Lgr4蛋白片段及其在制備治療破骨細胞誘導(dǎo)的骨病的藥物中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供一種分離的具有SEQ ID NO.1所示的LGR4蛋白片段，該蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的蛋白序列。本發(fā)明還提供該蛋白片段在用于制備治療破骨細胞誘導(dǎo)的骨病的藥物中的用途，其中所述蛋白片段可抑制體內(nèi)破骨細胞分化。進一步的，本發(fā)明還提供該蛋白片段在用于研究體外或體內(nèi)抑制破骨細胞分化的用途。
【專利說明】
LGR4蛋白片段及其在制備治療破骨細胞誘導(dǎo)的骨病的藥 物中的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的 LGR4 (Leucine-rich repeat containing G-protein coupled receptor 4,富亮氨酸重復(fù)基序G蛋白偶聯(lián)受體4)的蛋白片段，具體地，本發(fā)明涉 及一類與骨質(zhì)疏松癥與骨巨細胞瘤相關(guān)的LGR4蛋白片段，以及其在制備治療破骨細胞誘 導(dǎo)的骨病的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來關(guān)于破骨細胞調(diào)節(jié)人體生理功能的研究不斷增多，越來越多的研究證明破 骨細胞不僅參與生物體骨代謝的自身平衡，在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中也占有一席之地（Immunol Rev. 2005Dec ;208:19-29.)。更重要的是，在許多病理狀態(tài)下，破骨細胞功能缺失或者過度 活化都時有發(fā)生，以至增加疾患者的痛苦與治療復(fù)雜性。比如，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病癥患者往往 伴隨破骨細胞功能亢進，導(dǎo)致嚴重的骨質(zhì)丟失，使病人飽受痛苦；乳腺癌患者晚期往往易發(fā) 生骨轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移至骨的癌細胞能促進破骨細胞過度活化，也能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，對患者的治療 和生活狀態(tài)都帶來極大不便；畸形性骨炎中破骨細胞的過度活化是患者骨骼畸形的主要原 因；骨巨細胞瘤中破骨樣細胞劇烈活化，致患者骨質(zhì)嚴重丟失，致殘致畸；骨胳石化癥患者 中破骨細胞功能丟失，疾患骨密度過高，易畸形，這些都給生活帶來不便。此外，正常生理狀 況下，婦女絕經(jīng)后也易發(fā)生骨丟失，其主要原因也正在于破骨細胞功能亢進（Nat Rev Drug Discov. 2012 May ;11(5) :401-19. doi:10· 1038/nrd3705.)。因此，針對破骨細胞開發(fā)藥物 靶點的研究在骨疾病領(lǐng)域尤其是骨質(zhì)疏松癥占了絕大比例。
[0003] 目前針對破骨細胞相關(guān)疾?。òü琴|(zhì)疏松癥及骨巨細胞瘤）的藥物治療可以分 為兩大類，一類是小分子化合物，如雙磷酸鹽類藥物；二是蛋白類藥物，如RANKL誘導(dǎo)受體 RANK-Fc及0PG蛋白、RANKL單抗地諾單抗（Denosumab)。具體而言，小分子化合物方面，雙 磷酸鹽能夠促進成熟破骨細胞凋亡，從而對破骨細胞相關(guān)疾病能有治療作用。截止目前，雙 磷酸鹽類藥物發(fā)展經(jīng)歷了三代：第一代雙磷酸鹽是不含氮的雙磷酸鹽，包括依替膦酸鈉、氯 屈膦酸鈉及替魯膦酸鈉。由于它們的結(jié)構(gòu)與雙磷酸基很相似，因此當破骨細胞吸收骨表面 礦化區(qū)后，它們在二型RNA氨基轉(zhuǎn)移合成酶的作用下能插入到新合成的腺苷三磷酸（ATP) 中，這種不可水解的ATP類似物在胞內(nèi)不斷累積后會抑制由ATP介導(dǎo)的多種細胞過程，從而 對破骨細胞產(chǎn)生細胞毒作用，導(dǎo)致破骨細胞凋亡；與初代雙磷酸鹽不同的是，第二代及第三 代雙磷酸鹽（阿侖膦酸鈉、利塞膦酸鈉、埃本膦酸鈉、帕米膦酸鈉以及唑來膦酸）在R 2側(cè)鏈 處存在氮原子，它們引起破骨細胞凋亡的機理與初代雙磷酸鹽不同。研究表明這兩代雙磷 酸鹽能結(jié)合并抑制法尼基焦磷酸合成酶，而這種酶調(diào)節(jié)甲羥戊酸代謝為膽固醇及其他甾醇 以及類異戊二烯脂質(zhì)，由此，調(diào)節(jié)破骨細胞核心活性（如應(yīng)力纖維裝配、膜皺褶及存活）的 蛋白（包括Rab、Rac及Rho)的翻譯后修飾（異戊二烯化）會受到抑制并最終引起破骨細胞 凋亡。臨床上，雙磷酸鹽對破骨細胞的這一作用使它廣泛應(yīng)用于多種與破骨細胞功能亢進 相關(guān)的疾病中，包括多種類型的骨質(zhì)疏松癥（如青春期的、絕經(jīng)后的或是年老后的骨質(zhì)疏 松癥，糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松，器官移植及長時間不動引發(fā)的骨質(zhì)疏松以及去雄激素 相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥）、佩吉特氏骨病、成骨不全癥、高血鈣癥及惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移（Mayo Clin Proc. 2008Sep ；83 (9) : 1032-45. doi : 10. 4065/83. 9. 1032.) 〇
[0004] 蛋白類藥物方面，目前基礎(chǔ)科研與臨床應(yīng)用主要針對破骨細胞分化及活化所需 的RANKL蛋白進行研發(fā)，較為知名的是RANKL競爭型受體蛋白及近年來已用于部分臨床病 癥的地諾單抗。已有兩種針對RANKL開發(fā)的競爭型受體蛋白見諸報道：一是包含RANK受 體部分結(jié)構(gòu)域的RANK-Fc多肽，它由RANK的胞外段CRD結(jié)構(gòu)域與IgGl的Fc結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。 RANK-Fc能特異性地結(jié)合RANKL而不與其他TNF家族配體相互作用，從而在一些臨床前模型 中發(fā)揮抑制骨吸收的作用；二是〇PG-Fc多肽。0PG是天然的RANKL誘餌受體，能夠與RANK 受體競爭結(jié)合RANKL從而阻斷RANKL-RANK信號通路。OPG-Fc多肽的研發(fā)經(jīng)歷了多個階 段，早期研究發(fā)現(xiàn)大劑量（>10-30mg/kg)的重組0PG全長多肽能有效抑制小鼠體內(nèi)的骨吸 收現(xiàn)象，這種0PG全長多肽的結(jié)構(gòu)比較固化，因此它的藥代動力學(xué)參數(shù)很不樂觀。隨著研究 深入，又研發(fā)出了只包含N末端CRD結(jié)構(gòu)域而缺失C末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)的0PG多肽，這種多肽的 藥代動力學(xué)水平得到了明顯提高，經(jīng)過對0PG截短體進行大規(guī)模篩選后，研究者發(fā)現(xiàn)人類 0PG蛋白的22-194氨基酸多肽片段與IgGl的Fc結(jié)構(gòu)域融合后形成的OPG-Fc多肽能比全 長0PG蛋白有近200倍的活性提高，且這一多肽在體內(nèi)也具有更長的半衰期。利用原核表 達系統(tǒng)得到的OPG-Fc多肽的一期臨床實驗表明它在體內(nèi)能濃度梯度依賴地迅速促進骨更 新，這一實驗首次說明阻斷RANKL信號對人類骨更新是有效果的。同時，另一種由哺乳動 物細胞表達的〇PG-Fc多肽（AMGN-0007)也具有這一效果，且其半衰期更長（近10倍于原 核表達的OPG-Fc多肽），效果也要好2-3倍，這可能是因為真核系統(tǒng)中0PG還發(fā)生了糖基 化之故?？偟膩碚f，針對RANKL設(shè)計的競爭受體能有效抑制體內(nèi)破骨細胞的活性，從而改善 骨丟失現(xiàn)象。除去競爭受體之外，近年來還有研究團隊開發(fā)出了 RANKL特異性抗體地諾單 抗，開啟了破骨細胞的抗體治療途徑。地諾單抗是一類IgG2單克隆抗體，與人RANKL蛋白 具有極高親和力，其解離平衡結(jié)合常數(shù)（Kd)為3pM，它與可溶性形式及膜結(jié)合形式的RANKL 都能相互作用，但不識別小鼠及大鼠的RANKL蛋白。臨床研究表明，地諾單抗療效與安全性 兼?zhèn)?，對骨質(zhì)疏松癥及癌癥引起的骨丟失與骨破壞均具有顯著療效。進一步研究還發(fā)現(xiàn)地 諾單抗還能遲滯與預(yù)防前列腺癌及乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。此外，還有研究表明地諾單抗對 骨巨細胞瘤患者也有療效（Nat Rev Drug Discov.2012May ;11(5) :401-19. doi:10. 1038/ nrd3705.)。這些研究表明針對RANKL設(shè)計研發(fā)形成的藥物能有效抑制破骨細胞活性，且對 破骨細胞相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥及骨巨細胞瘤具有顯著效果。因此，抑制RANKL分子的藥物開 發(fā)具有廣泛用途與價值。
[0005] 中國專利申請201310047174、發(fā)明名稱"珍珠母蛋白N16的制備方法及其在制備 防治骨科疾病藥物中的應(yīng)用"公開了一種利用基因重組法在細菌中表達珍珠母蛋白N16,建 立了 N16的分離純化方案。所制備得到的N16能抑制前體破骨細胞的增殖，抑制RANKL誘導(dǎo) 前體破骨細胞分化成為成熟的破骨細胞，抑制破骨細胞標志性酶酸性磷酸酶TRAP的活性， 抑制破骨細胞的形成，抑制破骨細胞分化相關(guān)基因的表達，抑制破骨細胞分化成熟。實驗結(jié) 果表明，N16蛋白不僅能促進成骨細胞分化，更能抑制破骨細胞分化，從而達到抗骨質(zhì)疏松 和治療骨折的目的。這預(yù)示著該蛋白有可能用于增強成骨細胞的礦化功能，治療去卵巢引 起的骨質(zhì)疏松癥。
[0006] 中國專利申請201210232648、發(fā)明名稱"包含cFms胞外片段的融合蛋白質(zhì)及其 制備方法和應(yīng)用"公開了一種包含巨噬細胞刺激因子受體（cFms)胞外片段的融合蛋白質(zhì)， 該蛋白具有結(jié)合白細胞介素-34(IL-34)和結(jié)合巨噬細胞刺激因子（M-CSF)，阻斷IL-34/ M-CSF配體跟共用受體cFms的結(jié)合的作用，適合治療異常情況下由IL-34/M-CSF所引起的 疾病。對自身免疫性疾病、炎癥性疾病、骨質(zhì)疏松癥和腫瘤具有潛在的治療前景。
[0007] 國際專利申請TO2010/117011、發(fā)明名稱為"anti-Siglec 15 antibody"公開了一 種能夠靶向由在破骨細胞中強烈表達的基因編碼的蛋白的抗體。該抗體特異性靶向在巨細 胞瘤中特異性表達的Siglec 15基因，并抑制破骨細胞形成的活性，取得良好的效果。
[0008] 如上所述，目前用于抑制或治療因破骨細胞引起的骨質(zhì)類疾病的蛋白類藥物，多 集中在制備特異性抗體、抑制劑或RANKL競爭型受體方面，而針對G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR) 靶點設(shè)計開發(fā)治療破骨細胞相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥與骨巨細胞瘤很少有報道。近些年隨著各類 生物基因組測序的完成和比較基因組學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)在脊椎動物和非脊椎動物中還存 在許多與上述糖蛋白激素受體結(jié)構(gòu)相似或具有同源性的受體蛋白。在脊椎動物中，按照這 些受體蛋白被發(fā)現(xiàn)的時間先后順序，依次命名為LGR4、LGR5、LGR6、LGR7和LGR8等。這些 結(jié)構(gòu)相似的蛋白構(gòu)成了 GPCR超家族中一個亞家族，即富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受 體（LGR，Leucine-rich G-protein Coupled Receptor)。系統(tǒng)進化分析法顯不 LGRs 可以 分成三個亞組：第一組為經(jīng)典的糖蛋白激素受體，包括卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone, FSH)受體、促甲狀腺激素 （thyroid stimulating hormone，TSH)受體以及黃體 生成素 （luteinizing hormone, LH)受體，其各自與糖蛋白激素 FSH，TSH和LH/hCG結(jié)合。 第二組由LGR4-6組成，一度因其功能和同源配體不明而歸屬于孤兒受體，近期有研究發(fā)現(xiàn) Rspondin家族成員能與LGR家族的胞外段結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用并激活WNT信號通路，因此， Rspondin家族成員被認為是LGR家族的天然配體。第三組包括LGR7與LGR8,最近發(fā)現(xiàn)分別 是松弛素和萊迪希膜島素樣肽（Leydig insulin-like peptide or relaxin-like factor 3, INSL3)受體。迄今為止，LGR已知的生理學(xué)功能主要涉及到眼部或腎臟發(fā)育和生殖。
[0009] 關(guān)于LGR4,人類LGR4基因定位于染色體的11ρ14~13上（Am J Med Genet A. 2011 Jun ;155A(6) :1272-80. doi:10. 1002/ajmg. a. 33878.)，屬G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)A家族，又 屬于富亮氨酸重復(fù)基序G蛋白偶聯(lián)受體（LGR)家族（Development 136,2747-2756(2009) doi : 10. 1242/dev. 033571)，編碼一個含有951個氨基酸的細胞膜受體蛋白。鼠 Lgr4基 因定位于2號染色體上，也編碼一個含有951個氨基酸的細胞膜受體蛋白。LGR4在體內(nèi) 分布相當廣泛，包括生殖系統(tǒng)、腎臟、腎上腺、骨骼等等，并且早在小鼠胚胎的第7天，LGR4 就已開始表達，提示LGR4在小鼠發(fā)育中的重要作用（Katoh-Fukui Y，0waki A, Toyama Y, et al. Mouse Polycomb M33 is required for splenic vascular and adrenal gland formation through regulating Ad4BP/SFl expression. Blood, 2005, 106(5):1612-20.)〇 另外，LGR4基因敲除小鼠子宮內(nèi)發(fā)育遲緩以及出生后的高死亡率也說明LGR4對小鼠的 胚胎發(fā)育具有非常重要的影響（Mendive F, Laurent P, Van Schoore G，et al. Defective postnatal development of the male reproductive tract in LGR4 knockout mice. Dev Biol, 2006, 290(2) :421-34.)，但迄今為止對于LGR4在具體器官胚胎期發(fā)育中的 功能尚未見有文獻報道。而目前研究較為深入的是LGR4對小鼠生殖系統(tǒng)出生后發(fā) 育的影響。LGR4基因敲除小鼠輸出小管和附睪出生后發(fā)育異常，延伸和擴展障礙，并 引起管道堵塞和睪丸積水，最終導(dǎo)致雄性小鼠不育。究其原因可能是LGR4影響生殖 道細胞的增殖和分化（Hoshii T，Takeo T，Nakatata N，et al.LGR4 Regulates the Postnatal Development and Integrity of Male Reproductive Tracts in Mice. Biol R印rod, 2007, 76 (2) : 303-13.)。此外，LGR4也參與腎臟的發(fā)育，LGR4缺陷導(dǎo)致腎小球數(shù)目 減少（Lala DS, Rice DA, Parker KL, et al. Steroidogenic factor I, a key regulator of steroidogenic enzyme expression, is the mouse homolog of fushi tarazu-factor I. Mol Endocrinol, 1992, 6 (8) : 1249-58.)。最近還發(fā)現(xiàn)LGR4能促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，但 對細胞的增殖似乎沒有影響（Honda S，Morohashi K, Nomura M，et al.Ad4BP regulating steroidogenic P_450gene is a member of steroid hormone receptor superfamily. J Biol Chem，1993, 268(10) :7494-502.)。目前對于LGR4功能的認識僅限于以上所述。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明原理在于，發(fā)明人是首次創(chuàng)新地研究發(fā)現(xiàn)LGR4的蛋白片段（laa-504aa， LGR4-ECD)能與RANK競爭結(jié)合RANKL，從而抑制破骨細胞分化與功能的分子機理，說明LGR4 蛋白片段可用于開發(fā)RANKL競爭多肽藥物從而抑制破骨細胞活性的可能性。鑒于以上發(fā) 現(xiàn)，發(fā)明人利用原核表達系統(tǒng)，以重組表達LGR4的蛋白片段，發(fā)現(xiàn)原代骨髓單核吞噬細胞 經(jīng)該蛋白處理后，其由RANKL或成骨細胞誘導(dǎo)的向成熟破骨細胞分化的能力能被完全抑 制，并呈現(xiàn)濃度梯度依賴性。此外，該蛋白片段還能有效抑制病理狀態(tài)下骨巨瘤患者腫瘤細 胞中巨細胞的分化；同時，在兩種小鼠骨質(zhì)疏松動物模型中的研究進一步發(fā)現(xiàn)，該蛋白片段 既能預(yù)防又能治療由于破骨細胞過度活化所致的骨丟失現(xiàn)象。
[0011] 因此，本發(fā)明第一個目的是提供一種分離的具有LGR4蛋白質(zhì)胞外段結(jié)構(gòu)的蛋白 片段，所述蛋白片段的序列是選自如下所示的蛋白序列之任一種：
[0012] (1)如SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列；
[0013] (2)與SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列具有至少90%同一性且具有相同功能的蛋 白；
[0014] (3)在SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列中發(fā)生一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加、但具有相同功能的蛋白；
[0015] (4)在SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列的編碼序列的基礎(chǔ)之上經(jīng)過一至數(shù)個堿基替 換和/或一至數(shù)個堿基的插入和/或缺失、以及大片段的核苷酸序列插入、缺失、移位、或倒 位后，所表達的且具有相同功能的蛋白片段；或
[0016] (5)在中度嚴格條件下能夠與SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列的編碼序列雜交且編 碼得到的具有相同功能的蛋白片段。
[0017] 在一個實施方案中，所述蛋白序列優(yōu)選還包括是發(fā)生1至5個突變、并與SEQ ID NO. 1序列具有至少99%同源性的蛋白的其他蛋白序列，其中該蛋白具有相同功能。在優(yōu)選 的實施方案中，所述突變是1-4個，更優(yōu)選是1-3個，或者更優(yōu)選是1或2個，最優(yōu)選是發(fā)生 1個突變。其中，所述突變優(yōu)選是替換、插入或缺失突變。應(yīng)當指出的是，本發(fā)明所涉及的蛋 白序列，其通過具有一定序列組成的蛋白所形成的特有空間構(gòu)象，與RANK競爭結(jié)合RANKL， 從而抑制破骨細胞分化與功能，其并非直接作用于相關(guān)位點或發(fā)揮功能來抑制抑制破骨細 胞分化與功能。而SEQ ID NO. 1所示蛋白序列全長504aa，其具有99%同源性的序列與所 述SEQ ID NO. 1所示蛋白序列，二者差別不到5個aa的突變。而對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言， 對于相同來源（人類基因組）的多個蛋白序列，彼此之間具有99%的同源性且不到5個突 變的序列，其更多情況被證實具有相同的功能，而不是被證實其功能缺失。因此本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以預(yù)見，在限定上述序列、有限同源性以及突變數(shù)量的前提下，所述的其他蛋白序列 同樣具有相同或相似的功能。
[0018] 在一個實施方案中，上述（1)中所述如SEQ ID NO: 1所示的蛋白片段為人源的 LGR4-ECD (以下簡稱h4)，其能與核因子κ B配體的受體激活子相結(jié)合。
[0019] 在其它的實施方案中，所述蛋白片段具有抑制RANKL、或抑制RANKL-RANK的結(jié)合 的功能，從而抑制或治療因破骨細胞引起的骨質(zhì)類疾病。
[0020] 本發(fā)明第二個目的是提供以上蛋白片段的基因編碼序列或其簡并序列。
[0021] 本發(fā)明第三個目的在于提供上述蛋白片段在制備治療破骨細胞誘導(dǎo)的骨病的藥 物中的用途。其中，所述蛋白片段用于抑制體內(nèi)破骨細胞分化。進一步地，包括所述蛋白片 段在骨質(zhì)疏松癥與骨巨細胞瘤疾病治療中的應(yīng)用，包括所述蛋白片段在制備治療骨質(zhì)疏松 癥與骨巨細胞瘤疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0022] 在一個實施方案中，所述蛋白片段能抑制成骨細胞誘導(dǎo)的破骨細胞分化。
[0023] 在另一實施方案中，所述蛋白片段能抑制由RANKL過度刺激所引起的體內(nèi)骨質(zhì)減 少。
[0024] 在另一實施方案中，所述蛋白片段能緩解患有骨質(zhì)疏松癥小鼠的骨質(zhì)減少，緩解 由于骨質(zhì)疏松引起的骨質(zhì)減少。
[0025] 在另一實施方案中，所述蛋白片段能抑制骨巨瘤患者的破骨細胞活性。
[0026] 在上述實施方案中，上述制藥用途包括制備抑制破骨細胞引起的骨質(zhì)疏松癥的藥 物、或抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的藥物。在一具體的實施方案中，其中，所述的抑制破骨細胞引 起的骨質(zhì)疏松癥的藥物是用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、腫瘤轉(zhuǎn)移引起的骨組織吸收 過多所致的骨質(zhì)疏松癥的藥物；其中，抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的藥物指抑制骨巨瘤或骨巨細 胞瘤的藥物，包括制備治療骨原發(fā)的良性侵襲性腫瘤的藥物。
[0027] 在上述實施方案中，所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的鹽、載體或輔料成分。
[0028] 在另外的實施方案中，上述藥物還可與其他藥物活性成分聯(lián)合制備上述疾病的藥 物。
[0029] 本發(fā)明第四個目的在于提供上述蛋白片段用于研究體外或體內(nèi)抑制破骨細胞分 化的用途。
[0030] 在一個實施方案中，所述用途是利用上述蛋白片段研究體外或體內(nèi)抑制破骨細胞 分化的用途。例如，將本發(fā)明所述蛋白片段用于制備在體外或體內(nèi)抑制破骨細胞分化的藥 物。
[0031] 在另一個實施方案中，所述用途是利用上述蛋白片段研究體外或體內(nèi)抑制成骨細 胞誘導(dǎo)的破骨細胞分化的用途。例如，將本發(fā)明所述蛋白片段用于制備在體外或體內(nèi)抑制 成骨細胞誘導(dǎo)的破骨細胞分化的藥物。
[0032] 在另一實施方案中，所述用途是利用上述蛋白片段研究體外或體內(nèi)抑制成由 RANKL過度刺激所引起的體內(nèi)骨質(zhì)減少的用途。例如，將本發(fā)明所述蛋白片段用于制備在體 外或體內(nèi)抑制由RANKL過度刺激所引起的體內(nèi)骨質(zhì)減少的藥物。
[0033] 在另一實施方案中，所述用途是利用上述蛋白片段研究體外或體內(nèi)緩解患有骨質(zhì) 疏松癥小鼠的骨質(zhì)減少的用途。例如，將本發(fā)明所述蛋白片段用于制備在體外或體內(nèi)緩解 由于骨質(zhì)疏松癥引起的骨質(zhì)減少的藥物。
[0034] 在另一實施方案中，所述用途是利用上述蛋白片段研究體外或體內(nèi)抑制骨巨瘤患 者的破骨細胞活性的用途。例如，將本發(fā)明所述蛋白片段用于制備在體外或體內(nèi)抑制骨巨 瘤中破骨細胞活性的藥物。
[0035] 在以上實施方案中，更具體的用途是利用上述蛋白片段，用于篩選抑制或緩解上 述疾病或癥狀的藥物的用途。上述疾病或癥狀包括，成骨細胞誘導(dǎo)的破骨細胞分化，由 RANKL過度刺激所引起的體內(nèi)骨質(zhì)減少，由于骨質(zhì)疏松癥引起的骨質(zhì)減少，骨巨瘤中及破骨 細胞活性。
[0036] 術(shù)語和定義
[0037] 術(shù)語"G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein Coupled Receptor, GPCR) "，是一類具有古老起 源的保守的細胞表面受體，其對多種環(huán)境刺激起反應(yīng)，引起細胞內(nèi)的應(yīng)答，在許多生理學(xué)過 程中發(fā)揮重要作用并且是藥物研究的重要靶點。
[0038] 術(shù)語"蛋白片段"，指LGR4活性蛋白中的部分片段。
[0039] 術(shù)語"人源LGR蛋白"指具有富亮氨酸重復(fù)基序的人源G蛋白偶聯(lián)受體（leucine rich repeat containing G prtein coupled receptor)家方矣。
[0040] 術(shù)語"人源LGR4蛋白片段"指具有SEQ ID NO: 1所示序列的氨基酸的蛋白片段， 其長度為504aa。其中，人LGR4蛋白的全長為951aa，其NCBI登錄號為NP_060960. 2,該全 長蛋白的功能為調(diào)控了眼、腎、睪丸、卵巢、子宮的臟器及智力發(fā)育，并能作為調(diào)控白色脂肪 向棕色脂肪轉(zhuǎn)換的開關(guān)，激活Wnt信號通路并促進結(jié)腸癌等癌癥的發(fā)生。
[0041 ]術(shù)語"RANK"，指受體激活型核受體因子 κ B(Receptor activator of nuclear factor κ B)，其NCBI登錄號為NP_033425. 3,其功能為引起乳腺癌發(fā)生，促進破骨細胞形成 并調(diào)節(jié)骨質(zhì)，促進淋巴結(jié)發(fā)育，增強T細胞生長及樹突狀細胞的功能。
[0042] 術(shù)語"RANKL"，指受體激活型核受體因子κ B配體（Receptor activator of nuclear factor κ B ligand)，其NCBI登錄號為NP_035743. 2,其功能為促進破骨細胞形成， 促進樹突狀細胞的存活，增強T細胞生長及樹突狀細胞的功能。
[0043] 術(shù)語"RANKL-RANK"，指RANKL與RANK蛋白的相互作用。
[0044] 術(shù)語"Opg敲除小鼠"，指Opg基因敲除小鼠，目前是一種公認的骨質(zhì)疏松動物模 型。
[0045] 術(shù)語"至少90%同一性"，指序列彼此之間相同位點數(shù)目的比例超過90%。本發(fā)明 中，所述蛋白序列優(yōu)選是具有91%、92%、93%、或94%同一性，更優(yōu)選是具有95%、96%、 或97%同一性，最優(yōu)選是具有98%、或99%同一性。
[0046] 術(shù)語"中等嚴格條件"指0· 1XSSPE(或0· 1XSSC)、0. l%SDS(w/v)的溶液中，65°C 條件下雜交并洗膜的條件。
【附圖說明】
[0047] 圖1所示為LGR4蛋白片段的純化表達圖，其中，
[0048] 圖la所示為LGR4蛋白片段SDS-PAGE考馬斯亮藍結(jié)果圖，箭頭所示為純化得到的 LGR蛋白片段。
[0049] 圖lb所示為LGR4蛋白片段蛋白免疫印跡結(jié)果圖，h4組的目的條帶為經(jīng)His標簽 抗體檢測確認的LGR4蛋白片段。NC，陰性對照。
[0050] 圖2所示為LGR4蛋白片段與RANKL相互作用圖，其顯示LGR4蛋白片段（LGR4 E⑶） 過表達293T細胞裂解液與RANKL蛋白免疫沉淀結(jié)果，RANKL可與LGR4 E⑶發(fā)生共沉淀， RSP0-1為陽性對照。
[0051] 圖3所示為LGR4蛋白片段與RANK競爭結(jié)合RANKL圖，其顯示LGR4蛋白片段（LGR4 E⑶）過表達293T細胞裂解液、RANK過表達293T細胞裂解液與RANKL蛋白免疫沉淀結(jié)果。 RANKL與RANK的相互作用隨著LGR4 E⑶加入濃度的提高而不斷減弱。
[0052] 圖4所示為LGR4蛋白片段體外抑制破骨細胞分化圖，其中，
[0053] 圖4a顯示抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)酶活檢測結(jié)果圖，酒紅色巨細胞為破骨細 胞，該結(jié)果表明LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能抑制由RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化。
[0054] 圖4b顯示LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶）抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化計量數(shù)據(jù) 分析圖，其中***P〈〇. 〇〇l，n = 3，p值經(jīng)student T-test檢驗而得，p值小于0. 001定義為 ***，以示LGR4蛋白片段抑制破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 3表示該實驗一組設(shè)計了 3個重復(fù)孔。
[0055] 圖5所示為LGR4蛋白片段抑制成骨細胞誘導(dǎo)的破骨細胞分化圖，其中，
[0056] 圖5a顯示抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結(jié)果圖，酒紅色巨細胞為破骨細胞。該 結(jié)果表明LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能抑制由成骨細胞誘導(dǎo)的破骨細胞分化。
[0057] 圖5b顯示LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶）抑制成骨細胞誘導(dǎo)的破骨細胞分化計量數(shù) 據(jù)分析圖，其中*P〈〇. 05, η = 3。p值經(jīng)student T-test檢驗而得，p值小于0. 05定義為 *，以示LGR4蛋白片段抑制破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 3表示該實驗一組設(shè)計了 3 個重復(fù)孔。
[0058] 圖6所示為LGR4蛋白片段抑制RANKL注射引起的破骨細胞分化及骨質(zhì)丟失的動 物實驗綜合圖，其中
[0059] 圖6a_l顯示抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結(jié)果圖，酒紅色信號為破骨細胞；該 結(jié)果表明LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶）能抑制RANKL誘導(dǎo)的體內(nèi)急性破骨細胞分化。圖6a-2 顯示LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)抑制RANKL誘導(dǎo)的體內(nèi)急性破骨細胞分化破骨細胞表面 積計量數(shù)據(jù)分析圖，其中***P〈〇. 001，η = 6。p值經(jīng)student T-test檢驗而得，p值小于 〇. 001定義為*#，以示LGR4蛋白片段抑制體內(nèi)破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 6表示 該實驗一組使用了 6只小鼠。
[0060] 圖6b-l所示為microCT結(jié)果顯示注射LGR4胞外段蛋白染色結(jié)果圖，箭頭所示為 骨損傷及蛋白片段處理后的修復(fù)區(qū)，該結(jié)果表明注射LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能緩解 RANKL注射所引起的骨質(zhì)丟失；圖6b-2顯示LGR4蛋白片段緩解RANKL注射引起的骨質(zhì)丟 失的骨量計量數(shù)據(jù)分析圖，其中*P〈〇. 05，**P〈0. 01，n = 6。p值經(jīng)student T-test檢驗而 得，P值小于〇. 05定義為*，p值小于0. 01定義為**，以示LGR4蛋白片段抑制體內(nèi)破骨細 胞分化有無顯著性差異；η = 6表示該實驗一組使用了 6只小鼠。
[0061 ] 圖7所示為LGR4蛋白片段緩解Opg敲除小鼠破骨細胞的過度活化及骨質(zhì)疏松癥 狀的動物實驗綜合結(jié)果圖
[0062] 圖7a所示為抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結(jié)果顯示注射LGR4蛋白片段 (LGR4-ECD，即h4,參見表1)能抑制Opg敲除小鼠顱骨中破骨細胞的過度活化，酒紅色信號 為破骨細胞。圖7a-l為染色結(jié)果圖，圖7a-2為數(shù)據(jù)分析圖。**P〈0. 01，***P〈0. 001，η = 6。ρ值經(jīng)student T-test檢驗而得，ρ值小于0. 01定義為**，ρ值小于0. 001定義為***， 以示LGR4蛋白片段抑制Opg敲除小鼠體內(nèi)破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 6表示該實 驗一組使用了 6只小鼠。
[0063] 圖7b所示為microCT結(jié)果顯示注射LGR4蛋白片段（LGR4-ECD，即h4,參見表1) 能緩解Opg小鼠顱骨的骨質(zhì)疏松癥狀，箭頭所示為骨損傷及蛋白片段處理后的修復(fù)區(qū)。圖 7b-l為染色結(jié)果圖，圖7b-2為數(shù)據(jù)分析圖。*P〈0. 05, #P〈0. 01，η = 6。p值經(jīng)student T-test檢驗而得，p值小于0. 05定義為*，p值小于0. 01定義為**，以示LGR4蛋白片段緩 解Opg敲除小鼠骨質(zhì)丟失有無顯著性差異；η = 6表示該實驗一組使用了 6只小鼠。
[0064] 圖7c所示為抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結(jié)果顯示注射LGR4蛋白片段 (LGR4-ECD，即h4,參見表1)能抑制Opg敲除小鼠脛骨中破骨細胞的過度活化，酒紅色信號 為破骨細胞。圖7c-l為低倍鏡顯示結(jié)果，圖7c-2為高倍鏡顯示結(jié)果，圖7c-3為數(shù)據(jù)分析 圖。***Ρ〈0· 001，η = 11。p 值經(jīng) student T-test 檢驗而得，p 值小于 0· 001 定義為 ***， 以示LGR4蛋白片段抑制Opg敲除小鼠體內(nèi)破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 11表示該 實驗一組使用了 11只小鼠。
[0065] 圖7d所示為microCT結(jié)果顯示注射LGR4蛋白片段（LGR4-ECD，即h4,參見表1) 能緩解〇pg小鼠脛骨的骨質(zhì)疏松癥狀。圖7d-l為染色結(jié)果圖，圖7d-2為數(shù)據(jù)分析圖。 *P〈0. 05，n = 11。p值經(jīng)student T-test檢驗而得，p值小于0. 05定義為*，以示LGR4蛋 白片段緩解〇pg敲除小鼠骨質(zhì)丟失有無顯著性差異；η = 11表示該實驗一組使用了 11只 小鼠。
[0066] 圖8所示為LGR4蛋白片段體外抑制骨巨細胞瘤患者中巨細胞活化結(jié)果圖，其中，
[0067] 圖8a所示為抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結(jié)果圖，酒紅色巨細胞為破骨細胞； 該結(jié)果表明LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能抑制骨巨細胞瘤原代細胞中破骨細胞的分化。圖 8b顯示LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)抑制骨巨細胞瘤原代細胞中破骨細胞分化的計量數(shù)據(jù) 分析圖，其中*P〈〇. 05, **p〈0. 01，η = 3。p值經(jīng)student T-test檢驗而得，p值小于0. 05 定義為*，P值小于〇. 〇1定義為**，以示LGR4蛋白片段抑制骨巨細胞瘤中破骨細胞分化有 無顯著性差異；η = 3表示該實驗一組設(shè)計了 3個重復(fù)孔。
【具體實施方式】
[0068] 現(xiàn)結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的保護內(nèi) 容不局限于以下實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的 變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護范圍。實施本發(fā)明的過 程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常 識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
[0069] 實施例一：LGR4蛋白片段的純化表達
[0070] PCR擴增LGR4基因，將擴增產(chǎn)物構(gòu)建到PET-28a(+)原核表達載體上，PET-28a-ECD 轉(zhuǎn)化Rosetta菌（全式金，cd801_03)，構(gòu)建過程參照表1。
[0074] 根據(jù)"生物物理學(xué)報2010年9月第26卷第9期：790-798"報道的一般原核表達 方法，將上述載體轉(zhuǎn)化Rosetta菌，誘導(dǎo)表達LGR4蛋白片段，實驗結(jié)果見圖1。
[0075] 圖la :LGR4蛋白片段（LGR4 ECD，h4) SDS-PAGE考馬斯亮藍結(jié)果圖，箭頭所示為純 化得到的LGR蛋白片段。
[0076] 圖lb :LGR4蛋白片段（LGR4 ECD，h4)蛋白免疫印跡結(jié)果圖，h4組的目的條帶為經(jīng) His標簽抗體檢測確認的LGR4蛋白片段。NC，陰性對照。
[0077] 實施例二：LGR4蛋白片段結(jié)合RANKL實驗
[0078] 使用lipofectamine2000按照制造商方案將含有上述LGR4片段的質(zhì)粒（構(gòu)建過 程參見下文）過表達于293T細胞中，轉(zhuǎn)染24小時后，細胞以PBS洗一遍，用細胞刮刀刮下， 經(jīng)12000rpm離心一分鐘后將細胞塊以RIPA弱裂解液于冰上裂解15分鐘，經(jīng)12000rpm 4 度離心10分鐘后取上清于新EP管中，分別加入500ngRANKL及200ngRSP0-l (陽性對照）； EP管置靜音混合器上4攝氏度孵育過夜（〈12小時），翌日每管加入5微升FLAG-M2珠子， 繼續(xù)于4攝氏度孵育3小時，后以3000rpm于4度離心1分鐘，去上清，用PBS洗3遍后以 1XSDS上樣緩沖液裂解珠子，100攝氏度煮沸10分鐘后進行免疫印跡實驗。免疫印跡實驗 具體流程如下：
[0079] 1)配置10 %分離膠
[0080] 2)將全部樣品上到膠孔中，60伏跑30分鐘，120伏繼續(xù)跑至溴酚藍到膠底（約75 分鐘）
[0081] 3)轉(zhuǎn)膜，100伏轉(zhuǎn)，40KD以下蛋白轉(zhuǎn)45分鐘，40KD~130KD蛋白轉(zhuǎn)90分鐘
[0082] 4) 5%脫脂牛奶室溫封閉1小時
[0083] 5) -抗4攝氏度結(jié)合過夜
[0084] 6) PBST洗滌4次，每次5分鐘，后上相應(yīng)熒光二抗，室溫1小時
[0085] 7)PBST洗滌3次，每次5分鐘，后用Licor Oddessy機子掃膜，記錄結(jié)果
[0086] 實驗結(jié)果見圖2
[0087] 圖2 :LGR4蛋白片段（LGR4 E⑶）過表達293T細胞裂解液與RANKL蛋白免疫沉淀 結(jié)果，RANKL可與LGR4 E⑶發(fā)生共沉淀，RSP0-1為陽性對照。
[0088] 表 2
[0089]
[0090] 根據(jù)實驗結(jié)果可見，本發(fā)明所述蛋白片段能夠與RANKL結(jié)合，具有抑制RANKL的效 果，本發(fā)明所述蛋白片段可用于抑制或治療因破骨細胞引起的骨質(zhì)類疾病。
[0091] 實施例三：LGR4蛋白片段抑制RANKL-RANK結(jié)合實驗
[0092] 使用lipofectamine2000按照制造商方案將10ug LGR4片段質(zhì)粒（參見表2)、 6ugRank、4ug FLAG-Vector以及2ugEGFP-N3分別過表達于293T細胞中，轉(zhuǎn)染24小時后， 細胞分別以PBS洗一遍，用細胞刮刀刮下，經(jīng)12000rpm離心一分鐘后將細胞塊以RIPA弱 裂解液于冰上裂解15分鐘，經(jīng)12000rpm4攝氏度離心10分鐘后取上清于新EP管中，按 如下設(shè)計混合蛋白裂解液：2ugEGFP-N3+2ugFLAG、2ugRANK+2ugFLAG、2ugRANK+2ugLGR4 片 段、2ugRANK+8ugLGR4片段，而后再分別加入lOOngRANKL ;EP管置靜音混合器上4攝氏度 孵育過夜，翌日每管先加入4微升RANK抗體（1 :50)，4攝氏度孵育3小時，再加入20微升 proteinA/G珠子，繼續(xù)于4攝氏度孵育3小時，后以3000rpm于4攝氏度離心1分鐘，去上 清，用PBS洗3遍后以1XSDS上樣緩沖液裂解珠子，100攝氏度煮沸10分鐘后進行免疫印跡 實驗。免疫印跡實驗具體流程如下：
[0093] 1)配置10 %分離膠
[0094] 2)將全部樣品上到膠孔中，60伏跑30分鐘，120伏繼續(xù)跑至溴酚藍到膠底（約75 分鐘）
[0095] 3)轉(zhuǎn)膜，100伏轉(zhuǎn)，40KD以下蛋白轉(zhuǎn)45分鐘，40KD~130KD蛋白轉(zhuǎn)90分鐘
[0096] 4) 5%脫脂牛奶室溫封閉1小時
[0097] 5) -抗4攝氏度結(jié)合過夜
[0098] 6) PBST洗滌4次，每次5分鐘，后上熒光二抗，室溫1小時
[0099] 7)PBST洗滌3次，每次5分鐘，后用LicorOddessy機子掃膜，記錄結(jié)果
[0100] 實驗結(jié)果見圖3
[0101] 圖3 :LGR4蛋白片段（LGR4 ECD)過表達293T細胞裂解液、RANK過表達293T細胞 裂解液與RANKL蛋白免疫沉淀結(jié)果。RANKL與RANK的相互作用隨著LGR4 ECD加入濃度的 提高而不斷減弱。
[0102] 根據(jù)實驗結(jié)果可見，本發(fā)明所述蛋白片段具有抑制RANKL-RANK的結(jié)合的效果，本 發(fā)明所述蛋白片段可用于抑制或治療因破骨細胞引起的骨質(zhì)類疾病。
[0103] 實施例四：LGR4蛋白片段體外抑制破骨細胞分化
[0104] 取6周大野生型與敲除型小鼠股骨與脛骨組織，剔除非骨組織，經(jīng)酒精消毒及PBS 洗滌后，用剪刀剪開股骨與脛骨的兩端，使用10毫升注射器及27G針頭按2~3ml α -MEM 培養(yǎng)基/股骨將骨髓單核吞噬細胞沖出至50毫升離心管中，細胞懸液經(jīng)lOOOrpm離心8分 鐘后去除上清，以5毫升含雙抗的無血清α -MEM培養(yǎng)基重懸細胞，后加入20毫升紅細胞 裂解液，上下混勻后靜置2分鐘，再加入25毫升含10 %血清的α-MEM培養(yǎng)基終止裂解，經(jīng) 1000印111離心8分鐘后去上清，用適量含10%血清的€[-|^1培養(yǎng)基重懸細胞，加入51^/1111 吞噬細胞集落刺激因子，待細胞貼壁過夜后取懸浮細胞至新培養(yǎng)皿中，加入l0ng/ml吞噬 細胞集落刺激因子培養(yǎng)，待細胞貼壁長滿后，以Versene消化細胞并按104個/孔接入24孔 板中，以核因子κΒ受體激活子配體（100ng/ml)及吞噬細胞集落刺激因子（10ng/ml))刺 激骨髓單核吞噬細胞向破骨細胞分化，在加入l00ng/ml RANKL誘導(dǎo)分化的同時加入濃度梯 度（20ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)的 LGR4 蛋白片段（LGR4-ECD，即 h4)(參見表 1)處理細 胞，經(jīng)6天分化后根據(jù)TRAP染色試劑盒說明書所述（Sigma公司）進行TRAP染色并計數(shù)統(tǒng) 計細胞分化情況。
[0105] 實驗結(jié)果見圖4。
[0106] 圖4a顯示抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)酶活檢測結(jié)果圖，酒紅色巨細胞為破骨細 胞，該結(jié)果表明LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能抑制由RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化。
[0107] 圖4b顯示LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶）抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化計量數(shù)據(jù) 分析圖，其中***P〈〇. 〇〇l，n = 3，p值經(jīng)student T-test檢驗而得，p值小于0. 001定義為 ***，以示LGR4蛋白片段抑制破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 3表示該實驗一組設(shè)計了 3個重復(fù)孔。
[0108] 根據(jù)實驗結(jié)果可見，本發(fā)明所述蛋白片段對破骨細胞的分化具有抑制作用。本發(fā) 明所述蛋白片段能夠抑制由RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞的分化。
[0109] 實施例五：LGR4蛋白片段抑制成骨細胞誘導(dǎo)的破骨細胞分化
[0110] 根據(jù)實施例四方法取得原代骨髓單核吞噬細胞（BMM);同時，選取出生后4天的乳 鼠取得成骨細胞，具體方法為：分離4天齡小鼠顱骨，經(jīng)75 %酒精洗滌晾干后用解剖刀刮干 凈顱骨表面至浸泡PBS中骨面呈白色為止；其后將顱骨置12孔板中，加入3. 5毫升普通強 度消化液（3. 5毫升α -MEM培養(yǎng)基、35微升10mg/ml膠原酶P、88微升0. 05%胰酶）于37 攝氏度培養(yǎng)箱中消化30分鐘，用無菌鑷子轉(zhuǎn)移顱骨至6孔板中，加入800微升高強度消化 液（1毫升α -MEM培養(yǎng)基、20微升10mg/ml膠原酶P、25微升0. 05%胰酶），用無菌剪刀將 顱骨剪成小碎片，以一片完整顱骨剪成均勻的30~40片為宜，于37攝氏度培養(yǎng)箱消化60 分鐘，最后加入2毫升培養(yǎng)基（42毫升α-MEM培養(yǎng)基、7. 5毫升胎牛血清、500微升100X雙 抗）終止消化待其貼壁；貼壁細胞即為成骨細胞。
[0111] 于96孔板中每孔接入1X104個BMM細胞與1X10 3個成骨細胞，24小時貼壁培養(yǎng)后 加入濃度梯度的LGR4蛋白片段（LGR4-ECD ;20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)處理細胞，經(jīng)7天 培養(yǎng)后根據(jù)TRAP染色試劑盒說明書所述（Sigma公司）進行TRAP染色并計數(shù)統(tǒng)計細胞分 化情況。
[0112] 實驗結(jié)果見圖5。
[0113] 圖5a顯示抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結(jié)果圖，酒紅色巨細胞為破骨細胞。該 結(jié)果表明LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能抑制由成骨細胞誘導(dǎo)的破骨細胞分化。
[0114] 圖5b顯示LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶）抑制成骨細胞誘導(dǎo)的破骨細胞分化計量數(shù) 據(jù)分析圖，其中*P〈〇. 05, η = 3。p值經(jīng)student T-test檢驗而得，p值小于0. 05定義為 *，以示LGR4蛋白片段抑制破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 3表示該實驗一組設(shè)計了 3 個重復(fù)孔。
[0115] 根據(jù)實驗結(jié)果可見，本發(fā)明所述蛋白片段對破骨細胞的分化具有抑制作用。本發(fā) 明所述蛋白片段能夠抑制由成骨細胞誘導(dǎo)的破骨細胞的分化。
[0116] 實施例六：LGR4蛋白片段抑制RANKL注射引起的破骨細胞分化及骨質(zhì)丟失的動物 實驗
[0117] 分別設(shè)立對照蛋白組、RANKL單注射組、LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶，即h4)單注射組 及RANKULGR4蛋白片段（LGR4-ECD，即h4)共注射組；將表達蛋白注射于6周齡的C57BL/6 小鼠顱骨皮下，連續(xù)注射14天后取小鼠顱骨，經(jīng)4%甲醛固定后，根據(jù)TRAP染色試劑盒說明 書所述（Sigma公司）對顱骨整體進行TRAP染色，于37攝氏度染色2小時；同時，顱骨樣品 由上海腫瘤研究所進行micro-CT檢測（SKYSCAN公司）。上述實驗結(jié)果見圖6。
[0118] 圖6a_l :抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結(jié)果圖，酒紅色信號為破骨細胞；該結(jié) 果表明LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶）能抑制RANKL誘導(dǎo)的體內(nèi)急性破骨細胞分化。圖6a-2顯 示LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)抑制RANKL誘導(dǎo)的體內(nèi)急性破骨細胞分化破骨細胞表面積計 量數(shù)據(jù)分析圖，其中***P〈〇. 〇〇l，n = 6。p值經(jīng)student T-test檢驗而得，p值小于0. 001 定義為***，以示LGR4蛋白片段抑制體內(nèi)破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 6表示該實驗 一組使用了 6只小鼠。
[0119] 圖6b-l :micr〇CT結(jié)果顯示注射LGR4胞外段蛋白染色結(jié)果圖，箭頭所示為骨損傷 及蛋白片段處理后的修復(fù)區(qū)，該結(jié)果表明注射LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能緩解RANKL注 射所引起的骨質(zhì)丟失；圖6b-2顯示LGR4蛋白片段緩解RANKL注射引起的骨質(zhì)丟失的骨量 計量數(shù)據(jù)分析圖，其中*Ρ〈〇· 05, **Ρ〈0· 01，η = 6。p值經(jīng)student T-test檢驗而得，p值 小于〇. 05定義為*，p值小于0. 01定義為**，以示LGR4蛋白片段抑制體內(nèi)破骨細胞分化 有無顯著性差異；η = 6表示該實驗一組使用了 6只小鼠。
[0120] 根據(jù)實驗結(jié)果可見，本發(fā)明所述蛋白片段能夠抑制由RANKL過度刺激引起的破骨 細胞分化、及體內(nèi)骨質(zhì)減少。
[0121] 實施例七：LGR4蛋白片段緩解Opg敲除小鼠破骨細胞的過度活化及骨質(zhì)疏松癥狀 的動物實驗
[0122] 對5月齡的野生型小鼠及Opg敲除小鼠分別設(shè)立對照蛋白組、LGR4蛋白片段 (LGR4-E⑶，即h4)注射組；將表達蛋白分別注射于野生型小鼠及Opg敲除小鼠顱骨皮下，連 續(xù)注射14天后取小鼠顱骨，經(jīng)4%甲醛固定后，根據(jù)TRAP染色試劑盒說明書所述（Sigma公 司）對顱骨整體進行TRAP染色，于37攝氏度染色2小時，實驗結(jié)果見圖7a ;同時，顱骨樣 品由上海腫瘤研究所進行micro-CT檢測（SKYSCAN公司），實驗結(jié)果見圖7b ;
[0123] 對5月齡的Opg敲除小鼠的左腿與右腿分別注射PBS及LGR4蛋白片段h4 ;將表 達蛋白分別注射于〇pg敲除小鼠的脛骨皮下，連續(xù)注射14天后取小鼠脛骨，經(jīng)4%甲醛固定 24小時后，進行脫鈣包埋切片，具體流程如下：脛骨樣品經(jīng)清水洗滌后用新鮮4%甲醛再固 定6小時，清水洗滌，置0. 5MEDTA (PH8. 0)分別常溫脫鈣7天，后用雙蒸水清洗10次，置PBS 中常溫浸泡3小時，之后進行組織石蠟包埋過程，過程如下：樣品分別置50%、75%、75% (4 攝氏度過夜）、85 %、95 %、95 % (4攝氏度過夜）、100 %、100 %酒精中脫水2小時，后分別置 50%二甲苯（酒精為稀釋溶劑）、100%二甲苯、100%二甲苯中透化2小時，再置融化的石蠟 油中60攝氏度過夜、新鮮蠟油中2小時，樣品包埋；包埋樣品經(jīng)Leica切片機（RM2235)切 成6uM切片后進行TRAP染色，染色具體流程如下：
[0124] 1)切片經(jīng)60攝氏度化臘1小時；
[0125] 2)切片分別經(jīng)100%二甲苯、100%二甲苯、50%二甲苯（酒精為稀釋溶劑）、100% 酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精、雙蒸水、雙蒸水水化，每道流程均處理5分鐘；
[0126] 3)根據(jù)TRAP染色試劑盒說明書所述（Sigma公司）對切片進行TRAP染色，于37 攝氏度染色2小時；
[0127] 4)切片置雙蒸水中終止染色，0. 1%甲基綠中復(fù)染，封片；
[0128] 5)切片于Olympus顯微鏡下采集結(jié)果，利用osteomeasure分析軟件（查爾斯骨計 量公司）進行破骨細胞參數(shù)分析，實驗結(jié)果見圖7c ;同時，脛骨樣品由上海腫瘤研究所進行 micro-CT檢測（SKYSCAN公司），實驗結(jié)果見圖7d。
[0129] 圖7a :抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結(jié)果顯示注射LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶， 即h4,參見表1)能抑制Opg敲除小鼠顱骨中破骨細胞的過度活化，酒紅色信號為破骨細胞。 **Ρ〈0· 01，***Ρ〈0· 001，n = 6。p 值經(jīng) student T-test 檢驗而得，p 值小于 0· 01 定義為 **， P值小于〇. 001定義為***，以示LGR4蛋白片段抑制Opg敲除小鼠體內(nèi)破骨細胞分化有無 顯著性差異；η = 6表示該實驗一組使用了 6只小鼠。
[0130] 圖7b :microCT結(jié)果顯示注射LGR4蛋白片段（LGR4-ECD，即h4,參見表1)能緩解 〇pg小鼠顱骨的骨質(zhì)疏松癥狀，箭頭所示為骨損傷及蛋白片段處理后的修復(fù)區(qū)。*P〈〇. 05， **Ρ〈0· 01，n = 6。p值經(jīng)student T-test檢驗而得，p值小于0· 05定義為*，p值小于0· 01 定義為**，以示LGR4蛋白片段緩解Opg敲除小鼠骨質(zhì)丟失有無顯著性差異；η = 6表示該 實驗一組使用了 6只小鼠。
[0131] 圖7c :抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結(jié)果顯示注射LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶， 即h4,參見表1)能抑制Opg敲除小鼠脛骨中破骨細胞的過度活化，酒紅色信號為破骨 細胞。圖7c-l為低倍鏡顯示結(jié)果，圖7c-2為高倍鏡顯示結(jié)果，圖7c-3為數(shù)據(jù)分析圖。 ***Ρ〈0· 001，η = 11。p值經(jīng)student T-test檢驗而得，p值小于0· 001定義為***，以示 LGR4蛋白片段抑制Opg敲除小鼠體內(nèi)破骨細胞分化有無顯著性差異；n= 11表示該實驗一 組使用了 11只小鼠。
[0132] 圖7d :microCT結(jié)果顯示注射LGR4蛋白片段（LGR4-ECD，即h4,參見表1)能緩解 Opg小鼠脛骨的骨質(zhì)疏松癥狀。*P〈〇. 05, η = 11。p值經(jīng)student T-test檢驗而得，p值 小于〇. 05定義為*，以示LGR4蛋白片段緩解Opg敲除小鼠骨質(zhì)丟失有無顯著性差異；η = 11表示該實驗一組使用了 11只小鼠。
[0133] 根據(jù)實驗結(jié)果可見，本發(fā)明所述蛋白片段能夠緩解骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)減少，能夠 抑制破骨細胞的過度活化，能夠抑制由于〇pg敲除引起的破骨細胞過度活化，并治療由于 〇pg敲除引起破骨細胞過度活化而導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥。
[0134] 實施例八：LGR4蛋白片段體外抑制骨巨細胞瘤患者中巨細胞活化
[0135] 于患者原代分離的骨巨細胞瘤中加入濃度梯度的LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶，即 h4,參見表1 ;100ng/ml、500ng/ml、2000ng/ml)處理細胞，經(jīng)4天處理后，根據(jù)TRAP染色試 劑盒說明書所述（Sigma公司）進行TRAP染色并計數(shù)統(tǒng)計細胞分化情況。實驗結(jié)果見圖8。
[0136] 圖8a :抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結(jié)果圖，酒紅色巨細胞為破骨細胞；該結(jié) 果表明LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能抑制骨巨細胞瘤原代細胞中破骨細胞的分化。圖8b 顯示LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)抑制骨巨細胞瘤原代細胞中破骨細胞分化的計量數(shù)據(jù)分析 圖，其中*p〈〇. 05，**p〈0. 01，n = 3。p值經(jīng)student T-test檢驗而得，p值小于0. 05定義 為*，P值小于〇. 01定義為**，以示LGR4蛋白片段抑制骨巨細胞瘤中破骨細胞分化有無顯 著性差異；η = 3表示該實驗一組設(shè)計了 3個重復(fù)孔。
[0137] 根據(jù)實驗結(jié)果可見，本發(fā)明所述蛋白片段能夠抑制骨巨細胞瘤，能夠抑制骨巨細 胞瘤中破骨細胞的活性，從而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。
【主權(quán)項】
1. 一種具有LGR4蛋白質(zhì)胞外段結(jié)構(gòu)的蛋白片段，其特征在于，所述蛋白片段的序列是 具有如下所示的序列： (1) 如SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列； (2) 與SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列具有至少90%同一性且具有相同功能的蛋白； (3) 在SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列發(fā)生一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加、但具有相同功能的蛋白； (4) 在SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列的編碼序列的基礎(chǔ)之上經(jīng)過一至數(shù)個堿基替換和 /或一至數(shù)個堿基的插入和/或缺失、以及大片段的核苷酸序列插入、缺失、移位、或倒位 后，所表達的且具有相同功能的蛋白片段；或 (5) 在中度嚴格條件下能夠與SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列的編碼序列雜交且編碼得 到的具有相同功能的蛋白片段。2. 編碼如權(quán)利要求1所述蛋白片段的編碼序列或其簡并序列。3. 權(quán)利要求1所述的蛋白片段或權(quán)利要求2所述序列所編碼的蛋白片段在制備治療破 骨細胞誘導(dǎo)的骨病的藥物中的用途。4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述蛋白片段能抑制成骨細胞誘導(dǎo)的破骨 細胞分化，或能抑制由RANKL過度刺激所引起的體內(nèi)骨質(zhì)減少，或能緩解由于骨質(zhì)疏松引 起的骨質(zhì)減少，或能抑制骨巨瘤中的破骨細胞活性。5. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述藥物包括抑制破骨細胞引起的骨質(zhì)疏 松癥的藥物、或抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的藥物。6. 如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述抑制破骨細胞引起的骨質(zhì)疏松癥的藥 物是用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、腫瘤轉(zhuǎn)移引起的骨組織吸收過多所致的骨質(zhì)疏松 癥的藥物；所述抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的藥物是抑制骨巨瘤或骨巨細胞瘤的藥物，優(yōu)選包括 制備治療骨原發(fā)的良性侵襲性腫瘤的藥物。7. 如權(quán)利要求3-6之任一項所述的用途，其特征在于，所述藥物還包括藥學(xué)上可接受 的鹽、載體或輔料成分，和/或所述藥物與其他藥物活性成分聯(lián)合制備的藥物。8. 權(quán)利要求1所述的蛋白片段或權(quán)利要求2所述序列所編碼的蛋白片段在制備用于在 體外或體內(nèi)抑制破骨細胞分化的藥物中的用途。9. 如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述蛋白片段用于制備在體外或體內(nèi)抑 制成骨細胞誘導(dǎo)的破骨細胞分化的藥物；或，所述蛋白片段用于制備在體外或體內(nèi)抑制由 RANKL過度刺激所引起的體內(nèi)骨質(zhì)減少的藥物；或，所述蛋白片段用于制備在體外或體內(nèi) 緩解由于骨質(zhì)疏松癥引起的骨質(zhì)減少的藥物；或，所述蛋白片段用于制備在體外或體內(nèi)抑 制骨巨瘤中破骨細胞活性的藥物。10. 如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述蛋白片段用于篩選抑制或緩解上述疾 病或癥狀的藥物的用途。
【文檔編號】A61P35/04GK105985426SQ201510094956
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月3日
【發(fā)明人】羅劍, 楊正峰, 劉明耀
【申請人】華東師范大學(xué)