可優(yōu)化病毒復(fù)制的培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及可優(yōu)化病毒復(fù)制的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中含有濃度為100-1000nM的融合蛋白E，所述細(xì)胞系為過表達(dá)融合蛋白E基因的宿主細(xì)胞系。本發(fā)明提供的融合蛋白E，可提高多種病毒TCID50效價1-3個lg單位，HA效價2-4個lg2單位，包括冠狀病毒、副粘病毒、正粘病毒、呼腸孤病毒以及皰疹病毒等，且在使用劑量內(nèi)無細(xì)胞毒性，突破了DNA病毒與RNA病毒之間的界限，以及病毒有無囊膜的界限。通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的融合蛋白E表達(dá)效率較高，且易于純化，一步純化效率可達(dá)85％以上，蛋白終濃度可達(dá)3mg/ml。通過將融合蛋白E直接加入病毒培養(yǎng)基中，可提升多種病毒疫苗滴度效價，簡便快捷，本發(fā)明在病毒學(xué)科的產(chǎn)、學(xué)、研諸多方面均具有重大的影響和意義。
【專利說明】
可優(yōu)化病毒復(fù)制的培養(yǎng)基
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及全病毒疫苗制備領(lǐng)域，具體地說，涉及一種可優(yōu)化病毒復(fù)制的培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 全病毒疫苗（包括弱毒苗與滅活苗）在現(xiàn)代疫苗應(yīng)用中占據(jù)相當(dāng)大的比重。全病 毒疫苗又被稱為常規(guī)疫苗，包括滅活疫苗與減毒活疫苗。其中，人類疫苗包括腮腺炎減毒活 苗、乙腦減毒苗、甲肝減毒活疫苗、狂犬弱毒苗、手足口病滅活苗、輪狀病毒滅活苗、甲型肝 炎滅活苗、乙腦滅活苗等。動物疫苗的使用更為普遍，同時考慮到成本與給藥方便，一般常 制備成多聯(lián)苗，最典型的就是犬五聯(lián)苗，即犬瘟熱、狂犬病、犬細(xì)小病毒、犬傳染性肝炎、犬 副流感五種病毒弱毒的細(xì)胞培養(yǎng)凍干苗（30元/支）。然而實(shí)際研發(fā)過程中，最常遇到苗毒 效價低的問題，導(dǎo)致疫苗的成本居高不下。此外，非全病毒疫苗的療效也并不令人滿意，有 時采用亞單位疫苗或基因工程疫苗免疫后，仍無法控制疾病的發(fā)生發(fā)展，加之許多新發(fā)病 的病原致病機(jī)理不甚清楚，因此最直接有效的方法就是同時免疫弱毒疫苗或滅活苗，可獲 得穩(wěn)定可靠的免疫效果。這些現(xiàn)狀促使研究者持續(xù)重視開發(fā)減毒活疫苗或滅活苗，并認(rèn)為 如果不存在嚴(yán)重不良反應(yīng)，全病毒疫苗仍為首選，當(dāng)然，考慮到致病表型逆轉(zhuǎn)的風(fēng)險，對其 安全性的要求更加嚴(yán)格。
[0003] 此外，許多病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常遇到的技術(shù)瓶頸是，很多病毒（如腸道病毒以及某 些新發(fā)現(xiàn)病毒）很難甚至根本無法在常用細(xì)胞系內(nèi)增殖，以至于很多病毒學(xué)試驗(yàn)無法跟 進(jìn)，也因此直接影響后續(xù)研究。因此，如何不通過遺傳改造法，提高病毒復(fù)制力，是病毒學(xué)科 領(lǐng)域面臨的重大挑戰(zhàn)之一。
[0004] 目前全病毒疫苗制備領(lǐng)域也面臨相似的難題，很多疫苗用毒株效價不高，這直接 影響著疫苗的效果與價格。國內(nèi)外一些研究小組嘗試在病毒培養(yǎng)過程中通過多次換液以降 低細(xì)胞對病毒的防御影響（如干擾素濃度）；還有研究者嘗試將不同細(xì)胞系的貼壁細(xì)胞改 良成懸浮細(xì)胞，以通過增加單位體積的細(xì)胞密度，提升細(xì)胞增殖病毒的效價滴度。這些方案 一定程度上提高了病毒的效價滴度，然而皆屬于外部因素的改造，而且操作繁瑣，并沒有通 過深入了解病毒復(fù)制的宿主因素，從根本上發(fā)現(xiàn)并開發(fā)有利于病毒復(fù)制的可利用細(xì)胞內(nèi)資 源。
[0005] 細(xì)胞核仁蛋白P60，是膠質(zhì)瘤抑癌候選基因2 (Glioma tumor suppressor candidate region gene 2, GLTSCR2)編碼蛋白，可調(diào)節(jié)腫瘤抑制因子P53與PTEN的穩(wěn)定 性，在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，P60擁有"腫瘤抑制因子"及"抑制癌癥的路障"雙重身份。P60獨(dú)特的 生化特性與復(fù)雜功能使之迅速成為科研熱點(diǎn)，但是在病毒學(xué)領(lǐng)域，鮮見文獻(xiàn)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種可優(yōu)化病毒復(fù)制的培養(yǎng)基。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種新型的融合蛋白E，其氨基酸序列如 Seq ID No. 1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的 氨基酸序列。
[0008] 研究發(fā)現(xiàn)，P60蛋白（如Seq ID No. 3所示的氨基酸序列）可提高6科類不同病 毒TCID5。效價2-3個lg單位，包括冠狀病毒（如傳染性支氣管炎病毒）、副粘病毒（如犬 痕熱與新城疫病毒）、正粘病毒（如禽流感病毒）以及皰疹病毒（人單純皰疹病毒-1和馬 立克病毒）。但P60的細(xì)胞毒性限制其直接應(yīng)用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，P60蛋白不同片段的功 能差異顯著。本發(fā)明是在P60蛋白的研究基礎(chǔ)上，通過篩選其關(guān)鍵作用域，構(gòu)建融合蛋白以 制備出穩(wěn)定的可提升多種不同科類病毒苗毒效價滴度的培養(yǎng)基，同時構(gòu)建過表達(dá)所述蛋白 的穩(wěn)定細(xì)胞系。蛋白毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P60全蛋白可誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞毒性較 明顯，而融合蛋白E在100 μ Μ濃度以下對細(xì)胞無毒性作用。
[0009] 應(yīng)當(dāng)注意的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，當(dāng)將本發(fā)明所述的Seq ID No. 1所示的氨基 酸序列中的6個His標(biāo)簽去掉后獲得的蛋白具有與Seq ID No. 1所示的氨基酸序列同等的 生物學(xué)功能，因此同樣屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010] 本發(fā)明還提供編碼所述融合蛋白E的基因，所述基因具如Seq ID No. 2所示的核 苷酸序列。
[0011] 本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白E基因的載體。
[0012] 本發(fā)明融合蛋白E的制備方法包括以下步驟：
[0013] 1)基因克隆：以膠質(zhì)瘤抑癌候選基因2(GenBank:KJ898763. 1)為模板，設(shè)計引物 進(jìn)行目的基因的亞克隆；其中，上游引物：5' -CATATGTCTTTTGAAGACCAC-3'（Seq ID No. 4所 示的氨基酸序列），下游引物：5'-GAATTCTCACAACTGGATCTCACG-3'（Seq ID No. 5所示的氨基 酸序列）；
[0014] 2)載體構(gòu)建：將pET_28a載體用限制性內(nèi)切酶Ndel/EcoRI進(jìn)行雙酶切，將步驟1) 獲得的目的基因同樣用限制性內(nèi)切酶Ndel/EcoRI進(jìn)行雙酶切后與載體連接，得到含有目 的基因的重組載體pET-E ;
[0015] 3)細(xì)胞轉(zhuǎn)化與表達(dá)：用重組載體pET-E轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，37°C搖床培養(yǎng)至0D59。為 0. 8-1. 0,加誘導(dǎo)物IPTG至終濃度lmM，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h獲得誘導(dǎo)后的菌體；
[0016] 4)蛋白純化：誘導(dǎo)后的菌體經(jīng)5000r/min離心15min，超聲裂解菌體后離心取上 清，將上清通過經(jīng)PBS平衡的鎳親和層析柱，再用20mM咪唑洗滌層析柱10個柱體積，然后 用3個柱體積的250mM咪唑洗脫液洗脫，得到含有6個His標(biāo)簽的融合蛋白溶液。然后用截 流分子量為10KD的蛋白超濾管進(jìn)行濃縮，得到純化的融合蛋白E。其中，20mM咪唑的配方 為：50mM NaH2P04, 300mM NaCl，20mM咪唑；250mM咪唑洗脫液的配方為：50mM NaH2P04, 300mM NaCl, 250mM 咪唑。
[0017] 本發(fā)明還提供所述融合蛋白E在制備滅活疫苗和/或減毒活疫苗以及病毒復(fù)制中 的應(yīng)用。
[0018] 前述的應(yīng)用，其是通過在宿主細(xì)胞中過表達(dá)編碼所述融合蛋白E的基因，并用病 毒、滅活疫苗和/或減毒活疫苗生產(chǎn)用毒株接種宿主細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液。
[0019] 前述的應(yīng)用，其是通過向用于制備病毒、滅活疫苗和/或減毒活疫苗的宿主細(xì)胞 培養(yǎng)液，或雞胚培養(yǎng)液中添加融合蛋白E，使宿主細(xì)胞培養(yǎng)液或雞胚培養(yǎng)液中融合蛋白E的 濃度為ΙΟΟ-ΙΟΟΟηΜ，然后接種病毒、滅活疫苗和/或減毒活疫苗生產(chǎn)用毒株，培養(yǎng)后收獲病 毒液。
[0020] 本發(fā)明涉及的病毒、滅活疫苗和/或減毒活疫苗生產(chǎn)用毒株包括但不限于冠狀病 毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、呼腸孤病毒科以及皰疹病毒科。例如，禽流感病毒AIV、傳染 性支氣管炎病毒IBV、犬瘟熱CDV、新城疫病毒NDV、人單純皰疹病毒HSV-1、馬立克病毒MDV、 腸道病毒EV71等。
[0021] 本發(fā)明還提供一種可優(yōu)化病毒復(fù)制的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中含有濃度為 ΙΟΟ-ΙΟΟΟηΜ的融合蛋白E。
[0022] 可選的，所述培養(yǎng)基為含有融合蛋白E的DMEM培養(yǎng)基。例如，所述培養(yǎng)基可以是 將所述融合蛋白E加入含有2-5%血清的DMEM培養(yǎng)基中制備獲得的。
[0023] 本發(fā)明所述的培養(yǎng)基中還可以含有本領(lǐng)域在生產(chǎn)病毒、滅活疫苗和/或減毒活疫 苗時常用的添加物。
[0024] 本發(fā)明還提供一種可優(yōu)化病毒復(fù)制的細(xì)胞系，所述細(xì)胞系為過表達(dá)編碼融合蛋白 E基因的宿主細(xì)胞系。
[0025] 本發(fā)明提供的融合蛋白E，可提高多種病毒TCID5。效價1-3個lg單位，HA效價2-4 個lg 2單位，包括冠狀病毒、副粘病毒、正粘病毒、呼腸孤病毒以及皰疹病毒，且在使用劑量 內(nèi)無細(xì)胞毒性，突破了 DNA與RNA病毒的界限。原核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白表達(dá)效率較高，且易于 純化，純化效率達(dá)85%以上，蛋白終濃度可達(dá)到3mg/ml。通過將融合蛋白E直接加入病毒 培養(yǎng)基中，可提升多種病毒疫苗滴度效價，簡便快捷。根據(jù)每提升疫苗毒1個lg單位，即可 提高利潤1-5千萬/病毒來計算，多種病毒疫苗滴度效價的提升將帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益，且 本發(fā)明在病毒學(xué)科的產(chǎn)、學(xué)、研等諸多方面均具有重大的影響和意義。
【附圖說明】
[0026] 圖1為P60蛋白預(yù)測分析的三級結(jié)構(gòu)圖；其中，A、B、C與E片段分別是P60蛋白上 的一部分。
[0027] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例4中采用western-blot法檢測宿主細(xì)胞中過表達(dá)的蛋白；其 中，從左至右，未感染ifep-2細(xì)胞、過表達(dá)對照pEGFP-Nl質(zhì)粒后感染病毒，過表達(dá)pEGFP-p60 質(zhì)粒后感染病毒，過表達(dá)對照pEGFP-A質(zhì)粒后感染病毒，過表達(dá)GFP-B質(zhì)粒后感染病毒， 過表達(dá)對照pEGFP-C質(zhì)粒后感染病毒，過表達(dá)pEGFP-E質(zhì)粒后感染病毒；其中，所用質(zhì)粒 10 μ g，過表達(dá)時間為40小時，感染時間為48小時，10個TCID5。。ICP0/ICP8為HSV-1的病 毒蛋白表達(dá)檢測抗體，⑶V-N為⑶V的檢測抗體；可見，C與E片段過表達(dá)顯著有利于病毒 復(fù)制，其中E效果最顯著。
[0028] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中采用western-blot法檢測原核蛋白的表達(dá)結(jié)果；其中， 圖3A從左至右，Vero細(xì)胞感染⑶V，10個TCID 5。，同時加入不同量的融合蛋白Ε(100 μ g， 50 μ g，25 μ g)，2小時后洗細(xì)胞，并換成5% DMEM培養(yǎng)基，48小時后進(jìn)行免疫印跡分析（采 用病毒N抗體），可見融合蛋白E兩個劑量對CDV病毒復(fù)制均有顯著促進(jìn)作用；圖3B，mock， Vero細(xì)胞感染⑶V，10個TCID5。;洗，表示感染細(xì)胞加入50 μ g的融合蛋白E，2小時后用PBS 洗細(xì)胞3次，換成5 % DMEM培養(yǎng)基；不洗，表示病毒感染細(xì)胞1. 5小時后，加入含有50 μ g融 合蛋白E的5% DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，然后進(jìn)行免疫印跡分析，可見不洗效果更 顯著；圖3C，原核表達(dá)且純化的pET-E，可見純度超過85 %，分子量約30kDa ;圖3D從左至 右，Η印-2細(xì)胞感染HSV，10個TCID5。，病毒感染細(xì)胞1. 5小時后，加入含有不同量的融合蛋 白E (100 μ g，50 μ g，25 μ g)的5% DMEM培養(yǎng)基，48小時后進(jìn)行免疫印跡分析（采用兩種病 毒抗體同時檢測，即ICP0/ICP8)，可見融合蛋白E 50yg對HSV病毒復(fù)制促進(jìn)作用顯著，而 25μg效果不明顯；圖3E，從左至右，Vero細(xì)胞感染NDV，10個TCID 5。，病毒感染細(xì)胞1.5小 時后，加入含有不同量的融合蛋白E(100yg，50yg，25yg)的5% DMEM培養(yǎng)基，48小時后 進(jìn)行免疫印跡分析（采用病毒NP抗體），可見融合蛋白E 50 μ g對NDV病毒復(fù)制促進(jìn)作用 顯著，而25yg效果不明顯。本發(fā)明中均采用1H)細(xì)胞瓶，培養(yǎng)液為4-5mL。
[0029] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中Η印-2細(xì)胞過表達(dá)pEGFP-Nl、pEGFP-p60、pEGFP-C、 pEGFP-E質(zhì)粒后感染CDV、MDV、IBV病毒，然后采用RT-PCR法測病毒基因的轉(zhuǎn)錄水平；可見 差異，*p〈0. 05 ;差異顯著，**p〈0. 01，其中E相較于C有顯著優(yōu)勢。
[0030] 圖5A為本發(fā)明實(shí)施例4中采用的細(xì)胞病變法，EV71攻毒量為1個TCID5。，試驗(yàn)時 預(yù)先將42 μ L病毒加入到16mL DMEM中。先將六孔板中液體吸出，再用lmL/孔的DMEM洗 滌細(xì)胞一次，每孔分別加入2mL預(yù)先配好的含病毒DMEM，放入37°C溫箱進(jìn)行培養(yǎng)。2h后換 液，吸出液體后，再加入相應(yīng)含量蛋白E，從a至f分別為0、6、12、24、48、98 μ L，每孔最后分 別加入DMEM至總體積2mL，24h后進(jìn)行鏡下觀察。結(jié)果可見病變率在加入24 μ L蛋白時病變 率提升到71%，在加入48 yL蛋白時病變率提升到83%。右側(cè)3個圖為僅加蛋白的結(jié)果， 可見48 μ L蛋白本身并沒有引起特征性的細(xì)胞病變。
[0031] 圖5Β將Vero細(xì)胞感染CDV，10個TCID50，同時加入不同量的蛋白 E (0, 12, 24, 48 μ L)，感染8小時后PBS洗3遍，加4 %的甲醛固定后，用⑶V小鼠單克隆抗 體（Santa Cruz Biotech，sc_66014)孵育 60min，用 PBS 洗 3 遍，加入 Rhodamine Red-x 標(biāo) 記的山羊抗鼠的二抗（Beyotime，A0277)孵育40min，用PBS洗3遍。在免疫熒光顯微鏡 568nm波長下，通過觀察記錄病毒熒光，進(jìn)行毒力測定。結(jié)果可見病毒感染的細(xì)胞數(shù)量在加 入48 μ L蛋白時顯著增多。右側(cè)3個圖為僅加蛋白的結(jié)果，可見48 μ L蛋白本身并沒有引 起特征性的細(xì)胞病變。
[0032] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例4中采用的細(xì)胞病變法，將蛋白p60-E(50yg/5mL)與對照 (N1)加入不同Μ0Ι的HSV(0. 1、1、10)，感染不同時間后分別收集培養(yǎng)液（圖6A)與細(xì)胞沉 淀（圖6B)，可見蛋白E的加入在感染48h時相差3個Ig值，但是在72h時有縮小趨勢，相 差約2個Ig值。圖6C為加入蛋白24h后收集細(xì)胞沉淀的免疫印跡結(jié)果。圖6D為病毒用 量0. 01M0I，左側(cè)為僅加病毒，右側(cè)為病毒加蛋白E。可見病毒在高稀釋度下，蛋白E的加入 仍可提升1-2個Ig值。
[0033] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例8中采用的蛋白E穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建，將HSV與NDV病 毒感染ifep-2細(xì)胞或穩(wěn)定細(xì)胞系Η印-2E (含有Flag標(biāo)簽），10TCID5。，培養(yǎng)12、24、48小時 后，進(jìn)行免疫印跡分析，所用病毒蛋白抗體分別為HSV-ICP8與NDV-NP?？梢姴煌腥緯r間 下，穩(wěn)定細(xì)胞系培養(yǎng)病毒的復(fù)制力優(yōu)于母體Hep-2細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí) 施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0035] 以下實(shí)施例中使用的AIV病毒毒株為H9N2 ;NDV毒株為F48E9 ;IBV毒株為H52 ; CDV為標(biāo)準(zhǔn)毒株Snyder Hill ;HSV-1為標(biāo)準(zhǔn)毒株F ;MDV毒株為RB1B。
[0036] 以下實(shí)施例中涉及的常規(guī)試驗(yàn)：
[0037] 1、細(xì)胞的制備
[0038] 進(jìn)行!1印-2和￥6仰細(xì)胞傳代時使用含有5%胎牛血清和1001]青鏈霉素的01^1培 養(yǎng)液，維持液用含有2%胎牛血清和100U青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。
[0039] 原代雞胚成纖維（CEF)細(xì)胞：9-10日齡雞胚購自北京梅里亞公司，產(chǎn)品目錄號為 "SPF雞胚"。將9-10日齡雞胚取出后仔細(xì)將頭尾、骨頭與脂肪組織剔除，余下部分用PBS洗 滌3遍后盡量剪成小塊，加0. 25 %胰酶消化30分鐘，PBS洗滌3遍后加入70ml培養(yǎng)液（含 有5%胎牛血清和1001]青鏈霉素的01^1培養(yǎng)液，維持液用含有2%胎牛血清和1001]青鏈 霉素的DMEM培養(yǎng)液），大力沖洗出成纖維細(xì)胞，含有細(xì)胞的培養(yǎng)液過三層紗布，以5ml/瓶 或200 μ 1/24孔板分裝，37°C細(xì)胞培養(yǎng)24小時后（覆蓋率達(dá)80%以上）即可進(jìn)行下一步實(shí) 驗(yàn)。
[0040] 人腸道病毒EV71使用人惡性胚胎橫紋肌肉瘤細(xì)胞RD，其形態(tài)特性為梭型和大的 多核細(xì)胞，貼壁生長，使用10% FBS的DMEM培養(yǎng)，1:2~1:4傳代，3~4天換液1次。
[0041] HSV與NDV感染Η印-2細(xì)胞，AIV感染vero細(xì)胞，CDV、MDV和IBV感染CEF細(xì)胞， EV71感染RD細(xì)胞。此外，細(xì)胞培養(yǎng)液購自北京邁晨公司，產(chǎn)品目錄號為CM15019。
[0042] 2、病毒的增殖
[0043] HSV、NDV、AIV、EV71與CDV細(xì)胞毒的增殖：按照細(xì)胞瓶培養(yǎng)液1/10的量接種病毒 原液，待細(xì)胞病變（如NDV形成大合胞體）達(dá)75% ( -般為48小時）采用反復(fù)凍融法收 獲病毒，即將細(xì)胞瓶放入-20°C凍存2小時后放置室溫至部分融化，此時平搖細(xì)胞瓶使貼 壁細(xì)胞脫壁，再次放入-20°C凍存，如此反復(fù)3次，使病毒從細(xì)胞中釋放出來，分別于-20°C 和-70 °C凍存。
[0044] 細(xì)胞依賴性的MDV病毒的增殖：其增殖與保存不同之處在于，不采用反復(fù)凍融法 收獲病毒，即將液氮保存的病毒放置冰上緩慢融化，然后按照細(xì)胞瓶培養(yǎng)液1/10的量接種 病毒原液，待細(xì)胞病變達(dá)75 %時（一般為48~72小時），0. 25 %胰酶消化使貼壁細(xì)胞脫壁， 再次放入液氮中凍存。
[0045] NDV雞胚毒的增殖：9-10日齡雞胚經(jīng)尿囊腔接種NDV病毒原液，雞胚死亡后收集尿 囊液測定血凝效價，觀察雞胚病變及記錄死亡時間。結(jié)果，雞胚呈現(xiàn)全身出血性病變。病毒 引致雞胚病變表征為出血，肉眼即可觀察并區(qū)分正常與感染狀況。
[0046] IBV雞胚毒的增殖：9-10日齡雞胚經(jīng)尿囊腔每胚接種104個TCID 5。的病毒原液，接 種雞胚140小時后收集尿囊液，-20°C或_70°C凍存保存，IBV感染雞胚不死亡，但是雞胚明 顯形體較小（侏儒胚）。
[0047] 3、病毒效價滴度的測定方法
[0048] 細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE)為致細(xì)胞病變作用，指病毒對組織培養(yǎng)細(xì)胞 侵染后產(chǎn)生的細(xì)胞變性，利用此種病變效應(yīng)可進(jìn)行病毒定量。病毒感染形成細(xì)胞病變常見 合胞體（即多個細(xì)胞聚集一起形成多核的大細(xì)胞）與噬斑（細(xì)胞脫落形成空斑）兩種。病 變?nèi)诤下蕿椴∽兗?xì)胞占所有細(xì)胞的比率。
[0049] 毒力測定：將細(xì)胞毒倍比稀釋得到細(xì)胞毒懸液，用96孔板培養(yǎng)CEF細(xì)胞至單層，向 各孔中加入細(xì)胞毒懸液50 μ L/孔（包括HSV、NDV、MDV、EV71與AIV)，做12個稀釋度及8 個重復(fù)，于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中放置48小時后觀察細(xì)胞病變，或記錄病變?nèi)诤下剩ú∽?融合率即病變細(xì)胞占所有細(xì)胞的比率），重復(fù)3次。間接免疫熒光：將攻毒CDV培養(yǎng)5天的 CFE細(xì)胞培養(yǎng)基吸棄，用PBS洗3遍后，加4%的甲醛固定后，用⑶V小鼠單克隆抗體（Santa Cruz Biotech，sc_66014)孵育 60min，用 PBS 洗 3 遍，加入 Rhodamine Red-x 標(biāo)記的山羊抗 鼠的二抗（Beyotime，A0277)孵育40min，用PBS洗3遍。在免疫熒光顯微鏡568nm波長下， 通過觀察記錄病毒熒光，進(jìn)行毒力測定。
[0050] TCID5。計算方法：制備96孔板單層細(xì)胞，將病毒做系列稀釋，橫向接種單層細(xì)胞 板，每稀釋度重復(fù)3孔，每日觀察細(xì)胞病變，記錄高于50和低于50%病變孔的病毒稀釋度， 計算比距，獲得TCID 5。結(jié)果。計算公式為：（高于50%的病變率-50% V(高于50%病變 率-小于50%病變率）=比距；比距與接近50%病變率的病毒的稀釋度的指數(shù)相加，即得 指數(shù)。例如，比色計算或顯微鏡觀察病毒的TCID 5。在10 7~10 8之間，那么，指數(shù)-8與比距 相加，即獲得新的指數(shù)，就是TCID5。的指數(shù)。
[0051] IBV毒力測定：9-10日齡雞胚經(jīng)尿囊腔接種病毒溶液，10倍比稀釋，測定IBV雞胚 半數(shù)感染量EID5。，計算得出IBV的EID 5Q= 10 6'5/ml。以下實(shí)施例中每只雞胚接種10個EID5。 單位病毒液，接種雞胚72小時后收集尿囊液，觀察雞胚病變。結(jié)果表明，雞胚呈現(xiàn)雞胚形體 變小的病變狀態(tài)（身體主干部分長度約為正常對照雞胚體積的2/3)，考慮到實(shí)際生產(chǎn)中病 毒常高滴度感染的狀況，此后實(shí)驗(yàn)皆采用此病毒稀釋度。
[0052] 血凝（HA)試驗(yàn)：NDV與AIV病毒或病毒的血凝素，能夠選擇性地使某種或某幾種 動物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這種凝集紅細(xì)胞的現(xiàn)象稱為血凝反應(yīng)，利用這種特性設(shè)計的試驗(yàn) 稱血凝試驗(yàn)（HA)。在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，自左至右各孔加50 μ L生理鹽水，于左側(cè)第 1孔加50 μ L病毒液（尿囊液或感染細(xì)胞凍融液），混合均勻后，吸50 μ L至第2孔，依次倍 比稀釋至第11孔，吸棄50 μ L ;第12孔為紅細(xì)胞對照。自右至左依次向各孔加入0. 5 %雞紅 細(xì)胞懸液50 μ L，在振蕩器上振蕩，室溫下靜置后lOmin開始觀察結(jié)果，待對照孔紅細(xì)胞已 沉淀即可進(jìn)行結(jié)果觀察。紅細(xì)胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網(wǎng)狀，即為100%凝集（++++)， 不凝集（-)紅細(xì)胞沉于孔底呈點(diǎn)狀。以100%凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價，即為 一個凝集單位。
[0053] 實(shí)施例1幾種病毒的細(xì)胞半數(shù)感染量與雞胚半數(shù)感染量
[0054] HSV與NDV感染!fep-2細(xì)胞，AIV感染vero細(xì)胞。CDV、MDV和IBV感染CEF細(xì)胞。 EV71感染RD細(xì)胞。
[0055] 取9-10日齡SPF雞胚制備雞胚成纖維細(xì)胞（CEF)，將CDV、MDV和IBV接種到CEF 上培養(yǎng)48h，收獲細(xì)胞和培養(yǎng)上清反復(fù)凍融3次，再次接種到CEF細(xì)胞上繼續(xù)培養(yǎng)，如此傳代 至3代。將病毒液10倍比稀釋，接種細(xì)胞96孔板或雞胚。病毒測細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID 5。)， 其中MDV用細(xì)胞病變痘斑的形成測TCID5。，此外IBV用雞胚半數(shù)感染量EID 5。，確定病毒的毒 力。
[0056] 計算得出 NDV 的 TCID5〇= 2X 10 9/ml，HSV-l 的 TCID5〇= 10 s.Vml，CDV 的 TCID50 = TCID5〇= 10 5.3S/ml，MDV 的 TCID5〇= 10 4.7〇/ml，EV71 的 TCID5〇= 10 2.5/ml，AIV 的 TCID50 = l(f4/ml。本實(shí)施例中采用的各種病毒均為10TCID5。，僅EV71為1個TCID 5。。
[0057] 實(shí)施例2蛋白A、B、C、E的過表達(dá)
[0058] 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：待CEF、Hep-2或Vero細(xì)胞的細(xì)胞密度達(dá)到80%，按照lipofectamine 2000說明書，將真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-E及載體pEGFP-Nl分別轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞，每種質(zhì)粒均 10 μ g，過表達(dá)40h。
[0059] pEGFP-E質(zhì)粒的構(gòu)建方法為：以膠質(zhì)瘤抑癌候選基因2為模板，設(shè)計上、下游 引物，分別為5' -GAATTCTTTGAAGACCACCAG-3 (Seq ID No. 6所示的核苷酸序列）'和 5' -GGATCCTCACAACTGGATCTC-3'（Seq ID No. 7 所示的核苷酸序列），進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分別加上酶切位點(diǎn)EcoRI與BamHI ;同時選用可穩(wěn)定表達(dá)GFP的載體pEGFP-Nl，在 EGFP上游選擇酶切位點(diǎn)EcoRI與BamHI。將蛋白E編碼基因與載體分別雙酶切后連接，構(gòu) 建得到pEGFP-E質(zhì)粒（如圖2所示）。
[0060] 病毒接種：轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別感染病毒，每種病毒均l〇TCID5。，培養(yǎng)不同時間。
[0061] 質(zhì)粒 pEGFP-A、pEGFP-B、pEGFP-C 的構(gòu)建方法同 pEGFP-E。
[0062] 其中，蛋白A、B、C、E分別對應(yīng)于P60蛋白第1-60位氨基酸、第70-120位氨基酸、 第130-230位氨基酸、第250-478位氨基酸（如圖1所示）。P60蛋白的氨基酸序列如Seq ID No. 3 所示。
[0063] 實(shí)施例3融合蛋白E基因的原核表達(dá)及純化
[0064] 1)基因克?。阂阅z質(zhì)瘤抑癌候選基因 2為模板，設(shè)計引物進(jìn)行目的基因的亞克隆。 其中，
[0065] 上游引物：5' -CATATGTCTTTTGAAGACCAC-3'，
[0066] 下游引物：5' -GAATTCTCACAACTGGATCTCACG-3'。
[0067] 2)載體構(gòu)建：將pET_28a載體用限制性內(nèi)切酶Ndel/EcoRI酶切，將1)中獲得的 目的基因同樣雙酶切后與載體連接，得到含有目的基因的重組載體pET-E。進(jìn)行酶切和測序 驗(yàn)證，證明重組載體中目的基因的插入方向和插入序列均正確。常規(guī)方法構(gòu)建的pET-E原 核表達(dá)質(zhì)粒中，目標(biāo)蛋白末端加終止密碼子tga序列，酶切位點(diǎn)Ndel與EcoRI。
[0068] 3)細(xì)胞轉(zhuǎn)化與表達(dá)：將陽性重組載體pET-E轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，37°C搖振培養(yǎng)至0D59。 為0. 8-1. 0,加誘導(dǎo)物IPTG至終濃度lmM，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h。
[0069] 4)蛋白純化：誘導(dǎo)后的菌體經(jīng)5000r/min離心15min，超聲裂解菌體后離心取上 清，將上清通過經(jīng)PBS平衡的鎳親和層析柱，再用20mM咪唑洗滌層析柱10個柱體積，然后 用3個柱體積的250mM咪唑洗脫液洗脫，得到含有6個His標(biāo)簽的融合蛋白溶液。然后用 截流分子量為10kDa的蛋白超濾管進(jìn)行濃縮，得到純化的融合蛋白E，終濃度為3mg/mL。其 中，20mM咪唑的配方為：50mM NaH2P04, 300mM NaCl，20mM咪唑；250mM咪唑洗脫液的配方為： 50mM NaH2P04, 300mM NaCl, 250mM 咪唑。
[0070] 病毒接種：轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別感染病毒，每種病毒均10TCID5。，培養(yǎng)不同時間。
[0071] 實(shí)施例4免疫印跡法、細(xì)胞病變法與RT-PCR法研究融合蛋白E對病毒毒力的影響
[0072] 免疫印跡：利用實(shí)施例2與3中過表達(dá)或原核表達(dá)純化蛋白處理，感染的細(xì)胞用預(yù) 冷的pH7. 5 PBS洗滌3遍后，刮下細(xì)胞，超聲裂解提取細(xì)胞總蛋白3-5秒后，與6XSDS-PAGE 上樣緩沖液混合，煮沸l(wèi)〇min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后將凝膠上的蛋白通過電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn) 移到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液室溫封閉lh，加一抗4°C搖動孵育2h。用 PBST洗膜4次，每次5min，1 :8000稀釋HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫?fù)u動孵育lh，洗膜4次， 每次 5min，最后用 SuperSignal West Pico Chemilumineseent HRP Substrate ECL 顯色， 并用柯達(dá)醫(yī)用膠片爆光，最后顯影定影進(jìn)行觀察。其中病毒蛋白抗體均購自圣克魯斯生物 技術(shù)公司（Santa Cruz Biotechnology)。含 Rhodamine Red_x 焚光山羊抗小鼠 lgG 二抗 與其他二抗均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。所用病毒蛋白抗體，包括ICP8、ICP0、 NDV-NP、⑶V-N抗體以及actin抗體，均為1:1000稀釋。可見過表達(dá)則可優(yōu)化病毒的復(fù)制。 過表達(dá)試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，原核蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。
[0073] 用實(shí)施例3中原核表達(dá)純化蛋白處理細(xì)胞，并分別收集感染病毒的細(xì)胞樣品， 其中MDV用0. 25 %的胰酶消化，其他病毒感染細(xì)胞采用反復(fù)凍融法收獲病毒，即將細(xì)胞 瓶放入_20°C凍存2小時后放置室溫至部分融化，此時平搖細(xì)胞瓶使貼壁細(xì)胞脫壁，再次 放入-20°C凍存，如此反復(fù)3次，使病毒從細(xì)胞中釋放出來。所有樣品如果暫時不用，需 在_70°C或液氮中凍存。然后進(jìn)行以下細(xì)胞病變分析實(shí)驗(yàn)。
[0074] 實(shí)時定量RT-PCR :分別收集實(shí)施例2中過表達(dá)后感染的細(xì)胞樣品，按照Trizol 裂解液說明書提取總RNA。用特異性下游引物作為反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行cDNA的合成。用SYBR Green I染料法進(jìn)行實(shí)時定量PCR擴(kuò)增。20yL總反應(yīng)體系：10yL 2XSYBR Green I PCR mix，上、下游引物各 0·4μL(10μΜ)，補(bǔ)水至總體積 20yL。Real-Time PCR System(ViiA 7)設(shè)定反應(yīng)程序：95°C預(yù)變性5min ;變性95°C 10s，60°C退火和延伸45s，設(shè)定40個循環(huán)， 最后進(jìn)行熔解曲線分析。采取2 AACT，對目標(biāo)基因進(jìn)行相對定量，β-actin選為內(nèi)參基因。 細(xì)胞接種病毒并轉(zhuǎn)染融合蛋白E基因，在接毒后不同時間收細(xì)胞，提取細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn) 錄成cDNA，采用SYBR Green I染料在ViiAA 7熒光定量PCR儀上進(jìn)行qPCR檢測，用2 ΔΔετ 法計算不同處理組間病毒mRNA表達(dá)水平的差異。用GraphPad prism5進(jìn)行繪圖。將每個 時間點(diǎn)的N1處理都標(biāo)準(zhǔn)化為1，可見差異明顯。結(jié)果如圖4所示。
[0075] 引物的設(shè)計：根據(jù)GenBank中已發(fā)表的病毒蛋白基因序列，如⑶V-N蛋白、MDV-meq 蛋白、IBV-N蛋白序列，采用分子生物學(xué)軟件DNAStar進(jìn)行核苷酸同源性分析，選擇病毒復(fù) 制相關(guān)的基因保守序列作為PCR擴(kuò)增的靶序列。遵循熒光PCR引物設(shè)計原則，用Primer 5. 0 軟件分別設(shè)計引物（表1引物序列信息）。
[0076] 表 1
[0077]
[0078] 細(xì)胞病變分析：將HSV與NDV感染的Η印-2細(xì)胞，AIV感染vero細(xì)胞，EV71感染 RD細(xì)胞、MDV感染CEF細(xì)胞的樣品，進(jìn)行倍比稀釋得到細(xì)胞毒懸液，用96孔板培養(yǎng)CEF細(xì)胞 至單層，向各孔中加入細(xì)胞毒懸液50 μ L/孔（包括HSV、NDV、EV71、MDV與AIV)，做12個稀 釋度及8個重復(fù)，于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中放置48小時后觀察細(xì)胞病變，并計算TCID 5。（形 成細(xì)胞病變的病毒滴度），重復(fù)3次。此外，免疫熒光分析：CDV感染的CFE細(xì)胞培養(yǎng)基吸 棄，用PBS洗3遍后，加4 %的甲醛固定后，用⑶V小鼠單克隆抗體孵育60min，用PBS洗3 遍，加入Rhodamine Red-x標(biāo)記的山羊抗鼠的二抗孵育40min，用PBS洗3遍。在免疫焚光 顯微鏡568nm波長下，通過觀察記錄病毒熒光，以進(jìn)行毒力測定并計算TCID 5。。可見融合蛋 白E與陰性對照（載體pEGFP-Nl)差別在1-3個lg之間，差異明顯。結(jié)果見表2(不同病 毒處理與未處理E后的TCID 5。比較），其中一代表僅加病毒，E代表感染細(xì)胞加入融合蛋白 E (終濃度為1 μ g/mL)。EV71與⑶V的病變結(jié)果如圖5所示，HSV-1不同感染時間的病毒滴 度結(jié)果如圖6所不。
[0079] 表 2
[0080]
[0081 ] 實(shí)施例5血凝試驗(yàn)研究蛋白E對病毒毒力的影響
[0082] 將NDV病毒感染Vero細(xì)胞（10TCIDM)，96孔板；不洗滌，即病毒感染細(xì)胞1. 5小時 后，PBS洗細(xì)胞3次，換上含有融合蛋白E的5% DMEM培養(yǎng)液150 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)48小時；洗 滌，即感染細(xì)胞同時加各蛋白，2小時后用PBS洗細(xì)胞3次，更換成5% DMEM培養(yǎng)基150 μ L， 繼續(xù)培養(yǎng)48小時；-20°C冰箱反復(fù)凍融3次，測培養(yǎng)液上清的HA。其中，蛋白加入10 μ g， 5 μ g，2. 5 μ g，1 μ g，0. 5 μ g，作用48小時后，可見不洗滌組0. 5-5 μ g之間的融合蛋白E對 病毒復(fù)制促進(jìn)效果最好，表明蛋白E可以直接加入培養(yǎng)基到收毒，這使應(yīng)用更為簡便（表 3NDV的血凝（HA)試驗(yàn)結(jié)果）。表3中C、A分別表示C與A蛋白，可見這兩種蛋白的促病毒 復(fù)制活性有限。
[0083] 表 3
[0084]
[0085] 將AIV病毒感染Vero細(xì)胞（10TCID5。，或1M0I)，96孔板，感染細(xì)胞1.5小時后， PBS洗細(xì)胞3次，更換成含有E蛋白（10yg，5yg，2.5yg，lyg，0.5yg)的5%DMEM培養(yǎng) 液150 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)72小時后直接收集上清進(jìn)行HA試驗(yàn)，其中，DMEM培養(yǎng)液中分別加入融 合蛋白Ε :?？梢?-5 μ g之間的融合蛋白Ε對病毒ΗΑ效價影響約3個數(shù)量級。結(jié)果見表 4, AIV的血凝（HA)試驗(yàn)結(jié)果。血凝試驗(yàn)皆為平行試驗(yàn)3次的平均結(jié)果。
[0086] 表 4
[0087]
[0088] 實(shí)施例6雞胚實(shí)驗(yàn)研究融合蛋白E對病毒毒力的影響
[0089] 雞胚接種IBV病毒（10個EIDJ，NDV與AIV為10TCID5。，并添加融合蛋白E 200 μ g，100 μ g，50 μ g，濃度為lmg/mL，48-96小時后收集尿囊液，同時觀察雞胚病變。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，融合蛋白E用量為100yg時，雞胚可存活120小時以上，但濃度超過150yg時，對 雞胚毒性明顯，雞胚僅能存活24小時；雞胚加入致死性病毒（NDV與AIV)，融合蛋白E加入 100 μ g時，雞胚僅能存活24小時，加入10 μ g時，雞胚能存活76小時，且HA效價提升23倍； 雞胚加入非致死性病毒（IBV)，融合蛋白E加入10 μ g時，雞胚能存活76小時以上，加融合 蛋白E的雞胚侏儒病變更明顯。
[0090] 實(shí)施例7融合蛋白E的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
[0091] 采用lactate dehydrogenase (LDH)實(shí)驗(yàn)研究多肽或蛋白對細(xì)胞是否有毒性，利用 購自Roche公司的毒性檢測試劑盒完成。向培養(yǎng)至單層的CEF細(xì)胞中分別加入以下終濃度 的融合蛋白 Ε :5 μΜ、25 μΜ、50 μΜ、100 μΜ、250 μΜ、500 μΜ、1· OmM，并輕輕混合均勻，24 小 時后按照試劑盒說明書測定毒性指數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果顯示，融合蛋白E在100μΜ濃 度及以下對細(xì)胞均無毒性作用。
[0092] 實(shí)施例8蛋白Ε穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建與驗(yàn)證
[0093] 1、載體準(zhǔn)備與重組慢病毒的產(chǎn)生
[0094] 1)基因片段（flag標(biāo)簽+Ε基因）亞克隆入商業(yè)化的慢病毒載體Lenti-Puro ;2) 將下述Tubel與Tube2的混合物加入培養(yǎng)的HEK-293T細(xì)胞中。輕輕地反復(fù)混勻之后在37°C 下孵化。Tubel :慢病毒表達(dá)載體、gag/pol載體、VSVG載體，三者的混合物；Tube2 :聚醚酰 亞胺；3)轉(zhuǎn)染6h后，用完全生長液取代轉(zhuǎn)染時的培養(yǎng)液，37°C孵育48h ;4)轉(zhuǎn)染24h后，收 集含有重組病毒的培養(yǎng)液，將其儲存于制冷的條件下；5)轉(zhuǎn)染48h后收集病毒培養(yǎng)液，并用 0. 45 μπι過濾器過濾；6)將過濾的上清液裝入貝克曼清除管中，并用PBS平衡，19400r，4°C 離心90min ;7)將上清液倒入含有10%漂白劑的容器中，用500 μ 1PBS重懸病毒，并且放于 冰上過夜。
[0095] 2、重組細(xì)胞的選擇（用嘌呤霉素去除非重組細(xì)胞）
[0096] 為了能產(chǎn)生充分轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞群，滴定實(shí)驗(yàn)旨在檢測挑選72h后能殺死100%未轉(zhuǎn) 導(dǎo)Η印-2細(xì)胞的嘌呤霉素的最小濃度。l)!fep-2細(xì)胞接種于24孔板上，lxlO 5/孔，5% C02， 37°C過夜培養(yǎng)；2)準(zhǔn)備培養(yǎng)液，其中嘌呤霉素的濃度依次是0、0. 25、0. 5、1、2、4、6、8、10、 12μg/ml ;3)用含嘌呤霉素的培養(yǎng)液取代舊的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，而且每隔一天用新鮮的 選擇性培養(yǎng)液進(jìn)行換液；4)用能在72h將所有細(xì)胞殺死的最低濃度的嘌呤霉素來挑選轉(zhuǎn)導(dǎo) 的細(xì)胞。
[0097] 3、重組慢病毒在Η印-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)
[0098] 1)轉(zhuǎn)導(dǎo)前12h，用完全生長培養(yǎng)基于24孔板上培養(yǎng)Η印-2細(xì)胞；2)加入5個Μ0Ι 的重組慢病毒，在聚凝胺（4μg/ml)條件下，孵育24h ;3)用新鮮的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h ;4) 換液，用含〇. 5 μ g/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基，挑選4天直到未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞被全部殺死；5) -次 或兩次篩選后，將死細(xì)胞移除，收集穩(wěn)定存在的轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。
[0099] 功能驗(yàn)證：將HSV與NDV病毒感染Η印-2細(xì)胞或穩(wěn)定細(xì)胞系Η印-2E (含有Flag標(biāo) 簽），10TCID5。，培養(yǎng)12, 24, 48小時，用預(yù)冷的pH7. 5PBS洗滌3遍后，刮下細(xì)胞，超聲裂解提 取細(xì)胞總蛋白3-5秒后，與6XSDS-PAGE上樣緩沖液混合，煮沸l(wèi)Omin，進(jìn)行免疫印跡分析， 所用病毒蛋白抗體分別為HSV-ICP8與NDV-NP?？梢姴煌腥緯r間下，穩(wěn)定細(xì)胞系培養(yǎng)病毒 的復(fù)制力優(yōu)于母體Hep-2細(xì)胞。結(jié)果如圖7所示。
[0100] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 融合蛋白E，其特征在于，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失 或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2. 編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白E的基因。3. 含有權(quán)利要求2所述基因的載體。4. 權(quán)利要求1所述融合蛋白E的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 基因克?。阂阅z質(zhì)瘤抑癌候選基因2為模板，設(shè)計引物進(jìn)行目的基因的亞克?。黄?中， 上游引物：5' -CATATGTCTTTTGAAGACCAC-3'， 下游引物：5'-GAATTCTCACAACTGGATCTCACG-3' ； 2) 載體構(gòu)建：將pET-28載體用限制性內(nèi)切酶Ndel/EcoRI進(jìn)行雙酶切，將步驟1)獲得 的目的基因同樣用限制性內(nèi)切酶Ndel/EcoRI進(jìn)行雙酶切后與載體連接，得到含有目的基 因的重組載體pET-E ; 3) 細(xì)胞轉(zhuǎn)化與表達(dá)：用重組載體pET-E轉(zhuǎn)化BL21，37°C搖床培養(yǎng)至0D59。為0. 8-1. 0,加 誘導(dǎo)物IPTG至終濃度ImM，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h獲得誘導(dǎo)后的菌體； 4) 蛋白純化：誘導(dǎo)后的菌體經(jīng)5000r/min離心15min，超聲裂解菌體后離心取上清，將 上清通過經(jīng)PBS平衡的鎳親和層析柱，再用20mM咪唑洗滌層析柱10個柱體積，然后用3個 柱體積的250mM咪唑洗脫液洗脫，得到含有6個Hi s標(biāo)簽的融合蛋白溶液。然后用截流分 子量為10KD的蛋白超濾管進(jìn)行濃縮，得到純化的融合蛋白E。5. 權(quán)利要求1所述融合蛋白E在制備滅活疫苗和/或減毒活疫苗以及病毒復(fù)制中的應(yīng) 用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，在宿主細(xì)胞中過表達(dá)編碼權(quán)利要求1所述 融合蛋白E的基因，并用病毒、滅活疫苗和/或減毒活疫苗毒株接種宿主細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞，收 獲病毒液。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，向用于制備病毒、滅活疫苗和/或減毒活 疫苗的宿主細(xì)胞培養(yǎng)液或雞胚培養(yǎng)液中添加融合蛋白E，使宿主細(xì)胞培養(yǎng)液或雞胚培養(yǎng)液 中融合蛋白E的濃度為ΙΟΟ-ΙΟΟΟηΜ，然后接種病毒、滅活疫苗和/或減毒活疫苗生產(chǎn)用毒 株，培養(yǎng)后收獲病毒液。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述病毒、滅活疫苗和/或減毒活疫 苗生產(chǎn)用毒株包括冠狀病毒科、副粘病毒科、正粘病毒科、呼腸孤病毒科以及皰疹病毒科。9. 一種可優(yōu)化病毒復(fù)制的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中含有濃度為ΙΟΟ-ΙΟΟΟηΜ 的權(quán)利要求1所述融合蛋白E。10. -種可優(yōu)化病毒復(fù)制的細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系為過表達(dá)權(quán)利要求2所述 基因的宿主細(xì)胞系。
【文檔編號】C12N15/70GK105985446SQ201510080767
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月13日
【發(fā)明人】王曉佳
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學(xué)