 的蜂相比，飼喂靶向蜂病毒的dsRNA的蜂病毒載量有所減少。
[0155] 每4-5天從每個(gè)蜂箱使用糖搖機(jī)收集瓦螨:從每個(gè)小型蜂箱取一杯蜂，并且將兩匙 糖粉放入帶有沖孔封口器的容器中?；蝿?dòng)并上下顛倒杯-瓦螨從封口器的孔中掉落而蜂留 在杯中。將蜂重新放回小型蜂箱中，并使用QG(Affymetrix的QuantiGene KPlex 2.0 RNA 測(cè)定平臺(tái)）分析瓦螨以確定病毒載量。與從飼喂補(bǔ)充了非特異性dsRNA的飲食的蜂中收集的 瓦螨相比，從飼喂靶向蜂病毒的dsRNA的蜂中收集的瓦螨病毒載量有所減少。
[0156] 對(duì)冷凍蜜蜂或瓦螨樣品的總裂解物執(zhí)行(定量的不基于擴(kuò)增的核酸 檢測(cè)分析）以測(cè)量病毒表達(dá)和病毒復(fù)制。用于QuantiGeneKPlex 2.0測(cè)定的寡核苷酸探針 由Affymetrix設(shè)計(jì)和供應(yīng)，其中使用蜂病毒序列的有義鏈作為模板或負(fù)鏈用于復(fù)制病毒。 看家基因探針從意大利蜜蜂肌動(dòng)蛋白、核糖體蛋白亞基5(RPS5)和核糖體蛋白49(RP49)的 序列設(shè)計(jì)。QuantiGeiie^HlJ定根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)（Affymetrix，Inc ·，User Manual， 2010)進(jìn)行，其中在樣品與寡核苷酸探針雜交前添加了熱變性步驟。將20yL體積的樣品與5μ 1所供應(yīng)的探針組在PCR微板的孔中混合，接著用熱循環(huán)儀在95°C下加熱5分鐘。經(jīng)熱處理的 樣品保持在46°C直到使用。將25μ1的樣品轉(zhuǎn)移至Affymetrix雜交板用于過(guò)夜雜交。從熱循 環(huán)儀中去除所述板之前，將75μ1含剩余組分的雜交緩沖液添加到每個(gè)樣品孔。然后從熱循 環(huán)儀中去除PCR微板，并且將每孔的內(nèi)容物(~100μΙ)轉(zhuǎn)移到雜交板(Affymetrix)的對(duì)應(yīng)孔 中用于過(guò)夜雜交。信號(hào)放大后，在Luminex 200機(jī)器(Luminex Corporation)上捕獲每個(gè)樣 品的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。
[0157] 實(shí)施例3
[0158] 為了測(cè)試靶向DWV或IAPV的dsRNA在蜜蜂和瓦螨中的效果，將蜜蜂置于補(bǔ)充有選自 靶向DWV的SEQIDN0 :5-9和靶向IAPV的SEQIDN0:l-4和10的dsRNA觸發(fā)物混合物的飲食 中。與瓦螨基因沒(méi)有超過(guò)19bp的序列同一性的非特異性dsRNA用作對(duì)照（SCRAM; SEQ ID N0: 22 或 23)。
[0159] 鑒定出具有高病毒載量和瓦螨載量的蜂箱。圖3示出了瓦螨載量和DWV水平的樣品 定量。然后，用來(lái)自所鑒定出的高瓦螨和高病毒載量蜂箱的400-600只蜂(2杯）、巢礎(chǔ)框和蜂 王在帶有少量護(hù)衛(wèi)蜂的王臺(tái)中組裝小型蜂箱。所述王臺(tái)用糖果密封。
[0160]對(duì)小型蜂箱飼喂66%的蔗糖溶液和蛋白質(zhì)糕，并放置在暗蓋下的干凈房屋中24小 時(shí)以改善蜂王的居住。馴化2天后，對(duì)蜂以lyg/蜂至1 〇yg/蜂的濃度飼喂僅糖溶液(C0N)、含 有非特異性對(duì)照dsRNA的糖溶液(SCR)或含有靶向多種蜂病毒的dsRNA混合物(SEQ ID N0: 1-10;MIX)的糖溶液。
[0161] 蜂箱感染后，每4-5天從每個(gè)蜂箱收集10只蜂。如實(shí)施例2中所述，通過(guò) QuantiGenZ分析所收集的蜂，以平均熒光強(qiáng)度(MFI)確定病毒復(fù)制。
[0162] 圖4示出了與飼喂僅糖溶液(C0N)或補(bǔ)充了非特異性dsRNA的飲食(SCR)的蜂相比， 所有飼喂靶向病毒的dsRNA混合物(MIX)的蜂中的DWV復(fù)制有所降低。在蜂中處理后4、8和14 天，使用QuantiGene 15分析測(cè)量DWV病毒的復(fù)制。結(jié)果顯示，從第8天起，DWV的復(fù)制在兩個(gè) 對(duì)照(C0N和SCR)中增加，但是在用靶向病毒的dsRNA混合物(MIX)處理的蜂中不增加，這表 明所述靶向病毒的dsRNA混合物在抑制病毒復(fù)制中是有效的。
[0163] 實(shí)施例4
[0164] 這是如實(shí)施例1中所述的瓦螨直接飼喂實(shí)驗(yàn)的另一個(gè)實(shí)例。為了測(cè)試靶向瓦螨中 蜂病毒的dsRNA的效果，將螨蟲(chóng)放置在補(bǔ)充有dsRNA觸發(fā)物混合物的飲食板上。與瓦螨基因 沒(méi)有超過(guò)19bp的序列同一性的非特異性dsRNA用作非特異性對(duì)照（SEQ ID N0: 22或23)?？?白對(duì)照不含dsRNA。收集瓦螨，提取RNA，并用QuantiGene"^析Plex 2.0(Affymetrix的 RNA測(cè)定平臺(tái)）分析DWV或IAPV的表達(dá)。
[0165] 實(shí)驗(yàn)過(guò)程：
[0166] 首先，制備如下表3的人工飲食：
[0167] 表3:人工飲食成分
[0169] 所述dsRNA觸發(fā)物混合物包含SEQ ID從):2-6和8-10(每種125以8/1111)的混合物。
[0170] 板冷卻后，每板上放置15只瓦螨。然后將板用吸水紙、石蠟?zāi)っ芊獠⒃?9°C的保溫 箱中孵育72h。收集活的瓦螨用于RNA提取，并且通過(guò)QuantiGene?Plex 2.0(Affymet;rix 的RNA測(cè)定平臺(tái)）分析蜂病毒水平和復(fù)制。
[0171] 圖5A示出了在用蜂病毒觸發(fā)物混合物處理后72h，與空白對(duì)照和非特異性dsRNA相 比，瓦螨中DWV水平下降。類似地，圖5B示出了在用蜂病毒觸發(fā)物混合物處理后72h，與空白 對(duì)照和非特異性dsRNA相比，瓦螨中IAPV水平下降。
[0172] 實(shí)施例5
[0173] 為了測(cè)試靶向蜂病毒的dsRNA對(duì)蜂盒環(huán)境(實(shí)驗(yàn)室條件）中的蜜蜂的DWV病毒載量 和復(fù)制的效果，將蜜蜂從野外商業(yè)蜂箱中取出并放置在蜂盒中，所述蜂盒被飼喂補(bǔ)充了選 自靶向 DMV的 SEQ ID N0:5、6、8和9中（T1 = SEQ ID N0:5、T2 = SEQ ID N0:6、T3 = SEQ ID NO:8和T4 = SEQ ID NO:9)的單獨(dú)的dsRNA觸發(fā)物或這些dsRNA觸發(fā)物的混合物的66%的糖 漿。與蜜蜂基因沒(méi)有超過(guò)19bp的序列同一性的非特異性d SRNA(SEQIDN0:22或23)用作非 特異性對(duì)照?？瞻讓?duì)照不含dsRNA。
[0174] 鑒定出具有高病毒載量的蜂箱。然后用來(lái)自所鑒定出的高病毒載量的5只蜂組裝 蜂盒。在裝填蜂盒的同時(shí)，收集零時(shí)間的蜂樣品。將樣品冷凍(_70°C)。在初始時(shí)間點(diǎn)確定蜜 蜂中的病毒載量。
[0175] 給蜂盒飼喂66%的蔗糖溶液。馴化2天后，對(duì)蜂飼喂含有單獨(dú)的或混合的靶向DMV 的dsRNA(lyg/蜂至10yg/蜂的濃度）、含有非特異性dsRNA對(duì)照或不含dsRNA的糖溶液。另外3 天后，再次對(duì)蜂飼喂相同的糖溶液。
[0176] 第二次處理4天和10天后，從每個(gè)處理組收集24只蜂。通過(guò)QuamiGene?Plex 2.0分析所收集的蜂以確定病毒載量和病毒復(fù)制。
[0177] 圖6A示出了相比于兩個(gè)對(duì)照，dsRNA觸發(fā)物混合物和單獨(dú)的觸發(fā)物對(duì)抑制蜂中的 DWV載量均有效，其中T1和T4展示出更大的效果。圖6B示出對(duì)蜂中的DWV復(fù)制類似的效果，也 是T1和T4示出更大的效果。
[0178] 實(shí)施例6
[0179] 為了測(cè)試靶向蜂病毒的dsRNA對(duì)蜂盒環(huán)境(實(shí)驗(yàn)室條件）中的蜜蜂的IAPV病毒載量 和復(fù)制的效果，將蜜蜂從野外商業(yè)蜂箱中取出并放置在蜂盒中，所述蜂盒被飼喂補(bǔ)充了選 自靶向 IAPV 的 SEQ ID N0:2-4 和 10 中（T5 = SEQ ID N0:2、T6 = SEQ ID N0:3、T7 = SEQ ID N0:4和T8 = SEQ ID NO: 10)的單獨(dú)的dsRNA觸發(fā)物或這些dsRNA觸發(fā)物的混合物的66%的糖 漿。與蜜蜂基因沒(méi)有超過(guò)19bp的序列同一性的非特異性d SRNA(SEQIDN0:22或23)用作非 特異性對(duì)照?？瞻讓?duì)照不含dsRNA。
[0180] 鑒定出具有高病毒載量的蜂箱。然后用來(lái)自所鑒定出的高病毒載量的5只蜂組裝 蜂盒。在裝填蜂盒的同時(shí)，收集零時(shí)間的蜂樣品。將樣品冷凍(_70°C)。在初始時(shí)間點(diǎn)確定蜜 蜂中的病毒載量。
[0181] 給蜂盒飼喂66 %的蔗糖溶液。馴化2天后，對(duì)蜂飼喂含有單獨(dú)的或混合的靶向DMV 的dsRNA(lyg/蜂至10yg/蜂的濃度）、含有非特異性dsRNA對(duì)照或不含dsRNA的糖溶液。另外3 天后，再次對(duì)蜂飼喂相同的糖溶液。
[0182] 第二次處理4天和10天后，從每個(gè)處理組收集24只蜂。通過(guò)QuantiGene>lex 2.0分析所收集的蜂以確定病毒載量和病毒復(fù)制。
[0183] 圖7A示出了與對(duì)照相比，T5和T6有效抑制IAPV載量。圖7B示出了與被飼喂補(bǔ)充了 非特異性dsRNA的飲食的蜂相比，除混合物和T8之外，在被飼喂靶向IAPV序列的dsRNA的所 有蜂中病毒復(fù)制都受到抑制。
[0184] 實(shí)施例7
[0185] 為了測(cè)試靶向蜂病毒的dsRNA對(duì)蜂盒環(huán)境(實(shí)驗(yàn)室條件）中的蜜蜂的LSV病毒載量 和復(fù)制的效果，將蜜蜂從野外商業(yè)蜂箱中取出并放置在蜂盒中，所述蜂盒被飼喂補(bǔ)充了選 自SEQ ID N0:11-20中的五種dsRNA觸發(fā)物混合物的66%的糖漿。測(cè)試了兩種dsRNA觸發(fā)物 混合物。包含SEQIDN0:11、13、14、17和18的混合物A，和包含SEQIDN0:12、15、16、19和20 的混合物B，具有以下dsRNA序列：
[0186] 表4:靶向LSV的dsRNA觸發(fā)物序列
[0190] 與蜜蜂基因沒(méi)有超過(guò)19bp的序列同一性的非特異性dsRNA(SEQ ID N0:22或23)用 作對(duì)照?？瞻讓?duì)照不含dsRNA。
[0191] 鑒定出具有高病毒載量的蜂箱。然后用來(lái)自所鑒定出的高病毒載量的5只蜂組裝 蜂盒。在裝填蜂盒的同時(shí)，收集零時(shí)間的蜂樣品。將樣品冷凍(_70°C)。在初始時(shí)間點(diǎn)確定蜜 蜂中的病毒載量。
[0192] 給蜂盒飼喂66 %的蔗糖溶液。馴化2天后，對(duì)蜂飼喂含有單獨(dú)的或混合的靶向DMV 的dsRNA(lyg/蜂至10yg/蜂的濃度）、含有非特異性dsRNA對(duì)照或不含dsRNA的糖溶液。另外3 天后，再次對(duì)蜂飼喂相同的糖溶液。
[0193] 第二次處理4天和10天后，從每個(gè)處理組收集24只蜂。通過(guò)QuantiGeneK'Plex 2.0分析所收集的蜂以確定病毒載量。
[0194] 圖8示出了與對(duì)照相比，混合物A和混合物B都有效地抑制LSV載量，其中混合物B展 示出更大的效果。與被飼喂補(bǔ)充了非特異性dsRNA的飲食的蜂箱相比，被飼喂補(bǔ)充了靶向 LSV序列的dsRNA的飲食的蜂箱中LSV載量有所降低。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于在狄斯瓦螨中減少病毒載量或抑制病毒復(fù)制的方法，所述方法包括：向所 述狄斯瓦螨施用包含有效量的至少一種觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷酸包含下 調(diào)所述狄斯瓦螨中的蜂病毒基因表達(dá)的核酸序列，從而在所述狄斯瓦螨中降低病毒載量或 抑制病毒復(fù)制。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述施用是通過(guò)將所述有效量的所述至少一種觸 發(fā)多核苷酸飼喂給宿主蜂來(lái)實(shí)現(xiàn)的。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述飼喂包括向所述宿主蜂提供選自由液體蜂可 攝取組合物和固體蜂可攝取組合物組成的組的蜂可攝取組合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述宿主蜂是蜜蜂。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述蜜蜂是采集蜂或巢蜂。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一種觸發(fā)多核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9 或10種不同的觸發(fā)多核苷酸的混合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述不同的觸發(fā)多核苷酸靶向不同的病毒、或靶向 相同病毒的不同基因、或靶向病毒基因的不同片段。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述病毒選自由急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅病毒 (DWV)、克什米爾蜂病毒(KBV)、黑蜂王臺(tái)病毒(BQCV)、囊狀幼蟲(chóng)病病毒(SBV)、慢性蜂麻痹病 毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、無(wú)脊椎動(dòng)物虹彩病毒6型（IIV-6)、 狄斯瓦螨病毒(VDV-1)和Kakugo病毒(KV)組成的組。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一種觸發(fā)多核苷酸與所述蜂病毒基因的 至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述至少一種觸發(fā)多核苷酸包含與選自由SEQ ID 勵(lì):1-21組成的組的序列具有至少約80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或 99%的序列同一性或互補(bǔ)性，或具有100%的序列同一性或互補(bǔ)性的核酸序列。11. 一種用于減少蜂對(duì)蜂病毒引起的疾病的易感性的方法，所述方法包括：向所述蜂的 寄生蟲(chóng)提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基因的 至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而抑制所述寄生蟲(chóng)中 的病毒復(fù)制并降低所述蜂對(duì)所述蜂病毒引起的疾病的易感性。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述蜂是蜜蜂。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述蜜蜂是采集蜂或巢蜂。14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。15. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述觸發(fā)多核苷酸包含與選自由SEQ ID NO:1_ 10和21組成的組的序列具有至少約80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或 99%的序列同一性或互補(bǔ)性，或具有100%的序列同一性或互補(bǔ)性的核酸序列。16. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述蜂病毒選自由急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅 病毒(DWV)、克什米爾蜂病毒(KBV)、黑蜂王臺(tái)病毒(BQCV)、囊狀幼蟲(chóng)病病毒(SBV)、慢性蜂麻 痹病毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、無(wú)脊椎動(dòng)物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)和Kakugo病毒(KV)組成的組。17. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述疾病是蜂群衰竭失調(diào)癥(CCD)。18. -種用于降低瓦螨中的病毒載量的方法，所述方法包括:對(duì)所述瓦螨施用包含有效 量的觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸 的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而抑制所述瓦螨中的病毒復(fù)制。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述組合物包含2、3、4、5、6、7、8、9或10種不同的 觸發(fā)多核苷酸的混合物。20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述觸發(fā)多核苷酸是單鏈DNA(ssDNA)、單鏈RNA (ssRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、雙鏈DNA(dsDNA)或雙鏈DNA-RNA雜合體。21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述觸發(fā)多核苷酸是dsRNA。22. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述觸發(fā)多核苷酸包含與選自由SEQ ID NO:1-10和21組成的組的序列具有至少約80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或 99%的序列同一性或互補(bǔ)性，或具有100%的序列同一性或互補(bǔ)性的核酸序列。23. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述蜂病毒選自由急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅 病毒(DWV)、克什米爾蜂病毒(KBV)、黑蜂王臺(tái)病毒(BQCV)、囊狀幼蟲(chóng)病病毒(SBV)、慢性蜂麻 痹病毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、無(wú)脊椎動(dòng)物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)和Kakugo病毒(KV)組成的組。24. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述施用是通過(guò)對(duì)所述狄斯瓦螨噴灑包含所述 觸發(fā)多核苷酸的所述組合物，或通過(guò)直接對(duì)所述狄斯瓦螨飼喂包含所述觸發(fā)多核苷酸的所 述組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。25. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述施用是通過(guò)在節(jié)肢動(dòng)物血淋巴中提供包含 所述觸發(fā)多核苷酸的所述組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述節(jié)肢動(dòng)物是蜂。27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述蜂是蜜蜂。28. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述組合物包含按重量計(jì)0.1%至5%的觸發(fā)多 核苷酸。29. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述組合物包含按重量計(jì)多達(dá)1 %、2%、3%、 4%、5%、7.5%、10%或15%的觸發(fā)多核苷酸。30. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述組合物包含0.01至20mg/ml的觸發(fā)多核苷 酸。31. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述組合物還包含賦形劑。32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述賦形劑包括選自糖、溶劑、蛋白質(zhì)、蜂食物和 其任何組合的一種或多種物質(zhì)。33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述糖選自果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、半 乳糖、核糖和其任何組合。34. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)為大豆蛋白。35. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述蜂食物選自蜂蜜、花粉、乳清酵母、大豆粉、 酵母、酵母產(chǎn)品和其任何組合。36. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述組合物一天一次、一天兩次、一天三次、每隔 一天一次或多次、每?jī)商?、每三天或每周一次提供?7. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述組合物作為蜂可攝取組合物連續(xù)提供。38. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述病毒載量通過(guò)測(cè)量病毒滴度定量。39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述病毒滴度在施用包含所述觸發(fā)多核苷酸的 所述組合物的1天內(nèi)、1天后、2天后、3天后、4天后、5天后或1周后測(cè)量。40. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中多于一次地測(cè)量所述病毒滴度。41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中每3天、每5天、每周或每月一次測(cè)量所述病毒滴 度。42. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述病毒滴度與未用所述觸發(fā)多核苷酸處理時(shí) 相比降低 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多。43. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中通過(guò)測(cè)量病毒表達(dá)定量所述病毒載量。44. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述病毒表達(dá)在施用包含所述觸發(fā)多核苷酸的 所述組合物的1天內(nèi)、1天后、2天后、3天后、4天后、5天后或1周后測(cè)量。45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中多于一次地測(cè)量所述病毒表達(dá)。46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中每3天、每5天、每周或每月一次測(cè)量所述病毒表 達(dá)。47. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述病毒表達(dá)與未用所述觸發(fā)多核苷酸處理時(shí) 相比降低 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多。48. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述瓦螨中的所述病毒載量降低導(dǎo)致蜂死亡率 的降低。49. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述蜂死亡率在施用包含所述觸發(fā)多核苷酸的 所述組合物的1天內(nèi)、1天后、2天后、3天后、4天后、5天后或1周后測(cè)量。50. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中蜂死亡率與未用所述觸發(fā)多核苷酸處理時(shí)相比 降低 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多。51. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述病毒復(fù)制的抑制在施用包含所述觸發(fā)多核 苷酸的所述組合物的1天內(nèi)、1天后、2天后、3天后、4天后、5天后或1周后測(cè)量。52. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中多于一次地測(cè)量所述病毒復(fù)制的所述抑制。53. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中每3天、每5天、每周或每月一次測(cè)量所述病毒復(fù) 制的所述抑制。54. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述病毒復(fù)制與未用所述觸發(fā)多核苷酸處理時(shí) 相比降低 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更多。55. -種用于在蜂群中減少病毒載量或抑制病毒復(fù)制的方法，所述方法包括:通過(guò)向所 述蜂群的寄生蟲(chóng)提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物來(lái)減少所述寄生蟲(chóng)中的病毒載 量或抑制病毒復(fù)制，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基 本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而抑制所述寄生蟲(chóng)中的病毒復(fù)制并降低所述蜂群中 的所述病毒載量。56. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述寄生蟲(chóng)是狄斯瓦螨。57. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述觸發(fā)多核苷酸包含與選自由SEQ ID NO:1_ 10和21組成的組的序列具有至少約80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98%或 99%的序列同一性或互補(bǔ)性，或具有100%的序列同一性或互補(bǔ)性的核酸序列。58. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述病毒選自由急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅病 毒(DWV)、克什米爾蜂病毒(KBV)、黑蜂王臺(tái)病毒(BQCV)、囊狀幼蟲(chóng)病病毒(SBV)、慢性蜂麻痹 病毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、無(wú)脊椎動(dòng)物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)和Kakugo病毒(KV)組成的組。59. -種用于在蜂群中減少病毒載量或抑制病毒復(fù)制的方法，所述方法包括：向所述蜂 群提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基因的至少 21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而在所述蜂群中減少病毒 載量或抑制病毒復(fù)制。60. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述病毒選自由急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅病 毒(DWV)、克什米爾蜂病毒(KBV)、黑蜂王臺(tái)病毒(BQCV)、囊狀幼蟲(chóng)病病毒(SBV)、慢性蜂麻痹 病毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、無(wú)脊椎動(dòng)物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)、Kakugo病毒(KV)和西奈湖病毒(LSV)組成的組。61. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述觸發(fā)多核苷酸包含與選自由SEQ ID NO:1_ 21 組成的組的序列具有至少約 80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性或互補(bǔ)性，或具有100 %的序列同一性或互補(bǔ)性的核酸序列。62. -種用于在蜂中減少病毒載量或抑制病毒復(fù)制的方法，所述方法包括：向所述蜂提 供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基因的至少21個(gè) 連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而在所述蜂中減少病毒載量或 抑制病毒復(fù)制。63. 根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述蜂病毒選自由急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸翅 病毒(DWV)、克什米爾蜂病毒(KBV)、黑蜂王臺(tái)病毒(BQCV)、囊狀幼蟲(chóng)病病毒(SBV)、慢性蜂麻 痹病毒(CPV)、云翅病毒(CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、無(wú)脊椎動(dòng)物虹彩病毒6型（IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-1)、Kakugo病毒(KV)和西奈湖病毒(LSV)組成的組。64. 根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述觸發(fā)多核苷酸包含與選自由SEQ ID NO: 1-21 組成的組的序列具有至少約 80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性或互補(bǔ)性，或具有100 %的序列同一性或互補(bǔ)性的核酸序列。65. -種用于增加蜂或蜂群對(duì)蜂病毒引起的疾病的耐受性的方法，所述方法包括：向瓦 螨提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基因的至少 21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而減少所述瓦螨中的病毒 載量并增加所述蜂群對(duì)所述蜂病毒引起的疾病的耐受性。66. -種用于增加蜂或蜂群對(duì)蜂病毒引起的疾病的耐受性的方法，所述方法包括：向所 述蜂或蜂群提供包含有效量的觸發(fā)多核苷酸的組合物，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基 因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或基本上互補(bǔ)的核酸序列，從而增加所述蜂群 對(duì)所述蜂病毒引起的疾病的耐受性。67. -種用于向狄斯瓦螨、蜂或蜂群提供的組合物，所述組合物包含有效量的觸發(fā)多核 苷酸，所述觸發(fā)多核苷酸包含與蜂病毒基因的至少21個(gè)連續(xù)核苷酸的序列基本上同一或基 本上互補(bǔ)的核酸序列。68. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述觸發(fā)多核苷酸是單鏈DNA(ssDNA)、單鏈 RNA(ssRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、雙鏈DNA(dsDNA)或雙鏈DNA-RNA雜合體。69. 根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中所述觸發(fā)多核苷酸是dsRNA。70. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述觸發(fā)多核苷酸下調(diào)所述蜂病毒基因的表 達(dá)。71. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述組合物降低所述瓦螨、所述蜂或所述蜂群 中的病毒載量。72. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述組合物抑制所述瓦螨、所述蜂或所述蜂群 中的病毒復(fù)制。73. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述組合物增加蜂或蜂群對(duì)所述蜂病毒引起 的疾病的耐受性。74. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述蜂病毒選自由急性蜂麻痹病毒(ABPV)、畸 翅病毒(DWV)、克什米爾蜂病毒(KBV)、黑蜂王臺(tái)病毒(BQCV)、囊狀幼蟲(chóng)病病毒(SBV)、慢性蜂 麻痹病毒（CPV)、云翅病毒（CWV)、以色列急性麻痹病毒（IAPV)、無(wú)脊椎動(dòng)物虹彩病毒6型 (IIV-6)、狄斯瓦螨病毒(VDV-l)、Kakugo病毒(KV)和西奈湖病毒(LSV)組成的組。75. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述觸發(fā)多核苷酸包含與選自由SEQ ID NO: 1-10 和 21 組成的組的序列具有至少約 80%、85%、88%、90%、92%、95%、96%、97%、98% 或99 %的序列同一性或互補(bǔ)性，或具有100 %的序列同一性或互補(bǔ)性的核酸序列。76. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述觸發(fā)多核苷酸包含至少2、3、4、5、6、7、8、9 或10種不同的觸發(fā)多核苷酸的混合物。77. 根據(jù)權(quán)利要求76所述的組合物，其中所述不同的觸發(fā)多核苷酸靶向不同的病毒、或 靶向相同病毒的不同基因、或靶向病毒基因的不同片段。78. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述組合物包含約lmg至約2000mg的所述觸發(fā) 多核苷酸。79. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述組合物包含約0.0 lmg/ml至約20mg/ml的 所述觸發(fā)多核苷酸。80. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述組合物還包含賦形劑。81. 根據(jù)權(quán)利要求67所述的組合物，其中所述組合物是蜂可攝取組合物。
【文檔編號(hào)】C07K14/435GK105980399SQ201480074838
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2014年12月9日
【發(fā)明人】M·格萊特-基爾馬諾維茨, Y·戈拉尼
【申請(qǐng)人】比歐洛吉科斯公司