一種人c1qb多肽及其抗體制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種N端特異的人C1QB多肽以及抗體的制備方法，屬于以抗體為特征的體外實驗用的生物制品。N端特異的人C1QB多肽的氨基酸序列為：EQGENVFLQATDKN。抗人C1QB多肽抗體按以下方法制備：(1)人C1QB抗原表位分析；(2)人C1QB N端多肽合成；(3)合成多肽與載體蛋白交聯(lián)；(4)制備兔抗人C1QB多肽抗體；(5)收集、分離得到含有抗體的血清，純化抗體，即得到抗人C1QB多肽抗體。本發(fā)明制備的N端特異的抗人C1QB合成多肽抗體效價高、親和力強、特異性好，可與天然人C1QB發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)；制備成本低；純化后的抗體可以用于免疫印跡和免疫組化。該抗體為C1QB蛋白的基礎(chǔ)研究，比如對C1QB的特性、功能、表達譜和含量的分析，及其相關(guān)疾病的研究提供了一個重要的工具。
【專利說明】
一種人C1QB多肽及其抗體制備方法 1.
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種多肽及其抗體制備方法，這種抗體主要用于天然蛋白抗原的檢 測。 2.
【背景技術(shù)】
[0002] 1) C1QB功能：C1QB基因位于1號染色體上編碼255個氨基酸，其編碼人補體組件 的一個重要組成部分Clq。Clq屬于膠原凝集素家族的一種糖蛋白。Clq可以結(jié)合C1R和 Cls生成血清補體系統(tǒng)的第一組分。Clq的是由18條多肽鏈組成：6個A鏈，6個B鏈，6個 C鏈。每條鏈包含位于鄰近的N末端和C末端膠原蛋白樣球狀區(qū)域。A，B和C鏈按ACB的 順序排列在1號染色體上。該基因編碼人補體Clq的B鏈多肽。Clq球蛋白正面可以特定 結(jié)合 IgG 的 CH2 結(jié)構(gòu)域或是 IgM 的 CH3 結(jié)構(gòu)域（McClive PJ. 1996 ;43(6) :370-6.)。
[0003] 2) C1QB抗體產(chǎn)品信息：經(jīng)檢索，除我公司產(chǎn)品外，市場上沒有其他Anti-CIQB多克 隆抗體。
[0004] 3) C1QB抗體的應(yīng)用：相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Clq的生理作用是清除免疫復(fù)合物以及機體 的凋亡小體，如果這一過程被中斷將會引發(fā)自身免疫疾病。在體內(nèi)Clq蛋白的缺失與紅斑 狼瘡和腎小球腎炎發(fā)生有關(guān)，這就提示我們，該靶蛋白有可能在不久的將來成為一個潛在 的具有基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用價值的疾病標(biāo)志物。 3.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種C1QB多肽，其序列為：EQGENVFLQATDKN。用此多肽制備的抗 C1QB抗體可以在免疫印跡（Western blot)及免疫組化（IHC)分析中特異識別組織或細胞 中的天然C1QB蛋白。抗C1QB抗體是通過以下步驟獲得的：
[0006] 步驟一：多肽序列的分析和設(shè)計：利用DNAstar軟件對C1QB蛋白的氨基酸序列進 行抗原表位分析，主要評估親水性，抗原性，表面可能性，柔性區(qū)等指數(shù)，再結(jié)合過去制備抗 體的實際經(jīng)驗，最終確定C1QB蛋白217-230位14個氨基酸作為合成多肽氨基酸序列，序列 為 EQGENVFLQATDKN。
[0007] 步驟二：多肽合成和交聯(lián)：采用ACT396全自動多通道多肽合成儀合成目的多肽， 并采用質(zhì)譜進行鑒定；為增強多肽的抗原性，將C1QB多肽與載體蛋白KLH采用Sulfo-SMCC 交聯(lián)法進行交聯(lián)。
[0008] 步驟三：多肽免疫和抗血清制備：將交聯(lián)后的C1QB-KLH與弗氏佐劑混合乳化，在 新西蘭兔背部進行皮內(nèi)注射免疫，并反復(fù)加強免疫，至取血檢測抗體效價達到標(biāo)準時停止 免疫。
[0009] 步驟四：抗體純化：實驗兔抗體效價達到標(biāo)準后，采用心臟取血，分離抗血清，采 用Protein A純化全抗體后，進一步采用肽親和純化，得到目標(biāo)抗體。
[0010] 抗C1QB抗體是通過以下步驟鑒定的：
[0011] 步驟一：免疫印跡：將所獲得的C1QB抗體作為一抗，采用標(biāo)準的免疫印跡方法，確 認該抗體能夠與變性后的天然C1QB蛋白相互作用，可用于免疫印跡試驗。
[0012] 步驟二：免疫組化：將所獲得的C1QB抗體作為一抗，采用標(biāo)準的免疫組化方法，用 于檢測組織芯片（9種組織），確認該抗體能夠與具有天然結(jié)構(gòu)的C1QB蛋白相互作用，可用 于免疫組化試驗。 4.
【附圖說明】
[0013] 圖1為免疫印跡圖（Western blot)
[0014] 圖2為免疫組化（IHC)圖 5.
【具體實施方式】
[0015] 1.多肽序列的分析和設(shè)計
[0016] 利用DNAstar軟件對C1QB蛋白的氨基酸序列進行抗原表位分析，主要評估親水 性，抗原性，表面可能性，柔性區(qū)等指數(shù)，再結(jié)合過去制備抗體的實際經(jīng)驗，考慮氨基酸結(jié) 構(gòu)復(fù)雜程度，易氧化程度，合成難度，氨基酸類別和分布等，最終確定C1QB蛋白217-230 位14個氨基酸作為合成多肽氨基酸序列，序列為EQGENVFLQATDKN。同時，為保證后期多 肽交聯(lián)載體蛋白以及肽親和純化，在N末端增加一個半胱氨酸C，最終待合成多肽序列為 EQGENVFLQATDKN。
[0017] 2.多肽合成和交聯(lián)
[0018] 采用ACT396全自動多通道多肽合成儀，按照編制好的程序自動合成目的多肽，將 合成后的多肽溶于50%乙腈，采用質(zhì)譜儀進行鑒定，確認所獲得的多肽為目的多肽。采用 Sulfo-SMCC作為交聯(lián)劑將載體蛋白KLH與合成多肽進行交聯(lián)：取10mg KLH溶于0. 5ml超 純水中；取3mg sulfo-SMCC溶于0. 5ml超純水中，用3M NaOH調(diào)pH值7左右。在混勻情 況下，把sulfo-SMCC溶液逐滴緩慢加入KLH溶液中，室溫下旋轉(zhuǎn)混勻反應(yīng)物30min。將反 應(yīng)好的sulfo-SMCC/KLH混合液上樣到預(yù)先用平衡緩沖液（0. 05M PB，pH6. 0)平衡過30min 的S印hadex G25柱中，收集淺灰色洗脫液，即活化的sulfo-SMCC/KLH溶液。用200ul PBS (pH7. 3)溶解待2mg交聯(lián)多肽，把0. 2體積的sulfo-SMCC/KLH復(fù)合物溶液加入到多肽 溶液中，調(diào)pH值到7. 3,室溫振搖4小時，-70冷凍后，用凍干機凍干24小時后備用。通過 Ellman法檢測交聯(lián)前后多肽巰基確定多肽交聯(lián)效率。
[0019] 3.多肽免疫和抗血清制備
[0020] 將交聯(lián)好的KLH-多肽400 μ g溶于400 μ 1磷酸緩沖液（0. 01M PBS)中，加入等體 積弗氏完全佐劑充分乳化（至在水中不擴散為準）。采用兔齡3個月，體重1. 75-2. 25Kg的 健康新西蘭兔進行免疫，進行背部皮內(nèi)注射免疫，至少要注射20點以上。首次免疫3周后， 將300 μ g多肽溶于300 μ 1磷酸緩沖液（0. 01M PBS)中，與等量的弗氏不完全佐劑充分乳 化后進行皮內(nèi)免疫，作為第一次加強免疫，要求背部皮內(nèi)注射免疫，至少要注射15點以上。 第二次免疫3周后，進行第二次加強免疫，方法和要求同第一次加強免疫。1周后，采用耳緣 靜脈微量取血，用未交聯(lián)的合成多肽包被酶標(biāo)板，間接ELISA法檢測免疫血清效價。重復(fù)加 強免疫和效價測定，直至血清效價達到1 : 60000以上，采用心臟取血，標(biāo)準方法獲得抗血 清。
[0021] 4.抗體親和純化
[0022] (1)、TIgG 純化：用移液器將 50% 的 Protein-A Sepharose 混懸液 10ml 加到 30ml 層析柱中，去掉頂蓋和底帽，液體流出后的柱床體積即為5ml，然后用25ml去離子水沖洗 3遍。取出對應(yīng)的血清10ml，與2ml PBS混合后加入30ml層析柱中，旋轉(zhuǎn)混合器上室溫 (20-25°C )混旋1小時，讓血清樣品流出。再用15ml純化洗液洗層析柱3次，加入10ml洗 脫液進行洗脫。
[0023] (2)、肽親和純化：在層析柱中加入1ml Sulfo-link凝膠懸液（0. 5ml凝膠），待柱 內(nèi)液體流干，用4ml偶聯(lián)緩沖液沖洗層析柱。用lml偶聯(lián)緩沖液溶解合成的C1QB多肽，并 加入層析柱，再加入lml偶聯(lián)緩沖液至層析柱中，室溫顛倒混勻1小時。用6ml偶聯(lián)緩沖液 沖洗層析柱，然后加入3ml封閉液，室溫混勻1小時。沖洗層析柱3次，然后向?qū)游鲋鶅?nèi)加 入6ml IgG及3ml PBS，室溫顛倒混勻1小時。用PBS沖洗層析柱3次，然后用2ml洗脫液 洗脫。將所獲得的純化抗體裝入透析袋內(nèi)4°C透析。透析過夜，然后4000rpmX35min離心 除沉淀，收集上清。用間接ELISA法測定抗體效價并用Bradford法測定蛋白濃度。
[0024] 抗C1QB抗體是通過以下步驟鑒定的：
[0025] 1.免疫印跡分析
[0026] 按照標(biāo)準方法配制SDS-PAGE凝膠，將5 μ 1蛋白濃度為5mg/ml的細胞或者組織裂 解液依次加樣，恒壓80V約30分鐘，待樣品跑過濃縮膠基本呈一條直線時，改換160V電壓， 電泳至溴酚藍指示劑完全跑出分離膠（約60分鐘）時終止電泳，采用電轉(zhuǎn)膜方法恒壓100V 電轉(zhuǎn)80分鐘轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。將所獲得的C1QB抗體作為一抗，采用濃度為1 μ Ι/ml與上述 轉(zhuǎn)膜得到的抗原芯片在室溫下雜交1小時，然后用HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體在室溫下雜交1 小時，采用ECL顯色法進行顯色，在暗室中用X片進行顯色和曝光，得到免疫印跡結(jié)果。
[0027] 2.免疫組織化學(xué)分析
[0028] 將4%甲醛溶液固定的組織切成1. 5mmX 1. 5mmX2. 0-3. 0mm的組織塊，乙醇梯度 脫水后二甲苯透明30分鐘，62°C石蠟浸蠟2小時后，在組織包埋機上將9種組織按照3X3 的排列方式用石蠟進行包埋。采用標(biāo)準石蠟切片方法將切好的4-5 μ m厚的組織芯片蠟片 貼附于APES處理過的載玻片上，在烤片機60°C烤片1小時，然后在烤箱中60°C烤片6小 時。采用標(biāo)準免疫組化方法，室溫下用100 μ 1 10%羊血清于濕盒中封閉切片30分鐘，加 入100 μ 1濃度為2-4 μ g/ml的C1QB抗體，濕盒中4°C過夜，PBS清洗后加入生物素標(biāo)記羊 抗兔IgG于濕盒中37°C孵育30分鐘，然后PBS清洗后加入HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素濃縮液， 濕盒中37°C孵育30分鐘，洗片后1% DAB顯色，蘇木素復(fù)染，復(fù)藍，脫水，透明，封片，鏡檢， 檢查結(jié)果并拍照。
【主權(quán)項】
1. 一種人CIQB多肽，其特征在于多肽的氨基酸序列為：EQGENVFLQATDKN。2. -種抗人C1QB多肽的抗體制備方法，其特征在于按權(quán)利要求1所述序列合成N端修 飾肽，將合成的N端修飾肽與載體蛋白交聯(lián)，用交聯(lián)的肽免疫動物，取免疫動物的血制備抗 血清，從血清中分離純化IgG，其中所述的N端修飾為在氨基酸序列的N端增加一個半胱氨 酸殘基。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體制備方法，其特征在于載體蛋白為匙孔血藍蛋白（KLH) 或牛血清白蛋白（BSA)。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體制備方法，其特征在于N端修飾肽通過交聯(lián)劑將其巰基 與載體蛋白氨基共價交聯(lián)。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體制備方法，其特征在于交聯(lián)肽與免疫佐劑混合乳化后， 在兔背部通過多點皮下注射，并經(jīng)二次以上加強免疫，血清的效價大于1 : 10000。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體制備方法，其特征在于經(jīng)過硫酸銨沉淀、蛋白A親和純化 以及肽親和純化可以從抗血清中獲得高純度的IgG。
【文檔編號】C07K16/18GK105985423SQ201510054361
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年1月30日
【發(fā)明人】江虹
【申請人】天津奧維亞生物技術(shù)有限公司