賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，所述保護(hù)劑的成分包括蔗糖，海藻糖，乳糖，左旋糖酐，聚乙二醇4000，甘露醇，甘氨酸或其鹽和賴氨酸或其鹽的一種，兩種或多種混合物；所述保護(hù)劑的各成分在酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為0.2％～5％。
【專利說明】
賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種改善賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶穩(wěn)定性的凍干及 貯存保護(hù)劑以及酶溶液保護(hù)劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶（Lysyl Endopeptidase，Lep)，EC3.4.21.50,分子量約為30KD， 屬于絲氨酸蛋白酶家族成員之一，能特異切割肽鏈中賴氨酸殘基或氨乙基半胱氨酸C端的 肽鍵，能顯著提高酶切轉(zhuǎn)化率和純度，故常用于蛋白質(zhì)序列分析中的質(zhì)譜分析和Lys-X的化 合物酶催化合成。目前表達(dá)Lep的野生菌有銅綠假單胞菌，促溶無色桿菌和產(chǎn)酶溶桿菌。產(chǎn) 酶溶桿菌產(chǎn)酶比無色桿菌活性高，本發(fā)明所用菌株為促溶無色桿菌M497-1(ATCC 21456)， 從美國(guó)模式菌種保藏中心購(gòu)得。酶的發(fā)酵和純化步驟參考文獻(xiàn)方法(Masaki T，Tanabe M， Nakamura K，et al. Studies on a new proteolytic enzyme from Achromobacter lyticus M497-1I.Purification and some enzymatic properties[J].Biochimica Et Biophysica Acta，1981，660(1) :44-50)。純化得到Lep之后，對(duì)其凍干處理是長(zhǎng)期保存此酶 的重要方法。但凍干過程牽涉到復(fù)雜的相變過程，在凍結(jié)、凍融干燥、儲(chǔ)存過程中，存在多種 誘導(dǎo)蛋白變性的因素，又因該酶自身的氨基酸序列中含有賴氨酸殘基，因此在凍干和溶液 保存時(shí)，易失活或自身酶切，故需要開發(fā)新的方法以提高其穩(wěn)定性。
[0003] 專利CN102973526A公開人抗凝血酶制劑冷凍干燥過程中的保護(hù)劑，包括使用蔗 糖、賴氨酸、酪氨酸、天冬氨酸的一種進(jìn)行保護(hù)。
[0004] 專利CN101893639A公開了穩(wěn)定血清α-羥丁酸脫氫酶和乳酸脫氫酶活性的方法，使 用了牛血清蛋白、海藻糖(或蔗糖）、甘露醇和甘氨酸作為保護(hù)劑進(jìn)行凍干。
[0005] 盡管添加糖類和氨基酸作為保護(hù)劑用于制備酶制劑已屬公知技術(shù)，但是由于酶結(jié) 構(gòu)組成的千差萬(wàn)別，目前尚沒有一種可以直接套用的保護(hù)劑組成進(jìn)行各種酶的保護(hù)，因此， 針對(duì)具體酶而言為改善其穩(wěn)定性，仍需要大量的試驗(yàn)進(jìn)行保護(hù)劑的篩選。文獻(xiàn)檢索表明：目 前尚沒有已經(jīng)公開一種穩(wěn)定的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶混合物和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，解決賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶在凍干過程中和溶液狀態(tài)保 存時(shí)的自身酶解問題，最大程度地提高酶的穩(wěn)定性，滿足長(zhǎng)期貯存的需要。
[0007] 本發(fā)明提供了一種賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，所述保護(hù)劑的成分包括 蔗糖，海藻糖，乳糖，左旋糖酐，聚乙二醇4000，甘露醇，甘氨酸或其鹽和賴氨酸或其鹽的一 種，兩種或多種混合物;所述保護(hù)劑的各成分在酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為〇. 2% ~5% 〇
[0008]其中，優(yōu)選地，所述的保護(hù)劑的pH為4~10。
[0009]其中，優(yōu)選地，所述的保護(hù)劑還包括roS緩沖液、Tris-Hcl緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩 沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液和碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。
[0010]優(yōu)選地，所述的保護(hù)劑選自蔗糖、甘露醇、甘氨酸或其鹽的一種。
[0011]優(yōu)選地，所述的保護(hù)劑pH為5或10。
[0012] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的保護(hù)劑選擇如下混合物，
[0013] 蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0014] 蔗糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；
[0015] 蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0016]蔗糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物；
[0017] 右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；
[0018] 右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；
[0019] 右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0020]右旋糖酐、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物；
[0021 ]乳糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0022]乳糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；
[0023]乳糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0024]乳糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物；
[0025]蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0026] 右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0027] 海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物。
[0028] 優(yōu)選地，所述的混合物的成分在酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為1%。
[0029] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的保護(hù)劑選自如下優(yōu)選地的混合物，
[0030] 乳糖、聚乙二醇和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0031] 蔗糖、聚乙二醇和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0032] 蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0033] 右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物。
[0034]優(yōu)選地，所述的保護(hù)劑pH為5-10。
[0035] 優(yōu)選地，所述的保護(hù)劑選自的混合物，所述由兩種成分組成的混合物中的成分在 酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為〇 .2%，0.5%，1%，2.5%或5 %。
[0036] 其中，優(yōu)選地，所述蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖在酶凍干溶液中的質(zhì)量體 積百分濃度為0.5%，甘氨酸或其鹽在酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為1%;所述右旋 糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐在酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為〇. 5%，甘 氨酸或其鹽在酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為〇. 5%。
[0037] 本發(fā)明還涉及一種賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶的凍干劑，其特征在于，包括如下組分:如上 所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，所述保護(hù)劑成分在酶凍干溶液中的質(zhì)量體積 百分濃度為〇. 2 %~5% ;和賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶，所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶酶凍干溶液中的 質(zhì)量體積百分濃度為〇. 0001 % -〇. 02 %。
[0038] 優(yōu)選地，所述的凍干劑的pH為4~10。
[0039] 另一方面，一種賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶的貯存溶液，包括如下組分：
[0040] 如上所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，所述保護(hù)劑成分在酶凍干溶液 中的質(zhì)量體積百分濃度為0.2%~5% ;
[0041 ]和賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶，所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶在酶貯存溶液中的質(zhì)量體積百分 濃度為0.0001 %-0.02 %。
[0042] 所述的保護(hù)劑選用蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物，所述蔗糖和甘氨酸或其鹽在酶 貯存溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為1 %。
[0043] 上述混合物，是所述物質(zhì)包含兩種或多種成分的組成物。
[0044] 上述的兩種成分組成的混合物，包括但不限于上述的蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合 物，右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物及海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物。
[0045] 上述的酶凍干溶液，是賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶的凍干前的最終溶液。上述的酶貯存溶 液，是賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶貯存時(shí)的溶液。
【附圖說明】
[0046] 圖1是十肽底物在賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶的酶切產(chǎn)物的液相分析。
[0047]其中，底物峰保留時(shí)間為14.3min;酶切底物后，產(chǎn)物1保留時(shí)間分別是6.8min，產(chǎn) 物21保留時(shí)間是3.3min。
【具體實(shí)施方式】
[0048]為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更為明顯易懂，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明 的【具體實(shí)施方式】做詳細(xì)的說明。
[0049] 所述的"包括"表示本發(fā)明的保護(hù)劑除了含有所述成分如蔗糖，海藻糖，乳糖等或 組合物等，還可以包含一些用于調(diào)整保護(hù)劑pH的物質(zhì)，如用于調(diào)整保護(hù)劑pH的緩沖液等。
[0050] 根據(jù)本申請(qǐng)的某些實(shí)施方式，所述保護(hù)劑包括蔗糖，甘氨酸或其鹽，甘露醇等單一 成分，也包括由蔗糖、甘氨酸或其鹽、賴氨酸或其鹽、聚乙二醇4000和右旋糖酐其中三種成 分組成的混合物，及包括由甘氨酸或其鹽、蔗糖、海藻糖和右旋糖苷其中兩種成分組成的混 合物;例如，保護(hù)劑為蔗糖，海藻糖，甘氨酸或其鹽，甘露醇，右旋糖酐，聚乙二醇4000，乳糖， 賴氨酸或其鹽及蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混 合物，蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽 的混合物，右旋糖酐、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽 的混合物，右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐、聚乙二醇4000和 賴氨酸或其鹽的混合物，乳糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物，乳糖、甘露醇和賴氨酸或 其鹽的混合物，乳糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物，乳糖、聚乙二醇4000和賴氨 酸或其鹽的混合物，以及蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合 物，海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物;其中優(yōu)選地，蔗糖，甘露醇，甘氨酸或其鹽，乳糖、聚乙 二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖、聚乙二醇和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖和甘氨 酸或其鹽的混合物，右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物。其中混合物各成分的比例，可由混 合物中的各成分在酶凍干溶液的濃度決定。
[0051] 在本申請(qǐng)的某些實(shí)施方式中，在賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存溶液中，包括上述 的保護(hù)劑，其中保護(hù)劑的成分在酶凍干溶液中的溶度(質(zhì)量體積)為〇.2%~5%，例如0.2% ~1%，0.3%~1%，0.4%~1%，0.5%~1%，0.6%~1%，0.7%~1%，0.8%~1%，0.9% ~1%，0.2%~0.5%，0.3%~0.5%，0.4%~0.5%，0.2%~2.5%，0.3%~2.5%，0.4% ~2·5%，0·5%~2·5%，0·6%~2·5%，0·7%~2·5%，0·8%~2·5%，0·9%~2·5%，1% ~2·5%，1·5%~2·5%，2%~2·5%，0·2%~5%，0·3%~5%，0·4%~5%，0·5%~5%， 0.6%~5%，0.7%~5%，0.8%~5%，0.9%~5%，1%~5%，1.5%~5%，2%~5%， 2.5%~5%，優(yōu)選地0.2%~0.5%，0.5%~1%，0.2%~2.5%，0.5%~2.5%，0.2%~ 5%，1%~2.5%，1%~5%，2.5%~5%。具體實(shí)施時(shí)，采用如上所述的三種成分混合物或 兩種成分的混合物，如蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖、甘露醇和賴氨酸或其 鹽的混合物，蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖、聚乙二醇4000和賴氨酸 或其鹽的混合物，右旋糖酐、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸 或其鹽的混合物，右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸的混合物，右旋糖酐、聚乙二醇4000和 賴氨酸或其鹽的混合物，乳糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物，乳糖、甘露醇和賴氨酸或 其鹽的混合物，乳糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物，乳糖、聚乙二醇4000和賴氨 酸或其鹽的混合物，以及蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合 物，海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物，其涉及成分蔗糖，左旋糖酐，乳糖，聚乙二醇4000，甘 露醇，甘氨酸或其鹽和賴氨酸或其鹽，在酶凍干溶液中的濃度為1 %，又如蔗糖和甘氨酸或 其鹽的混合物，右旋糖酐和甘氨酸的混合物，海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物，所涉及的蔗 糖、甘氨酸或其鹽、右旋糖酐和海藻糖在酶凍干溶液中的濃度為〇 .2%，0.5%，1%，2.5%， 5%〇
[0052] 在某些實(shí)施方式中，在賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑中，在賴氨酰肽鏈內(nèi) 切酶凍干及貯存保護(hù)溶液中，所述的凍干及貯存保護(hù)劑和凍干及貯存保護(hù)溶液的pH為4~ 10,例如5~10,6~10,7~10,8~10,9~10,5~9,5~8,5~7,5~6,6~8,6~7,6~8,6~9， 7~8，7~9，8~9，其優(yōu)選地，pH為5~10。具體實(shí)施時(shí)，通過在賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存 保護(hù)劑中或在賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)溶液中添加 pH緩沖液以調(diào)節(jié)其pH，例如pH 為5-8的roS緩沖液，pH為7-9的巴比妥鈉-鹽酸緩沖液，pH為4-5的乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH為 7-10的Tris-Hcl緩沖液和碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。
[0053] 實(shí)施例中，采用的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)體系如下，
[0054] 在1.5ml EP管加入20μ1十肽底物，再加入60μ1 0.1mol/L的pH9.5Tris緩沖液，震 蕩10s，30°C水浴孵育5min，然后加入4μ1待測(cè)酶液，于30°C水浴反應(yīng)20min后立即加入16μ1 10 % TFA進(jìn)行終止，然后進(jìn)行HPLC分析。
[0055] 十肽底物:N-Tyr-Tyr-Ala-Lys-Tyr-Phe-Gly-Arg-Phe-Phe-C。
[0056] 十肽底物和酶切產(chǎn)物液相分析如圖1所示。
[0057]十肽底物峰保留時(shí)間為14.3min，酶切底物后，產(chǎn)物1保留時(shí)間分別是6.8min，產(chǎn)物 21保留時(shí)間是3.3min。試驗(yàn)中以單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物1的產(chǎn)生量來評(píng)價(jià)酶活。該產(chǎn)物的量可以通 過產(chǎn)物1峰面積進(jìn)行計(jì)算。
[0058] 具體實(shí)施時(shí)，賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶的終濃度為(W/V)為0.0001 %~0.02%。
[0059] 實(shí)施例1
[0060]蔗糖、甘露醇、甘氨酸或其鹽保護(hù)劑分別配制為20%的濃度，并在_20°C保存?zhèn)溆谩?本實(shí)施例采用3種緩沖液濃度，分別為5/20/50mmol/L的PBS緩沖液和Tris-HCl緩沖液，每一 種濃度都包含7個(gè)pH值，PH4/5/6/7/8/9/HLPH值為4/5/6/7時(shí)用roS緩沖液調(diào)節(jié)，pH值為8/ 9/10時(shí)用Tris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)。取84x3只西林瓶，每只西林瓶按表格加 100μΙ的對(duì)應(yīng)保護(hù) 劑，100μΙ的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶溶液，1800μ1對(duì)應(yīng)緩沖液，不加保護(hù)劑的為對(duì)照組，對(duì)照組即 每瓶添加 100μΙ的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶溶液，1900μ1對(duì)應(yīng)緩沖液，然后搖勻，凍干。凍干后，取 出用2ml超純水溶解，按上述酶切反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，然后用液相分析結(jié)果。結(jié)果處理時(shí)，取 凍干前酶活檢測(cè)為100%。單個(gè)保護(hù)劑結(jié)果如表1所示：
[0061]
[0062] 表 1
[0063] 結(jié)果由表1所示，參照表1可知：
[0064] 1)在添加保護(hù)劑蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的凍干溶液及未添加保護(hù)的賴氨酰 肽鏈內(nèi)切酶凍干溶液，未添加保護(hù)劑的凍干酶在pH 4-5下酶活約為凍干酶活的30%，在 PH6-10下，酶活約為凍干酶活的50-70%;在添加保護(hù)劑蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽，凍干 后的酶活約為凍干酶活的50-90%。
[0065] 2)通過比對(duì)蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽作為保護(hù)劑的凍干酶活，蔗糖的凍干保 護(hù)效果最優(yōu)，甘氨酸次之，甘露醇再次。
[0066] 3)通過比對(duì)蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽作為保護(hù)劑的凍干后形態(tài)相比，甘氨酸 或其鹽的凍干后的形態(tài)最優(yōu)，甘露醇次之，蔗糖再次。
[0067] 4)其中，pH 5或10下，凍干酶活較優(yōu)。
[0068] 實(shí)施例2
[0069]在實(shí)施例1基礎(chǔ)上，增加了右旋糖酐，乳糖，聚乙二醇4000，賴氨酸或其鹽這幾種保 護(hù)劑。每種保護(hù)劑依然配制為20%濃度，_20°C保存?zhèn)溆?。?fù)合保護(hù)劑添加方式如上述表格， 根據(jù)實(shí)施例1結(jié)果，緩沖體系優(yōu)選pH5，50mmo 1/LPBS和pHl 0，50mmo 1/LTr i s-HCl。取26x3只西 林瓶，每只西林瓶按表格各加 100μΙ的對(duì)應(yīng)保護(hù)劑，100μΙ的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶溶液，Ι600μ1 對(duì)應(yīng)緩沖液，不加保護(hù)劑的為對(duì)照組，對(duì)照組即每瓶添加1〇〇μ1的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶溶液， 1900μ1對(duì)應(yīng)緩沖液，然后搖勻，凍干。凍干后，取出用2ml超純水溶解，按上述酶切反應(yīng)體系 進(jìn)行反應(yīng)，然后用液相分析結(jié)果。結(jié)果處理時(shí)，取凍干前酶活檢測(cè)為100%。復(fù)合保護(hù)劑結(jié)果 如表2所示：
[0071] 表2
[0072] 結(jié)合由表2所示，可知，
[0073] 1)在保護(hù)劑存在的條件下，賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶的凍干后的酶活，添加保護(hù)劑的凍 干保持在80%~110%，明顯優(yōu)于未添加保護(hù)劑的凍干酶活。
[0074] 2)在如上的三種成分混合物的保護(hù)劑中，乳糖、聚乙二醇和甘氨酸或其鹽及其鹽 的混合物，蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽及其語(yǔ)言的混合物的凍干后酶活較優(yōu)。 [0075] 3)在如上三種成分混合物的保護(hù)劑中，添加有聚乙二醇4000的混合物的酶活優(yōu)于 添加有甘露醇的混合物;針對(duì)酶凍干形態(tài)相比，含有聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的結(jié)果 較優(yōu);同時(shí)，在pH為10的條件下，酶活結(jié)果優(yōu)于pH為5的混合物。
[0076] 實(shí)施例3
[0077]在實(shí)施例2基礎(chǔ)上，增加了海藻糖這一保護(hù)劑，配制為20 %濃度，-20 °C保存?zhèn)溆谩?本實(shí)驗(yàn)探索蔗糖、右旋糖酐、海藻糖和甘氨酸或其鹽終濃度為0.2%，0.5,1 %，2.5%和5% 五個(gè)濃度的復(fù)合保護(hù)劑對(duì)酶活影響。保護(hù)劑添加按照上述表格，根據(jù)實(shí)施例1和2結(jié)果，本次 實(shí)驗(yàn)緩沖液用pH10,50mmol/L Tris-Hcl緩沖液。取76x3只西林瓶，每只西林瓶按表格加100 μL的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶溶液，然后從〇. 2 %蔗糖、0.2 %甘氨酸或其鹽開始編號(hào)1，0.5 %蔗 糖、0.2%甘氨酸或其鹽編號(hào)6,依次到5%海藻糖、5%甘氨酸或其鹽編號(hào)75。0.2%的保護(hù)劑 需向凍干體系中加20yL，0.5 %的保護(hù)劑需向凍干體系中加50yL，1 %的保護(hù)劑需向凍干體 系中加 l〇〇yL，2.5 %的保護(hù)劑需向凍干體系中加250μ1，5 %的保護(hù)劑需向凍干體系中加500 yL，其余用緩沖液補(bǔ)充。不加保護(hù)劑的為對(duì)照組76號(hào)，對(duì)照組即每瓶添加 100μΙ的賴氨酰肽 鏈內(nèi)切酶溶液，1900μ1對(duì)應(yīng)緩沖液，然后搖勻，凍干。凍干后，取出用2ml超純水溶解，按上述 酶切反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，然后用液相分析結(jié)果。結(jié)果處理時(shí)，取凍干前酶活檢測(cè)為100%。復(fù) 合保護(hù)劑結(jié)果如表3所示：
[0079] 表 3
[0080] 在本實(shí)施例中，采用兩種組分混合物作為保護(hù)劑，即蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合 物，右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物，海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物，表3顯示，不同濃 度保護(hù)劑成分對(duì)凍干酶活具有不同程度的保護(hù)作用;其中，復(fù)合保護(hù)劑凍干形態(tài)相比，添加 1 %右旋糖酐和1 %甘氨酸或其鹽作為保護(hù)劑時(shí)，酶液凍干后形態(tài)完整，無塌陷。在凍干酶活 方面，其中，甘氨酸或其鹽的濃度為1 %時(shí)，凍干酶活優(yōu)于其濃度為0.5%和0.2 %。蔗糖和右 旋糖酐濃度為〇. 5 %時(shí)，凍干酶活較優(yōu)。海藻糖濃度為1 %時(shí)，凍干酶活優(yōu)于濃度為0.5 %和 0.2%的酶活。在各保護(hù)劑濃度為2.5%和1%，其酶活活性接近(結(jié)果相關(guān)不大），同時(shí)各保 護(hù)劑濃度為5 %時(shí)，其酶活的活性接近濃度為2.5%的活性，但濃度為5%的酶活活性較差。 其中，濃度(凍干溶液)為〇. 5%的蔗糖和濃度(凍干溶液)為1 %的甘氨酸或其鹽的混合物的 凍干酶活較優(yōu)，濃度(凍干濃度)為〇. 5 %的右旋糖酐和濃度(凍干濃度)為0.5 %的含有甘氨 酸成分的混合物的凍干酶活較優(yōu)。
[0081 ] 實(shí)施例4
[0082]除考察這些保護(hù)劑對(duì)凍干過程中酶的穩(wěn)定性的影響外，還研究了這些保護(hù)劑對(duì)于 提高溶液貯存狀態(tài)下酶的穩(wěn)定性的效果。配制20%蔗糖和20%的甘氨酸，_20°C保存?zhèn)溆谩?配制PH5-7的PBS和pH8-10的Tris-HCl緩沖液，緩沖液濃度均為50mmol/L。取12x3只西林瓶， 每只西林瓶加 100μΙ的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶溶液，100μΙ蔗糖，100μΙ甘氨酸，1700μ1對(duì)應(yīng)緩沖 液。不加保護(hù)劑的為對(duì)照組，對(duì)照組即每瓶添加1〇〇μ1的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶溶液，1900μ1對(duì) 應(yīng)緩沖液。保存于4°C，并分別于第0(1、7(1、14(1、21(1、28(1取出進(jìn)行酶活分析。按上述酶切反應(yīng) 體系進(jìn)行反應(yīng)，然后用液相分析結(jié)果。結(jié)果處理時(shí)，取第〇d的酶活為100%，酶溶液穩(wěn)定性數(shù) 據(jù)結(jié)果如表4所示：
[0085] 表 4
[0086] 在本實(shí)施例提供賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶的貯存溶液，采用蔗糖和甘氨酸或其鹽組成的 混合物，其蔗糖和甘氨酸或其鹽在酶貯存溶液中的濃度為1%，其中加有保護(hù)劑的酶的保存 效果優(yōu)于未添加保護(hù)劑的效果，保護(hù)劑在pH為5-10的范圍下具有較好的保存效果。
[0087] 本發(fā)明雖然已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并不是用來限定本發(fā)明，任何本領(lǐng)域 技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對(duì)本發(fā) 明技術(shù)方案做出可能的變動(dòng)和修改，因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化及修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案 的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，其特征在于，所述保護(hù)劑的成分包括蔗糖，海 藻糖，乳糖，左旋糖酐，聚乙二醇4000，甘露醇，甘氨酸或其鹽和賴氨酸或其鹽的一種，兩種 或多種混合物;所述保護(hù)劑的各成分在酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為〇. 2%~5%。2. 如權(quán)利要求1所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，其特征在于，所述的保護(hù) 劑的pH為4~10。3. 如權(quán)利要求1或2所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，其特征在于，所述的 保護(hù)劑還包括PBS緩沖液、Tri s-Hc 1緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液和 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。4. 如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，其特征在于，所 述的保護(hù)劑選自蔗糖、甘露醇、甘氨酸或其鹽的一種。5. 如權(quán)利要求4所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，其特征在于，所述的保護(hù) 劑pH為5或10。6. 如權(quán)利要求1或2所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，其特征在于，所述的 保護(hù)劑選擇如下混合物， 蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物； 蔗糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物； 蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物； 蔗糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物； 右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物； 右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物； 右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物； 右旋糖酐、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物； 乳糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物； 乳糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物； 乳糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物； 乳糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物； 蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物； 右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物； 海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物。7. 如權(quán)利要求6所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，其特征在于，所述的混合 物的成分在酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為1 %。8. 如權(quán)利要求6或7所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，其特征在于，所述的 保護(hù)劑選自如下優(yōu)選地的混合物， 乳糖、聚乙二醇和甘氨酸或其鹽的混合物； 蔗糖、聚乙二醇和甘氨酸或其鹽的混合物； 蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物； 右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物。9. 如權(quán)利要求6或7所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，其特征在于，所述的 保護(hù)劑pH為5-10。10. 如權(quán)利要求6所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，其特征在于，所述的混 合物，由兩種成分組成的混合物中的成分在酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為0.2%， 0.5%，1%，2.5%和5%〇11. 如權(quán)利要求8所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，其特征在于，所述蔗糖 和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖在酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為〇. 5%，甘氨酸或其 鹽在酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為1 % ;所述右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物，右 旋糖酐在酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為0.5%，甘氨酸或其鹽在酶凍干溶液中的質(zhì) 量體積百分濃度為0.5%。12. -種賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶的凍干劑，其特征在于，包括如下組分： 權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，所述保護(hù)劑成分在 酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為〇.2%~5% ; 和賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶，所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切在酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為 0.0001%-0.02%。13. 如權(quán)利要求12所述的一種賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶的凍干劑，其特征在于，所述的凍干劑 的pH為4~10。14. 一種賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶的貯存溶液，其特征在于，包括如下組分： 權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶凍干及貯存保護(hù)劑，所述保護(hù)劑成分在 酶凍干溶液中的質(zhì)量體積百分濃度為〇.2%~5% ; 和賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶，所述的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶在酶貯存溶液中的質(zhì)量體積百分濃度 為 0·0001%-0·02%。15. 如權(quán)利要求14所述的一種賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶的貯存溶液，其特征在于，所述的保護(hù) 劑選用蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物，所述蔗糖和甘氨酸或其鹽在酶貯存溶液中的質(zhì)量體 積百分濃度為1 %。
【文檔編號(hào)】C12N9/52GK105985942SQ201610269634
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2016年4月27日
【發(fā)明人】吳勇, 徐帆, 徐一帆, 李亞茹
【申請(qǐng)人】上海多米瑞生物技術(shù)有限公司, 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院