一種革胡子鯰抗菌肽的提取方法
【專利摘要】一種革胡子鯰抗菌肽的提取方法，其特征是所述方法包括以下步驟：1)將革胡子鯰內(nèi)臟團、鰓和鰓上器官在冰浴下剪碎，并在3-5℃下用乙酸溶液作為提取液制備成組織勻漿；2)步驟1)制備成的組織勻漿于75～85℃水浴加熱20-40min，期間不斷攪拌，水浴結(jié)束后迅速退熱冷卻至3-5℃后于7500-8000r/min離心；3)步驟1)的沉淀重復(fù)步驟1)水浴加熱、攪拌、冷卻、離心的步驟，4)將步驟2)、3)的上清液合并，用1％的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，離心分離，取上清液凍干；5)將步驟4)得到的凍干產(chǎn)物用滅菌注射用水溶解，裝入透析袋，在滅菌注射用水中透析，每3h換1次水，檢測無鈉離子后凍干備用。
【專利說明】
_種革胡子餘抗菌肽的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明涉及抗菌肽提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗菌肽（Antimicrobial peptides)是動物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有廣譜抗菌活性的 多肽。革胡子鯰（Clarias gariepinus)是我國一種重要的淡水養(yǎng)殖魚類，研究表明，該魚 皮膚和體表粘液、腸道、鰓和鰓上器官以及血清中均有抗菌蛋白/肽的存在，現(xiàn)有的提取革 胡子鯰抗菌肽的方法主要為采用硫酸銨分級鹽析，但這種方法，需要消耗大量硫酸銨，提取 效率低，提取物進一步分離提純困難。因此提供一種新的提取效率更高，更易于后續(xù)分離革 胡子鯰抗菌肽提取方法，成為現(xiàn)有技術(shù)中亟待解決的問題

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明提供了一種革胡子鯰抗菌肽的提取方法，其特征是所述方法包括以下步 驟：
[0004] 1)將革胡子鯰內(nèi)臟團、鰓和鰓上器官（以下統(tǒng)稱革胡子鯰組織）在冰浴下剪碎，并 在3-5°C下用乙酸溶液作為提取液制備成組織勻漿，所述的乙酸鈉溶液體積百分比濃度范 圍為1~10%，提取液與革胡子鯰組織的體積重量比范圍為1 : 1~1 : 5,制備組織勻漿 的攪拌時間為12_36min ;
[0005] 2)步驟1)制備成的組織勻漿于75~85°C水浴加熱20-40min，期間不斷攪拌，水 浴結(jié)束后迅速退熱冷卻至3-5°C后于7500-8000r/min離心20-40min ;
[0006] 3)步驟1)的沉淀重復(fù)步驟1)水浴加熱、攪拌、冷卻、離心的步驟，
[0007] 4)將步驟2)、3)的上清液合并，用1 %的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至中性，離心分離，取 上清液凍干
[0008] 5)將步驟4)得到的凍干產(chǎn)物用用滅菌注射用水溶解，裝入透析袋，透析至檢測無 鈉離子后冷凍干燥既得革胡子鯰抗菌肽。
[0009] 本發(fā)明提供的革胡子鯰抗菌肽提取方法，可以適用于革胡子鯰各個器官，包括內(nèi) 臟團、鰓和鰓上器官中抗菌肽的提取，與現(xiàn)有的分級鹽析的方法相比，本發(fā)明提供的方法操 作更簡單，消耗藥品更少，且提取物后處理更簡單，具有更好的工業(yè)實施前景。
【具體實施方式】
[0010] 所有實施例步驟如下：
[0011] 1)取材：取革胡子鯰解剖取出內(nèi)臟團（頭腎、腎臟、胃、腸道、肝胰臟）鰓和鰓上器 官（統(tǒng)稱為革胡子鯰組織），剔除淤血、結(jié)締組織和脂肪組織，用滅菌的生理鹽水沖洗去除 內(nèi)容物，吸取水分，將革胡子鯰組織在冰浴下剪碎，并在4°C下用乙酸溶液作為提取液制備 成組織勻漿，實施例1~9
[0012] 2)步驟1)制備成的組織勻漿于80°C水浴加熱30min，期間不斷攪拌，水浴結(jié)束后 迅速退熱冷卻至4°C后于8000r/min離心30min ;
[0013] 3)步驟1)的沉淀重復(fù)步驟1)水浴加熱、攪拌、冷卻、離心的步驟，
[0014] 4)將步驟2)、3)的上清液合并，用1 %的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至中性，離心分離，取 上清液凍干
[0015] 5)將步驟4)得到的凍干產(chǎn)物用用滅菌注射用水溶解，裝入透析袋，4°C下在滅菌 注射用水中透析（透析袋截留分子量為1000D)，每3h換1次滅菌注射用水，檢測無鈉離子 后冷凍干燥于-20 °C存儲備用。
[0016] 實施例1~9,采用前述工藝步驟，其中步驟1)中的提取工藝采用正交試驗方法確 定
[0017] 正交表如下
[0020] 抑菌實驗
[0021] 采用牛津杯法，以20 μ g/ml 土霉素作為陽性對照，滅菌水作為陰性對照，每個牛 津杯中分別加入200 μ1樣本。以嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophia，天津市水產(chǎn)研究所 提供）為受試菌，4°C靜置12h，28°C培養(yǎng)24h后觀察抑菌圈的大小[15]。每個實施例得到 的樣品做2個平行實驗。
[0022] 結(jié)果表明，所有實施例得到的樣品均能產(chǎn)生抑菌圈，其中實施例6實驗中抑菌圈 的直徑最大，達到30. 5+1. 2mm。
【主權(quán)項】
1. 一種革胡子鯰抗菌肽的提取方法，其特征是所述方法包括以下步驟： 1) 將革胡子鯰內(nèi)臟團、鰓和鰓上器官（以下統(tǒng)稱革胡子鯰組織）在冰浴下剪碎，并在 3-5 °C下用乙酸溶液作為提取液制備成組織勻漿，所述的乙酸溶液體積百分比濃度范圍為 1~10%，提取液與革胡子鯰組織的體積重量比范圍為1 : 1~1 : 5,制備組織勻漿的攪 拌時間為12_36min ; 2) 步驟1)制備成的組織勻漿于75~85°C水浴加熱20-40min，期間不斷攪拌，水浴結(jié) 束后迅速退熱冷卻至3_5°C后于7500-8000r/min離心20_40min ; 3) 步驟1)的沉淀重復(fù)步驟1)水浴加熱、攪拌、冷卻、離心的步驟， 4) 將步驟2)、3)的上清液合并，用1 %的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至中性，離心分離，取上清 液凍干 5) 將步驟4)得到的凍干產(chǎn)物用用滅菌注射用水溶解，裝入透析袋，透析至檢測無鈉離 子后冷凍干燥既得革胡子鯰抗菌肽。
【文檔編號】C07K1/34GK105985404SQ201510100188
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月2日
【發(fā)明人】李濤, 王曉梅, 王妍
【申請人】天津農(nóng)學(xué)院