具有增強(qiáng)的l-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物和使用該微生物生產(chǎn)l-氨基酸的方法
【專利摘要】公開了具有增強(qiáng)的L?氨基酸生產(chǎn)能力的重組微生物，其中所述重組微生物經(jīng)轉(zhuǎn)化而具有腺苷脫氨酶和AMP核苷酶中的至少一種的消除或降低的活性，和使用所述重組微生物生產(chǎn)L?氨基酸的方法。所述重組微生物的使用可以使L?氨基酸能夠以高度有效的方式生產(chǎn)。KCCM11494P20131209
【專利說(shuō)明】
具有増強(qiáng)的L-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物和使用該微生物生產(chǎn) L-氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)的L-氨基酸生產(chǎn)能力的微生物和使用該微生物生產(chǎn)L-氨基 酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺苷-5'-三磷酸（ATP)具有高能量的磷酸鍵，并且當(dāng)ATP被水解成腺苷二磷酸 (ADP)和磷酸根時(shí)產(chǎn)生能量。ATP是所有活生物體的主要能源。通過微生物內(nèi)的電子轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)、底物水平磷酸等合成ATPATP在被降解時(shí)供應(yīng)細(xì)胞需要的能量，然后經(jīng)由糖酵解或氧化 磷酸化的過程連續(xù)循環(huán)。另外，已知通過發(fā)酵產(chǎn)生有用的代謝物的微生物隨著ATP生物合成 的增強(qiáng)而需要更多的ATP樣能量。
[0003] 在這點(diǎn)上，本發(fā)明的發(fā)明人提高細(xì)胞內(nèi)的ATP(其是最常用于產(chǎn)生L-氨基酸的能 源)的比例，從而確認(rèn)ATP對(duì)L-氨基酸生產(chǎn)的影響，從而完成本發(fā)明。
[0004] 發(fā)明詳述
[0005] 技術(shù)問題
[0006] 本發(fā)明提供了重組微生物，所述重組微生物隨著其中升高的ATP水平而具有增強(qiáng) 的L-氨基酸的生產(chǎn)能力。
[0007] 本發(fā)明提供了使用重組微生物生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
[0008] 技術(shù)方案
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，公開了具有增強(qiáng)的L-氨基酸生產(chǎn)能力的重組微生物，其 中腺苷脫氨酶和AMP核苷酶的至少一種的活性被除去或降低。
[0010] 如本文中使用，術(shù)語(yǔ)"腺苷脫氨酶(Add)"指存在于胞質(zhì)溶膠中并且參與嘌呤代謝 的一部分的酶。Add可以作用于腺苷的C-6位，從而使與C-6位結(jié)合的氨基基團(tuán)脫氨，并且在 這點(diǎn)上，Add可以在催化'腺苷+H 2〇4肌苷+NH3'的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，從而導(dǎo)致肌苷和銨的生成中具 有作用。
[0011] 可以通過已知的數(shù)據(jù)庫(kù)，如NCBI的GenBank提供Add的氨基酸序列，但是數(shù)據(jù)庫(kù)不 限于此。詳細(xì)地，Add可以包括SEQ ID N0:14的氨基酸序列，或與SEQ ID N0:14的氨基酸序 列具有約80%或更多、90%或更多、或95%或更多序列同一性的氨基酸序列。另外，具有序 列同一性的此類氨基酸序列包括缺失、修飾、取代或添加序列的一部分的氨基酸序列。Add 的序列可以包括編碼SEQ ID N0:14的氨基酸序列的多核苷酸序列。編碼Add蛋白的多核苷 酸序列稱為add基因（NCBI基因 ID: 12931257)。例如，編碼Add蛋白的add基因的序列可以包 括SEQ ID N0:13的多核苷酸序列，或與SEQ ID N0:13的多核苷酸序列具有約80%或更多、 90%或更多、或95%或更多序列同一性的多核苷酸序列。此類具有序列同一性的堿基序列 包括缺失、修飾、取代或添加序列的一部分的堿基序列。
[0012] 術(shù)語(yǔ)"AMP核苷酶(Amn)"在本文中用于指屬于水解酶家族的酶，例如水解N-糖基化 合物的糖基化酶，并且又稱作腺苷酸核苷酶(adenylate nucleosidase) jmn可以參與噪呤 代謝的一部分。例如，Amn可以在催化'AMP+H20->D-核糖5-磷酸+腺嘌呤'的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中具有 作用。另外，當(dāng)失活編碼Amn的amn基因時(shí)，可以提高細(xì)胞內(nèi)的ATP水平。
[0013] 可以通過已知的數(shù)據(jù)庫(kù)，如NCBI的GenBank提供Amn的氨基酸序列，但是數(shù)據(jù)庫(kù)不 限于此。詳細(xì)地，Amn可以包括SEQ ID N0:16的氨基酸序列，或與SEQ ID N0:16的氨基酸序 列具有約80%或更多、90%或更多、或95%或更多序列同一性的氨基酸序列。另外，具有序 列同一性的此類氨基酸序列包括缺失、修飾、取代或添加序列的一部分的氨基酸序列。Amn 的序列可以包括編碼SEQ ID N0:16的氨基酸序列的多核苷酸序列。編碼Amn蛋白的多核苷 酸序列稱為amn基因（NCBI基因 ID: 12931407)。例如，編碼Amn蛋白的amn基因的序列可以包 括SEQ ID N0:15的多核苷酸序列，或與SEQ ID N0:15的多核苷酸序列具有約80%或更多、 90%或更多、或95%或更多序列同一性的多核苷酸序列。此類具有序列同一性的堿基序列 包括缺失、修飾、取代或添加序列的一部分的堿基序列。
[0014] 在本發(fā)明中，序列同一性指編碼蛋白質(zhì)的基因的堿基序列或氨基酸序列的相似性 程度。在基因的高同一性的情況中，基因的表達(dá)產(chǎn)物彼此可以具有相同或相似的活性。 [0015]在本發(fā)明中，可以在微生物中除去或降低Add或Amn的活性，并且可以為了生產(chǎn)L-氨基酸而使用微生物。在具有增強(qiáng)的L-氨基酸生產(chǎn)能力的本發(fā)明的重組微生物中，可以分 別或一起除去或降低Add和Amn的活性。例如，在重組微生物中，可以除去或降低這兩種蛋白 質(zhì)的活性。與沒有除去或降低蛋白質(zhì)的活性的微生物相比，具有除去或降低的Add和Amn的 活性的重組微生物導(dǎo)致增強(qiáng)的L-氨基酸的生產(chǎn)能力。
[0016] 如本文中使用，術(shù)語(yǔ)"L-氨基酸"指構(gòu)成生物體的機(jī)體并且具有與相同碳原子附著 的氨基基團(tuán)和羧酸基團(tuán)兩者的蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位。例如，L-氨基酸可以選自：L-亮氨 酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-色氨酸和L-甲硫氨酸。例 如，L-氨基酸可以是L-色氨酸或L-蘇氨酸。
[0017] 如本文中使用，術(shù)語(yǔ)"重組微生物"指遺傳修飾的微生物。重組微生物可以是遺傳 工程化的微生物，并且例如，可以根據(jù)遺傳工程方法將外源核酸導(dǎo)入微生物，或者可以轉(zhuǎn)化 微生物中的內(nèi)源基因的序列或位置。
[0018] 如本文中使用，酶或多肽的術(shù)語(yǔ)"除去的活性"指上文描述的蛋白質(zhì)根本不在微生 物中表達(dá)的情況、或上文描述的蛋白質(zhì)得到表達(dá)，但是沒有任何活性的情況。如本文中使 用，酶或多肽的術(shù)語(yǔ)"降低的活性"指上文描述的蛋白質(zhì)得到表達(dá)，但是其活性與內(nèi)在活性 相比較弱的情況。術(shù)語(yǔ)"除去的活性"或"降低的活性"可以用術(shù)語(yǔ)"失活"或"活性弱"替換。 如本文中使用，術(shù)語(yǔ)"內(nèi)在活性"指天然狀態(tài)的微生物的活性，即最初存在于微生物中的活 性，或者尚未遺傳修飾的蛋白質(zhì)的活性。
[0019 ] Add或Amn的活性的除去或降低可以通過除去或修飾分別編碼Add或Amn的基因引 起。術(shù)語(yǔ)"基因的除去或修飾"在本文中用于指突變、取代、缺失或用至少一個(gè)堿基插入部分 或整個(gè)的基因或基因的啟動(dòng)子或終止子區(qū)域上的調(diào)節(jié)因子，使得不表達(dá)基因或少量表達(dá)基 因，或者在不顯示酶促活性的情況下或者在降低的酶促活性的情況下表達(dá)基因的情況?？?以通過遺傳操作，諸如同源重組、誘變或分子進(jìn)化實(shí)現(xiàn)基因的除去或破壞。當(dāng)細(xì)胞包含不同 多肽的多個(gè)相同基因或至少兩個(gè)同源基因時(shí)，可以在細(xì)胞中除去或破壞一個(gè)或多個(gè)基因。 在一個(gè)例示性的實(shí)施方案中，編碼Add的add基因或編碼Amn的amn基因可以通過同源重組從 微生物的基因組中除去，或者可以具有經(jīng)修飾的起始密碼子。
[0020]如本文中使用，術(shù)語(yǔ)"具有增強(qiáng)的L-氨基酸生產(chǎn)能力的重組微生物"指能夠從培養(yǎng) 基中含有的碳源生產(chǎn)并積累L-氨基酸的微生物。與沒有修飾酶活性的微生物相比，具有除 去或降低的Add或Amn活性的重組微生物導(dǎo)致增強(qiáng)的L-氨基酸的生產(chǎn)能力。在一個(gè)例示性的 實(shí)施方案中，確認(rèn)分別具有失活的上文描述的酶的產(chǎn)蘇氨酸的菌株和產(chǎn)色氨酸的菌株與產(chǎn) 蘇氨酸的菌株和產(chǎn)色氨酸的菌株的母本菌株相比具有增強(qiáng)的蘇氨酸和色氨酸生產(chǎn)能力。 [0021 ] 重組微生物可以是埃希氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterbacter)、歐文氏 菌屬（Erwinia)、沙雷菌屬（Serratia)、普羅威登斯菌屬（Providencia)、棒桿菌屬 (Corynebacterium)、和短桿菌屬(Brevibacterium)的微生物。例如，重組微生物可以是埃 希氏菌屬的微生物。埃希氏菌屬的微生物可以是大腸桿菌，例如大腸桿菌KCCM11494P。大腸 桿菌KCCM11494P是通過使用產(chǎn)蘇氨酸的菌株(KCCM10910P)作為母本菌株，并且實(shí)施add和 amn基因兩者的缺失制備的KCCM10910P Δ add Δ amn菌株。這里，發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌KCCM11494P 中的蘇氨酸生成大于母本(KCCM10910P)中的。
[0022] 大腸桿菌KCCM11494P命名為"CA03-8254P"，然后在布達(dá)佩斯條約下在2013年12月 9日保藏于韓國(guó)微生物保藏中心(在下文，稱為"KCCM"）。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，公開了用于生產(chǎn)L-氨基酸的組合物，其中組合物包含 重組微生物。如本文中使用，術(shù)語(yǔ)"用于生產(chǎn)L-氨基酸的組合物"指能夠使用生產(chǎn)L-氨基酸 的重組微生物或重組微生物的培養(yǎng)產(chǎn)物生產(chǎn)L-氨基酸作為代謝物的組合物。生產(chǎn)L-氨基酸 的重組微生物與上文描述相同定義。例如，L-氨基酸可以選自L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴 氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-色氨酸和L-甲硫氨酸。例如，L-氨基酸可以是L-蘇氨酸或L-色氨酸。如本文中使用，術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)產(chǎn)物"指含有重組微生物的肉湯培養(yǎng)物、除去 微生物細(xì)胞的培養(yǎng)上清液、或培養(yǎng)產(chǎn)物的稀釋溶液。組合物可以進(jìn)一步包含用于提高L-氨 基酸的生存能力的成分。例如，組合物可以進(jìn)一步包含碳源、氮源或微量元素成分。例如，碳 源可以包含碳水化合物，如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，淀粉和纖維素;脂肪，如大豆 油，向日葵油，蓖麻油和椰子油;脂肪酸，如棕櫚酸，硬脂酸，亞油酸;醇，例如甘油和乙醇;和 有機(jī)酸，如乙酸，或其組合。重組微生物的培養(yǎng)可以通過使用葡萄糖作為碳源進(jìn)行。例如，氮 源可以包括有機(jī)氮源，如蛋白胨，酵母提取物，肉汁，麥芽提取物，玉米漿(CSL)和大豆粉;和 無(wú)機(jī)氮源，如尿素，硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨;或其組合。組合物可以包括磷 酸二氫鉀或磷酸氫鉀作為磷源。另外，組合物可包括對(duì)應(yīng)于磷源的含鈉鹽，和金屬鹽，如硫 酸鎂或硫酸鐵。另外，組合物可包括氨基酸，維生素和適當(dāng)?shù)那绑w。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，公開了生產(chǎn)L-氨基酸的方法，所述方法包括:培養(yǎng)生產(chǎn) L-氨基酸的重組微生物;并且從培養(yǎng)產(chǎn)物中收集L-氨基酸。
[0025]生產(chǎn)L-氨基酸的重組微生物與上文的描述相同定義。
[0026] L-氨基酸可以選自：L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-異 亮氨酸、L-色氨酸和L-甲硫氨酸。例如，L-氨基酸可以是L-蘇氨酸或L-色氨酸。可以適當(dāng)?shù)?培養(yǎng)基和根據(jù)本領(lǐng)域中公知的培養(yǎng)條件實(shí)現(xiàn)重組微生物的培養(yǎng)。另外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員可以根據(jù)選定的微生物適當(dāng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。培養(yǎng)方法可以包括分批培養(yǎng)、連續(xù) 培養(yǎng)、補(bǔ)料-分批培養(yǎng)、或其組合。
[0027] 培養(yǎng)基可以包含多種碳源、氮源和微量元素成分。
[0028] 例如，碳源可以包含碳水化合物，如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麥芽糖，淀粉和纖維 素;脂肪，如大豆油，向日葵油，蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕櫚酸，硬脂酸，亞油酸;醇，例 如甘油和乙醇；和有機(jī)酸，如乙酸，或其組合。重組微生物的培養(yǎng)可以通過使用葡萄糖作為 碳源進(jìn)行。例如，氮源可以包括有機(jī)氮源，如蛋白胨，酵母提取物，肉汁，麥芽提取物，玉米漿 (CSL)和大豆粉;和無(wú)機(jī)氮源，如尿素，硫酸銨，氯化銨，磷酸銨，碳酸銨和硝酸銨;或其組合。 培養(yǎng)基可以包括磷酸二氫鉀或磷酸氫鉀作為磷源。另外，培養(yǎng)基可包括對(duì)應(yīng)于磷源的含鈉 鹽，和金屬鹽，如硫酸鎂或硫酸鐵。另外，培養(yǎng)基可包括氨基酸，維生素和適當(dāng)?shù)那绑w。培養(yǎng) 基或培養(yǎng)基的個(gè)別成分可以以分批或連續(xù)的方式加入到培養(yǎng)基中。
[0029] 另外，化合物，如氫氧化銨，氫氧化鉀，氨水，磷酸和硫酸可以以適當(dāng)?shù)姆绞皆谥亟M 微生物的培養(yǎng)過程中加入到培養(yǎng)基中，以便調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值。此外，防沫劑，如脂肪酸聚 乙二醇酯，可在重組微生物的培養(yǎng)過程中使用的，以便抑制氣泡的產(chǎn)生。為了維持培養(yǎng)基的 需氧條件，氧氣或含氧氣體的需氧條件(例如，空氣)可以被注入到培養(yǎng)基中。這里，培養(yǎng)基 的溫度通?？梢栽诩s20°C至約45°C的范圍內(nèi)，例如約25°C至40 °C。培養(yǎng)重組微生物的時(shí)段 可以持續(xù)到獲得L-氨基酸的期望量，并且例如，培養(yǎng)重組微生物可以持續(xù)約10小時(shí)至約160 小時(shí)。
[0030] 可以通過本領(lǐng)域中已知的適當(dāng)培養(yǎng)條件，如分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、或補(bǔ)料-分批培 養(yǎng)實(shí)施從培養(yǎng)產(chǎn)物收集L-氨基酸，從而收集或回收培養(yǎng)產(chǎn)物中產(chǎn)生的L-氨基酸。
[0031] 本發(fā)明的有益效果
[0032] 根據(jù)一個(gè)方面，可以使用具有至少一種蛋白質(zhì)的除去或降低的活性的微生物生產(chǎn) L-氨基酸，所述蛋白質(zhì)選自腺苷脫氨酶和AMP核苷酶。
[0033]根據(jù)另一個(gè)方面，可以使用用于生產(chǎn)L-氨基酸的組合物或生產(chǎn)L-氨基酸的方法以 高效的方式生產(chǎn)L-氨基酸。
[0034] 附圖簡(jiǎn)述
[0035]圖1是顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施的基因缺失后產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株中的ATP的圖。
[0036]圖2是顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施的基因缺失后產(chǎn)L-色氨酸的菌株中的ATP的圖。 實(shí)施例
[0037]在下文中，將通過參考以下實(shí)施例更為詳細(xì)描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅僅用于例 示性目的，而并不意圖限制本發(fā)明的范圍。
[0038]實(shí)施例1:制備產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株和產(chǎn)L-色氨酸的菌株，各自具有由add基因或amn 基因編碼的蛋白質(zhì)的減弱的活性
[0039] 在產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株，即KCICM10910P(韓國(guó)專利開放公開No :2009-0076389)和 KCCM-10132(韓國(guó)專利開放公開NO:2000-0013853)，和產(chǎn)L-色氨酸的菌株，即KCCM10812P (韓國(guó)專利公開文本No :10-0792095)中，通過同源重組缺失分別編碼Add和Amn的基因。要缺 失的add和amn基因分別包含SEQ ID N0:13的堿基序列和SEQ ID N0:15的堿基序列。
[0040] 詳細(xì)地，使用一步失活，其是由Datsenko KA等人（Proc Natl Acad Sci USA.， (2000)97:6640-6645)開發(fā)的使用lambda Red重組酶構(gòu)建突變體的技術(shù)。為了確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn) 物對(duì)基因的插入，使用口1^^1加1(?(：的氯霉素抗性基因作為標(biāo)志物（韓國(guó)專利化 ：2009-007554)。然后，通過在下述條件下使用pUCprmfmloxC作為模板、具有這兩種基因的堿基序 列的一部分和pUCprmfmloxC的氯霉素抗性基因的堿基序列的一部分的SEQ ID NO: 1和2的 引物組、和SEQ ID NO: 7和8的引物組實(shí)施聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(在下文中，稱為"PCR"）：于94°C 變性30秒，于55 °C退火30秒，和于72 °C延長(zhǎng)1分鐘的30個(gè)循環(huán)，導(dǎo)致約1，200bp的基因片段的 擴(kuò)增。
[0041 ]在0.8 %瓊脂糖凝膠上電泳通過PCR擴(kuò)增獲得的DNA片段，洗脫，并且用作二級(jí)PCR 的模板。通過在以下條件下使用洗脫的一級(jí)PCR產(chǎn)物作為模板、與一級(jí)PCR產(chǎn)物的5'和3'區(qū) 具有20bp互補(bǔ)序列并且進(jìn)一步包含基因的5'和3'區(qū)的SEQ ID N0:3和4的引物組、SEQ ID 勵(lì):9和10的引物組實(shí)施二級(jí)?0?:于94°(：變性30秒，于55°(：退火30秒，和于72°(：延長(zhǎng)1分鐘的 30個(gè)循環(huán)，導(dǎo)致約l，300bp的基因片段的4個(gè)類型的擴(kuò)增。將從中獲得的DNA片段在0.8%瓊 脂糖凝膠上電泳，洗脫，并且重組使用。
[0042]將依照Datsenko KA等人（Proc Natl Acad Sci USA. ,(2000)97:6640-6645)開發(fā) 的方法轉(zhuǎn)化有PKD46質(zhì)粒的大腸桿菌(E.coli)制備為感受態(tài)菌株，并且通過導(dǎo)入通過PCR獲 得的l，300bp的基因產(chǎn)物實(shí)施轉(zhuǎn)化。在補(bǔ)充有氯霉素的LB培養(yǎng)基上選擇獲得的菌株。因而， 根據(jù)通過使用SEQ ID N0: 5和6的引物組和SEQ ID N0:11和12的引物組的PCR獲得的約1， 440bp和2，104bp的PCR產(chǎn)物確認(rèn)基因的缺失。
[0043]在除去pKD46質(zhì)粒后，用pJW168質(zhì)粒導(dǎo)入具有氯霉素抗性的原代重組大腸桿菌菌 株，從而從菌株除去氯霉素標(biāo)志物基因 （Gene ,(2000)247,255-264)。在最終獲得的微生物 細(xì)胞中，根據(jù)通過使用SEQ ID N0:5和6的引物組和SEQ ID勵(lì)：11和12的引物組的？0?獲得 的約340bp和1，004bp的PCR產(chǎn)物確認(rèn)基因的缺失。
[0044] 通過使用缺失add基因的菌株、SEQ ID N0:5和6的引物組和SEQ ID N0:11和12的 引物組以與上文描述的相同方式實(shí)施amm基因的缺失，因而確認(rèn)這兩種基因的雙重缺失。 [0045]根據(jù)上文描述的方法，制備了6類產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株，即KCCM10910PAadd菌株、 KCCM10910P Δ amn菌株、KCCM10910P Δ add Δ amn菌株、KCCM-10132 Δ add菌株、KCCM-10132 Δ amn菌株、和KCCM-10132 Δ add Δ amn菌株。另外，制備了 3類產(chǎn)L-色氨酸的菌株，即 KCCM10812P Δ add菌株、KCCM10812P Δ amn菌株、和KCCM10812P Δ add Δ amn菌株。
[0046] 實(shí)施例2:測(cè)量產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株和產(chǎn)L-色氨酸的菌株中的ATP水平
[0047] 為了量化存在于實(shí)施例1的菌株中的實(shí)際ATP水平，使用依照螢光素酶使用的由 ΚΙΥ0ΤΑΚΑ Y等人(J Biom Scre，（2006)Vll:No.3:PP310-17)開發(fā)的"用于細(xì)胞ATP合成活性 的定量測(cè)定的有效方法"（Efficient Method for Quantitative determination of Cellular ATP Synthetic Activity)。在含有葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中，將分別具有不同 遺傳轉(zhuǎn)化的實(shí)施例1的菌株培養(yǎng)過夜。在通過離心除去上清液后，用1 〇〇mM Tris-Cl溶液(pH 7.5)清洗微生物細(xì)胞，然后用可通透（PB)緩沖液溶液（40% [v/v]葡萄糖，0.8% [v/v] Triton X-100)處理30分鐘，從而將胞內(nèi)APT轉(zhuǎn)運(yùn)到外部。在再次通過離心分開上清液后，將 所得物與螢光素混合，所述螢光素用作螢光素酶的底物。在反應(yīng)10分鐘后，通過使用發(fā)光計(jì) 測(cè)量螢光素酶的顏色顯現(xiàn)的程度，從而量化ATP水平。圖1和2中顯示了結(jié)果。所有所得的數(shù) 值是通過重復(fù)3次的實(shí)驗(yàn)獲得的平均值。
[0048]如圖1和2中顯示，在沒有基因缺失的母本菌株（即產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株和產(chǎn)L-色氨 酸的菌株)和實(shí)施例1的菌株之間的比較中，確認(rèn)了發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1的菌株中的ATP水平升高。 另外，確認(rèn)了 ATP水平在具有add和amn基因的組合缺失的菌株而不是具有單一基因的缺失 的菌株中進(jìn)一步升高。
[0049] 實(shí)施例3:在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中確認(rèn)具有由大腸桿菌add和amn基因編碼的蛋 白質(zhì)的減弱的活性的產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株的效果
[0050] 在實(shí)施例1的產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株(KCCM10910P)中，分別或組合缺失add和amn基因， 從而通過使用葡萄糖作為碳源就具有升高的胞內(nèi)ATP水平的菌株而言進(jìn)行效力測(cè)試。
[0051 ]在33°C溫育中在LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)分別具有不同遺傳轉(zhuǎn)化的菌株過夜。此后， 將1鉑環(huán)的每種微生物細(xì)胞在25ml如下文表1的組成中顯示的含有葡萄糖的滴度培養(yǎng)基中 接種，然后在培養(yǎng)箱中在33 °C和以200rpm培養(yǎng)50小時(shí)。下文表2中顯示了結(jié)果。所有所得的 數(shù)值是來(lái)自3個(gè)燒瓶獲得的平均值。
[0057] *30-hr 測(cè)量值
[0058] #50-hr 測(cè)量值
[0059] 如上文表2中顯示，確認(rèn)了與母本菌株的葡萄糖消耗相比，根據(jù)本發(fā)明的具有基因 缺失的菌株導(dǎo)致葡萄糖消耗增加約18.8%。還確認(rèn)了與母本菌株中生產(chǎn)的蘇氨酸的量相 比，菌株中產(chǎn)生的蘇氨酸的量增加約6.6%。這些結(jié)果表示考慮如圖1中顯示的ATP水平，經(jīng) 轉(zhuǎn)化的菌株的活性隨其APT水平升高而增加，因而，經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株的葡萄糖消耗率或氨基酸 生產(chǎn)能力得到改善。
[0060] 在這點(diǎn)上，具有增強(qiáng)的葡萄糖消耗率和蘇氨酸生產(chǎn)能力的大腸桿菌KCCM10910PA addAamn菌株命名為"CA03-8254P"（保藏號(hào):KCCM11494P，在2013年12月9日保藏于韓國(guó)微 生物保藏中心(KCCM))。
[0061] 實(shí)施例4:在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中確認(rèn)具有由大腸桿菌add和amn基因編碼的蛋 白質(zhì)的減弱的活性的產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株的效果
[0062] 在實(shí)施例1的產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株(KCCM-10132)中，分別或組合缺失add和amn基因， 從而通過使用葡萄糖作為碳源就具有升高的胞內(nèi)ATP水平的菌株而言進(jìn)行效力測(cè)試。
[0063]在33°C溫育中在LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)分別具有不同遺傳轉(zhuǎn)化的菌株過夜。此后， 將1鉑環(huán)的每種微生物細(xì)胞在25ml如下文表1的組成中顯示的含有葡萄糖的滴度培養(yǎng)基中 接種，然后在培養(yǎng)箱中在33 °C和以200rpm培養(yǎng)50小時(shí)。下文表3中顯示了結(jié)果。所有所得的 數(shù)值是來(lái)自3個(gè)燒瓶獲得的平均值。
[0064]【表3】
[0066] *30_hr 測(cè)量值
[0067] **50_hr 測(cè)量值
[0068] 如上文表3中顯示，確認(rèn)了與母本菌株的葡萄糖消耗相比，根據(jù)本發(fā)明的具有基因 缺失的菌株導(dǎo)致葡萄糖消耗增加約13%。還確認(rèn)了與母本菌株中生產(chǎn)的蘇氨酸的量相比， 菌株中產(chǎn)生的蘇氨酸的量增加約6.4%。
[0069] 實(shí)施例5:在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中確認(rèn)具有由大腸桿菌add和amn基因編碼的蛋 白質(zhì)的減弱的活性的產(chǎn)L-色氨酸的菌株的效果
[0070] 在實(shí)施例1的產(chǎn)L-色氨酸的菌株(KCCM10812P)中，分開或組合缺失add和amn基因， 從而通過使用葡萄糖作為碳源就具有升高的胞內(nèi)ATP水平的菌株而言進(jìn)行效力測(cè)試。
[0071] 為了進(jìn)行效力測(cè)試，將1鉑環(huán)的每種微生物細(xì)胞在25ml如下文表4的組成中顯示的 含有葡萄糖的滴度培養(yǎng)基中接種，然后在培養(yǎng)箱中在33 °C和以200rpm培養(yǎng)48小時(shí)。下文表5 中顯示了結(jié)果。所有所得的數(shù)值是來(lái)自3個(gè)燒瓶獲得的平均值。
[0072] 【表4】
[0077] *33_hr 測(cè)量值
[0078] #48-hr 測(cè)量值
[0079] 如上文表5中顯示，確認(rèn)了與母本菌株的葡萄糖消耗相比，根據(jù)本發(fā)明的具有基因 缺失的菌株導(dǎo)致葡萄糖消耗增加約10%。還確認(rèn)了與母本菌株中生產(chǎn)的色氨酸的量相比， 菌株中產(chǎn)生的色氨酸的量增加約26.6%。這些結(jié)果表示考慮如圖2中顯示的ATP水平，經(jīng)轉(zhuǎn) 化的菌株的活性隨其APT水平升高而增加，因而，經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株的葡萄糖消耗率或氨基酸生 產(chǎn)能力得到改善。
[0080] 應(yīng)當(dāng)理解，本文中描述的示例性的實(shí)施方案應(yīng)當(dāng)僅在描述的意義上而不出于限制 目的考慮。每個(gè)實(shí)施方案內(nèi)的特征或方面的描述通常應(yīng)當(dāng)視為可用于其它實(shí)施方案中的其 它類似的特征或方面。雖然已經(jīng)參考附圖描述了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，但是本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在不偏離以所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的精神和范圍的 前提下對(duì)其進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)上的各種變化。
[0081] [保藏號(hào)]
[0082] 保藏機(jī)構(gòu):韓國(guó)微生物保藏中心（國(guó)際）
[0083] 保藏號(hào)：KCCM11494P
[0084] 保藏日：2013年12月9日
[0085] 國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約國(guó)際表格
[0086] 至:CJ第一制糖株式會(huì)社
[0087] CJ CHEILJEDANG CENTER在本頁(yè)底部列出由國(guó)際
[0088] 330,D0NGH0-R0, 保藏機(jī)構(gòu)按照7.1條發(fā)出
[0089] JUNG-GU,首爾100-400 的原保藏的受理證據(jù)
[0090]大韓民國(guó)
[0091]
[0092] 1在適用6.4(d)的情況下，此類日期是獲得國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)狀態(tài)的日期;在獲得國(guó)際 保藏機(jī)構(gòu)的狀態(tài)后在布達(dá)佩斯條約外進(jìn)行的保藏被轉(zhuǎn)化為布達(dá)佩斯條約下的保藏的情況 下，此類日期是由國(guó)際保藏機(jī)構(gòu)接受的微生物的日期。 BP/4表格 單頁(yè)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 具有增強(qiáng)的L-氨基酸生產(chǎn)能力的重組微生物，其中包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列 的腺苷脫氨酶和包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的AMP核苷酶中的至少一種的活性被除去 或降低。2. 權(quán)利要求1的重組微生物，其中所述L-氨基酸是L-蘇氨酸或L-色氨酸。3. 權(quán)利要求1的重組微生物，所述重組微生物屬于埃希氏菌屬。4. 權(quán)利要求3的重組微生物，其中所述重組微生物是大腸桿菌。5. 生產(chǎn)L-氨基酸的方法，所述方法包括： 培養(yǎng)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的重組微生物;并 從培養(yǎng)物中收集L-氨基酸。6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述L-氨基酸是L-蘇氨酸或L-色氨酸。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK105980545SQ201580006882
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2015年3月17日
【發(fā)明人】高恩圣, 權(quán)秀淵, 李光鎬, 李知宣, 張峻浩, 李根喆, 洪亨杓
【申請(qǐng)人】Cj第制糖株式會(huì)社, Cj第一制糖株式會(huì)社