叢枝菌根真菌誘導型啟動子及其應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種叢枝菌根真菌誘導型啟動子及其應用。具體地，本發(fā)明公開了一種啟動子元件，所述的啟動子元件包括：(a)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸；或(b)如SEQ ID NO:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短1-60個(較佳地1-30，更佳地1-6個)核苷酸，且具有叢枝菌根真菌誘導啟動功能的多核苷酸。本發(fā)明啟動子長度僅為550bp，即可驅動目的基因響應菌根的共生，且在多種物種中均可有效啟動。
【專利說明】
叢枝菌根真菌誘導型啟動子及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域。具體地，本發(fā)明涉及一種受叢枝菌根真菌誘導啟動的 啟動子及其應用。
【背景技術】
[0002] 叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza, AM)是土壤中的一類有益真菌（叢枝菌根真 菌，簡稱AM真菌）侵入植物根系后建立形成的互惠共生體（Redecker et al.，2000)。地 球上80%以上的陸生植物都可以與土壤中的AM真菌共生形成叢枝菌根。叢枝菌根共生體 的形成是高等植物適應逆境脅迫的重要進化機制之一。形成菌根后AM真菌的一端（根內菌 絲）定殖于植物根系皮層細胞內，另一端（根外菌絲）穿越根際養(yǎng)分耗竭區(qū)。宿主植物借助 于AM真菌大量的根外菌絲可多達幾十倍的擴展根系在土壤中的吸收空間，增加對土壤中 的礦質養(yǎng)分（P、N、S、Zn等）和水分的吸收利用，從而改善宿主植株的營養(yǎng)狀況；作為交換， 宿主植株也為AM真菌提供其生長繁殖所必需的碳水化合物，以維持兩者的共生關系。研究 表明，宿主植株向根系輸送光合產物的過程同時也增加了根系細胞內滲透調節(jié)物質（如可 溶性糖、脯氨酸等）的有效濃度，從而增強了宿主植物對多種環(huán)境脅迫，如鹽害、干旱、重金 屬毒害的抵御能力。此外，AM真菌的侵染還能夠誘導植株產生系統(tǒng)性防御反應，從而抵御 和減輕病原菌的侵染。
[0003] 叢枝菌根形成的一個重要特征就是，菌絲體侵入到植物皮層細胞中，并經 多次分枝形成叢枝狀結構。包圍著叢枝的是由宿主質膜分化產生的環(huán)叢枝膜結構 (peri-arbuscular membrane) JM真菌與宿主之間的養(yǎng)分及信號分子交換也就發(fā)生在環(huán)叢 枝膜與AM真菌質膜（fungal plasma membrane)之間的質外體中。很多參與物質交換（如 磷轉運蛋白、氨轉運蛋白、等）和信號傳遞（如生長素、獨腳金內酯等）及防御反應相關的 基因也相繼被發(fā)現(xiàn)在形成叢枝的細胞中特異性表達。
[0004] 因此，如何讓植物生長相關基因（如GH3)在AM真菌聚積處更多地表達，從而有利 于根系的生長以及植物的生長，是本領域迫切需要解決的問題。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種新的啟動子，可以有效地啟動植物S1GH3. 4基因在根系中相應 AM真菌從而進行表達。
[0006] 本發(fā)明第一方面，提供了一種啟動子元件，所述的啟動子元件包括：
[0007] (a)核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多核苷酸；或
[0008] (b)如SEQ ID NO: 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60個（較佳地1-30， 更佳地卜6個）核苷酸，且具有叢枝菌根真菌誘導啟動功能的多核苷酸。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的啟動子元件還包括：
[0010] (C)核苷酸序列與SEQ ID NO: 1所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )，且 具有叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhiza, AM)誘導啟動功能的多核苷酸。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因包括植物GH3基因。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物GH3基因包括S1GH3. 4、S1GH3. 9、和/或S1GH3. 15。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是S1GH3. 4(GenBank登錄號：KP639566)。
[0014] 本發(fā)明第二方面，提供了一種構建物，所述的構建物含有本發(fā)明第一方面所述的 啟動子元件，和與所述啟動子元件可操作連接的目的基因。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的構建物在天然狀態(tài)下不存在。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的構建物還含有外源性基因。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的外源性基因包括抗性基因、篩選標記基因、RNAi基因、 microRNA基因、生物制劑基因、或植物品質相關基因。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗性基因選自下組：卡那霉素、氯霉素、氨芐青霉素、四環(huán) 素、潮霉素、新霉素等抗生素抗性基因，抗病毒基因等。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的篩選標記基因選自下組：gus(i3_葡萄糖苷酸酶）基因、 hyg(潮霉素）基因 、neo (新霉素）基因、或gfp (綠色熒光蛋白）基因。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的生物制劑基因選自下組：a 2b干擾素基因、或胰島素樣 生長因子基因。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物品質相關基因選自下組：氣基酸改良相關基因、脂肪 改良相關基因、淀粉改良相關基因、或雄性不育相關基因。
[0022] 本發(fā)明第三方面，提供了一種表達盒，所述表達盒從5'至3'依次具有下述元件： 本發(fā)明第一方面所述的啟動子元件、目的基因0RF序列和終止子。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達盒還包括選自下組的一種或多種元件：poly(A)元 件、增強子、轉運元件、或終止子。
[0024] 本發(fā)明第四方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第一方面所述的啟動 子元件、或本發(fā)明第二方面所述的構建物、或本發(fā)明第三方面所述的表達盒。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述載體選自：細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、或植物細胞病毒載 體、穿梭載體。
[0026] 本發(fā)明第五方面，提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有本發(fā)明第四方面所述 的載體、或其染色體上整合有外源性的本發(fā)明第一方面所述的啟動子元件或整合有本發(fā)明 第二方面所述的構建物或整合有本發(fā)明第三方面所述的表達盒。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞選自下組：原核細胞（如大腸桿菌、鏈霉菌屬、 或農桿菌）、低等真核細胞（如酵母細胞）、或高等真核細胞（如植物細胞）。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞為植物細胞，更佳地為農作物、蔬菜、或花卉的 植物細胞。
[0029] 本發(fā)明第六方面，提供了第一方面所述的啟動子元件、本發(fā)明第二方面所述的構 建物、本發(fā)明第三方面所述的表達盒或本發(fā)明第四方面所述的載體的用途，用于在宿主細 胞中表達目的基因，其中所述目的基因與所述的啟動子操作性連接，并且所述啟動子的具 有叢枝菌根真菌誘導啟動功能啟動子活性；或用于構建受叢枝菌根真菌誘導啟動功能并表 達目的基因的轉錄表達體系。
[0030] 本發(fā)明第七方面，提供了一種調控目的基因轉錄表達水平的方法，包括步驟：
[0031] (a)提供本發(fā)明第二方面所述的構建物；
[0032] (b)將步驟（a)中得到的構建物導入宿主細胞，獲得轉化的宿主細胞；
[0033] (c)將所述的宿主細胞再生為植株；
[0034] (d)在叢枝菌根真菌存在下培養(yǎng)所述的植株，從而使所述的目的基因在所述的植 株中特異性表達。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞包括番茄細胞、煙草細胞、大豆細胞。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的叢枝菌根真菌感染所述的植株。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因在所述植株的根系中表達。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的根系被AM真菌侵染。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的構建物通過以下步驟獲得：
[0040] ⑴以番茄基因組為模板，PCR擴增SEQ ID NO. : 1所示的序列；
[0041] (ii)PCR擴增所述的目的基因多核苷酸片段，其中所述的目的基因為S1GH3. 4基 因；
[0042] (iii)可操作連接所述啟動子和所述目的基因多核苷酸片段從而得到所述構建 物。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，用于PCR擴增SEQ ID N0. :1所示序列的引物序列如SEQID NO. :9-10 所示。
[0044] 本發(fā)明第八方面，提供了一種細胞培養(yǎng)物，所述的細胞培養(yǎng)物含有本發(fā)明第五方 面所述的宿主細胞，和外源添加的叢枝菌根真菌。
[0045] 本發(fā)明第九方面，提供了一種植物愈傷組織或植物體細胞胚胎，所述的愈傷組織 或體細胞胚胎含有本發(fā)明本發(fā)明第四方面所述的載體、或其染色體上整合有外源性的本發(fā) 明第一方面所述的啟動子元件或整合有本發(fā)明第二方面所述的構建物或整合有本發(fā)明第 三方面所述的表達盒，其中，所述的植物包括番茄、煙草、或大豆。
[0046] 應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0047] 圖1顯示了 6個S1GH3基因在接種和不接種AM真菌的番茄中的表達分析縱坐標： 相對表達量；橫坐標為根系和葉片；-AMF:不接種AM真菌；+AMF:接種AM真菌。
[0048] 圖2顯示了 pSlGH3. 4-2258驅動⑶S基因的在轉基因煙草根系中的表達分析（a) 為正常培養(yǎng)的根系（N) ;(b-c)為AM真菌侵染的根系；綠色箭頭指示為沒有被菌絲侵染的 細胞；粉紅色箭頭指示為被菌絲侵染形成叢枝的細胞。
[0049] 圖3顯示了 pSlGH3. 4-654(a)和pSlGH3. 4-550(b)驅動⑶S基因的在轉基因煙草 根系中的表達分析，其中+AMF表示接種AM真菌的處理。
[0050] 圖4顯示了 pSlGH3. 4-2258(b)和pSlGH3. 4-550(c)驅動⑶S基因的在大豆轉基 因根系中的表達分析，其中（a)N :正常培養(yǎng)；+IAA :IAA處理；+AMF接種AM真菌的處理。
【具體實施方式】
[0051] 本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，利用生物信息學方法進行設計篩選，獲得了一 個受叢枝菌根真菌共生特異性誘導啟動的、長度僅為550bp的啟動子。具體地，本發(fā)明利 用基因工程植物轉化技術，構建不同長度啟動子的植物表達載體，再將表達載體轉染多種 植物，研究不同長度啟動子在叢枝菌根共生處理時對特定基因的作用。研究發(fā)現(xiàn)，550bp的 啟動子就可以驅動目的基因響應菌根共生。采用本發(fā)明啟動子更易于在表達載體中進行表 達。在此基礎上，完成了本發(fā)明。
[0052] 本發(fā)明啟動子
[0053] 在本發(fā)明中，術語"具有叢枝菌根真菌誘導啟動功能的啟動子"指的是能夠在叢枝 菌根真菌共生（感染）狀態(tài)下的誘導型表達的啟動子。通常，叢枝菌根真菌定植于植物根 系的皮層細胞，因此，本發(fā)明啟動子也多在根系內受叢枝菌根真菌誘導啟動。
[0054] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在S1GH3. 4基因長達2000余bp的啟動子區(qū)域內，僅550bp的啟動 子即可響應叢枝菌根真菌的共生誘導，并啟動相應的目的基因進行表達。
[0055] 本文所用的術語"啟動子"或"啟動子區(qū)（域）"是指一種有效起始基因轉錄功能 的核酸序列及能夠影響該基因轉錄水平的核酸序列，引導基因核酸序列轉錄為RNA，其通常 存在于目的基因編碼序列的上游（5'端），一般地，啟動子或啟動子區(qū)域提供RNA聚合酶和 正確起始轉錄所必需的其它因子、以及能夠調控基因轉錄水平的相關因子的識別位點。優(yōu) 選地，本發(fā)明啟動子序列如SEQ ID N0. :1所示。
[0056] 根據(jù)S1GH3. 4基因以及本發(fā)明啟動子的序列后，可根據(jù)本領域常規(guī)技術篩選并獲 得擴增相應啟動子區(qū)域的引物。優(yōu)選地，用于擴增SEQ ID N0. :1所示序列的引物如SEQ ID NO. :9-10 所示。
[0057] 在本文中，所述啟動子或啟動子區(qū)（域）包括啟動子的變體，啟動子變體可以通過 插入或刪除核酸序列，進行隨機或定點突變等來獲得。
[0058] 鑒于本發(fā)明的教導和現(xiàn)有技術，本領域普通技術人員應理解，盡管本發(fā)明的實施 例中提供的啟動子序列如SEQ ID N0. :1所示，但本發(fā)明還應包括與本發(fā)明的啟動子序列 (SEQ ID N0:1)具有50%或以上（優(yōu)選60%以上，70%以上，80%以上，更優(yōu)選90%以上， 更優(yōu)選95%以上，最優(yōu)選98%以上，如99%)同源性的核酸，只要所述核酸也具有叢枝菌根 真菌誘導啟動功能。"同源性"是指按照位置相同的百分比，兩條或多條核酸之間的相似水 平（即序列相似性或同一性）。更優(yōu)選地，本發(fā)明啟動子的變體必須包含S1GH3. 4編碼基因 上游90-97位TATA box核心啟動子區(qū)域（TATAAATA)。
[0059] 目的基因、外源基因和構建物
[0060] 本發(fā)明所用的"目的基因"指的是任何與本發(fā)明啟動子直接或間接可操作連接，并 能夠受本發(fā)明啟動子啟動并表達的基因。本發(fā)明的啟動子可以可操作地與目的基因連接， 該目的基因相對于啟動子可以是來源于同一個物種，也可以來自不同的物種。本文所述的 目的基因沒有特別限制，可以是RNA的基因或編碼具有特定功能蛋白的基因。
[0061] 優(yōu)選地，所述的目的基因包括植物的GH3基因，GH3基因被發(fā)現(xiàn)以來其功能就一 直被認為與生長素信號及其傳導途徑密切相關。近年來的研究表明，在擬南芥、水稻、番茄 等很多高等植物的基因組中都存在著多個GH3同源基因?？捎糜诒景l(fā)明的GH3基因包括 S1GH3. 4、S1GH3. 9、和/或S1GH3. 15,優(yōu)選為S1GH3. 4。此外，本發(fā)明所述"外源基因"指的 是也可為本發(fā)明啟動子啟動的基因，或在質粒中可以獨立表達的、不屬于宿主細胞的基因。 因此，本發(fā)明"外源基因"中一部分也是"目的基因"，例如，本發(fā)明所采用的⑶S基因。
[0062] 本發(fā)明提供的構建物通常含有本發(fā)明的啟動子元件，以及可操作連接的目的基因 (或外源基因）。優(yōu)選地，本發(fā)明為含有SEQ ID N0. :1以及S1GH3.4基因序列的核苷酸片 段。
[0063] 表達盒、載體、宿主細胞
[0064] 本發(fā)明還提供了所述表達盒從5'至3'依次具有下述元件：本發(fā)明第一方面所 述的啟動子元件、目的基因0RF序列和終止子。優(yōu)選地，所述啟動子元件的序列如SEQ ID NO. :1所示或與SEQ ID NO. :1所示序列的同源性彡95%，較佳地彡98%，更佳地彡99%。 [0065] 本發(fā)明還提供了一種載體，其包含本發(fā)明的啟動子和/或基因表達盒。在優(yōu)選的 實施方式中，所述載體的啟動子下游包含多克隆位點或至少一個酶切位點。需要表達目的 基因時，將目的基因連接入適合的多克隆位點或酶切位點，從而可操作地連接目的基因與 啟動子。
[0066] 在另一優(yōu)選的實施方式中，所述重組載體在5'到3'方向上包括：啟動子，目的基 因和終止子。如果需要，所述重組載體還可以包括以下元件：蛋白純化標簽；3'多聚核苷 酸化信號；非翻譯核酸序列；轉運和靶向核酸序列；選擇標記（抗生素抗性基因、熒光蛋白 等）；增強子；或操作子。
[0067]用于制備重組載體的方法是本領域普通技術人員所熟知的。表達載體可以是細菌 質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊?，只要其能夠 在宿主體內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以被米用。
[0068] 本領域普通技術人員可以采用熟知的方法構建含有本發(fā)明啟動子和/或目的基 因序列的載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。
[0069] 本發(fā)明的啟動子、表達盒或載體，可以用于轉化適當?shù)乃拗骷毎?，以使宿主轉錄目 的RNA或表達目的蛋白質。宿主細胞可以是原核細胞，如農桿菌\大腸桿菌、谷氨酸棒桿 菌、黃色短桿菌、鏈霉菌屬：或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細 胞。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體和宿主細胞。用重組DNA轉化宿主細 胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物（如大腸桿菌）時，可以 用CaCV法處理，也可用電穿孔法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法： 磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法（如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等）。轉化植物也可使用 農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法、幼胚轉化法、花芽浸泡法等。對于轉化的植 物細胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得轉基因的植物。
[0070] 術語"可操作連接"是指將準備轉錄表達的目的基因以一種本領域的常規(guī)方式連 接到它的控制序列以被表達。
[0071] 本發(fā)明有益效果
[0072] 通過對番茄中GH3基因在接種AM真菌處理條件下的熒光定量PCR分析，結果顯示 S1GH3. 4基因在根系中被誘導強烈表達。本發(fā)明人篩選到一段長度僅為550bp的啟動子片 段，其在轉化煙草和大豆等植物后，該啟動子片段還能夠驅動GUS基因在接種AM真菌的煙 草和大豆中強烈表達，表達部位也是集中在被侵染形成叢枝和內生菌絲的皮層細胞中。本 發(fā)明啟動子片段的長度僅為原啟動子片段的1/4,仍然保持著AM真菌誘導啟動活性，且活 性并無降低，因此，該短啟動子片段更有利于表達載體的構建。此外，實驗證明，本發(fā)明啟動 子能在多種物種中啟動S1GH3. 4基因，應用十分廣泛。
[0073] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0074] 實施例1番茄GH3基因對叢枝菌根的響應
[0075] 將番前（Solanum lycopersicum，Micro Tom)種子接種到 MS 培養(yǎng)基上，在 25°C培 養(yǎng)室里發(fā)芽和無菌培養(yǎng)2周后，無菌苗轉移出來用沙培營養(yǎng)液澆灌盆栽培養(yǎng)。營養(yǎng)液配方 為ImM硝酸銨，2mM硝酸鉀，0. 05mM磷酸二氫鈉，0. 5mM硝酸鈣，0. 25mM氯化鈣，0. 5mM硫酸 鎂，20 μ M Fe-EDTA，9 μ Μ氯化猛，46 μ Μ硼酸，8 μ Μ硫酸鋅，3 μ Μ硫酸銅和0. 03 μ Μ鉬酸銨。 番前設接種AM真菌和不接種AM真菌（Rhizophagus irregularis，菌株DA0M197198)處理。 在接種后不同時期采樣分析AM真菌的侵染水平和番茄根系和葉片中基因的表達量。RNA提 取、cDNA合成及熒光定量RT-PCR分析同上。
[0076] 分析結果顯示，在接種AM真菌一個月的根系，S1GH3. 4基因的表達被特異性強烈 誘導，在沒有接種AM真菌的根系中，幾乎檢測不到S1GH3. 4的表達。此外，在接種AM真菌 的根系中，S1GH3. 9和S1GH3. 15基因的表達量與對照相比也顯著上調（圖1)。
[0077] 實施例2番茄基因組DNA的提取及S1GH3. 4基因的啟動子候選片段的獲得
[0078] 2. 1.番茄基因組DNA提取
[0079] (1) DNA提取緩沖液配制
[0080] 溶液 A (500ml):
[0081] 1M Tris-HCl(pH7. 5) 0. lM(50ml)
[0082] 0. 5M EDTA (pH8. 0) 5mM(5ml)
[0083] 山梨糖醇 0· 35M(3L 85g)
[0084] 溶液 B (500ml):
[0085]
[0086] 溶液 C :
[0087] 5 %月桂酰基肌氨酸鈉溶液
[0088] 在溶液B中添加 pvpp，添加量為總提取液的1 %，然后按1 :1 :0· 4的比例分別混合 溶液A、B、C即DNA提取緩沖液
[0089] (2) ·提取DNA的步驟：
[0090] 1)稱取0. l_0.3g新鮮葉片在液氮中研磨成粉末，轉移至2ml Ep管中，添加 300-500 μ 1 DNA提取緩沖液后，充分渦旋混勻。
[0091] 2) 65°Cta溫水浴 15_20min，每 5min 禍旋樣品一次。
[0092] 3)添加等體積氯仿-異戊醇（比例24 :1)，搖床上慢速混勾10_15min。
[0093] 4) 4°C，7500rpm 離心 15min。
[0094] 5)轉移上清至新的1.5ml Ep管中，用500 μ 1的酚/氯仿（1:1)抽提1次，再用等 體積的氯仿抽提一次。
[0095] 6)小心轉移上清至新的1. 5ml Ep管，添加1ml無水乙醇，上下顛倒幾次，放 置-20°C 下 lOmin。
[0096] 7) 7500rpm離心5min，沉淀DNA，棄去多余液體。
[0097] 8)用75 %的乙醇洗滌DNA，棄去乙醇，空氣中充分干燥。
[0098] 9)添加 30-50 μ 1 TER(TE+RNase，RNase 終濃度 50 μ g/ml)緩沖液溶解 DNA。
[0099] 2· 2. S1GH3. 4基因的啟動子候選片段的獲得
[0100] 利用S1GH3. 4基因的DNA序列（GenBank登錄號：ΚΡ639566)為檢索序列，選擇 S1GH3. 4起始密碼子ATG上游2500bp作為啟動子候選片段。
[0101] 根據(jù)S1GH3. 4基因啟動子的序列，分別設計正向引物F1和F2 (5'端引入Hind III 酶切位點）以及反向引物R(5'端引入BamH I酶切位點），具體的引物序列見表1。以番茄 基因組DNA為模板，進行常規(guī)PCR擴增出三條分別長2258bp、654bp、550bp和335bp的啟動 子片段（SEQ ID NO. : 1-4)。
[0102] 表 1
[0103]
[0104] 實施例3不同長度的啟動子插入表達載體，構建轉染載體
[0105] 將實驗2. 2中的擴增產物克隆到到pEasy-blunt克隆載體（北京全式金生物公 司），并測序驗證陽性克隆。用限制性內切酶Hind III和BamH I將啟動子從克隆載體中切 下，并同時用Hind III和BamH I雙酶切切下雙元表達載體pBI 121質粒的CaMV35S啟動 子。通過T4DNA連接酶將去除⑶S基因的線性化pBI 121質粒與不同長度的S1GH3.4啟動 子片段連接構建重組表達載體pBI 121-pSlGH3.4,并測序驗證。將上述正確的載體點擊轉 化根癌農桿菌EHA105,然后通過葉盤法轉化煙草。
[0106] 實施例4通過根癌農桿菌介導法導入煙草植物
[0107] (1)煙草無菌苗的培養(yǎng)
[0108] 將煙草種子放入100ml無菌三角瓶中，用70%酒精消毒lmin ;倒去酒精，加0. 1% HgC12溶液浸泡5min ;倒去HgC12溶液，無菌水清洗4-5遍，最后一遍浸泡30min。將種子 小心轉移到無菌濾紙上吸干，用無菌的鑷子將種子小心地置入滅菌的MS固體培養(yǎng)基上，在 組培室中28 °C培養(yǎng)4-6周。
[0109] (2)農桿菌與組織愈傷共培養(yǎng)
[0110] 挑取攜帶有重組質粒的根癌農桿菌EHA105單菌落接種于5ml含有50mg/LStr和 Kan抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C，250rpm，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，從中吸取lml重 新接種到50ml新鮮的YEP液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 2-0. 3 ;5000rpm離心后將 農桿菌沉淀用MS培養(yǎng)液重懸，待用。
[0111] 剪取煙草無菌苗葉片，剪成約〇. 5X0. 5cm的小塊，將剪好的葉片在用MS培養(yǎng)液重 懸的農桿菌中浸泡5-10min ;用無菌的濾紙將葉片表面的菌液吸干，置于MS共培養(yǎng)培養(yǎng)基 中，28°C，黑暗培養(yǎng)3天左右。
[0112] (3)分化
[0113] 共培養(yǎng)后的葉片外植體先用無菌水洗滌4次，再用含250mg/L羧芐青霉素（Car) 的無菌水浸泡5min，然后用無菌濾紙吸干，轉入到MS分化選擇培養(yǎng)基中組培室28°C恒溫培 養(yǎng)。每10天更換一次培養(yǎng)基。
[0114] (4)生根及移栽
[0115] 等芽長至l-2cm左右時，切下，移入MS生根選擇培養(yǎng)基中，促其生根。等長出4-5 片真葉后，將其中一片葉片剪成1X lcm的小塊重新置于MS分化選擇培養(yǎng)基中進行擴繁。根 系發(fā)育好后，從組培室移入到常規(guī)溫室進行日常管理。
[0116] (5)轉基因煙草的PCR檢測
[0117] 為了進一步鑒定抗卡那霉素煙草植株確實為轉基因植株，根據(jù)pBI 121載體中 ⑶S基因序列設計了一條通用的反向引物⑶SR1(SEQ ID N0. 13)，并通過F4引物和⑶SR1 以對轉基因煙草進行PCR檢測。
[0118] 實施例5不同長度PS1GH3. 4啟動子驅動⑶S基因在煙草中表達的組織化學檢測 分析
[0119] 對PCR檢測為陽性苗的轉基因煙草株系，進行接種AM真菌處理。AM真菌接種30 天后，剪取不同長度啟動子轉基因苗的根系浸入GUS染液中，37 °C反應8h后FAA固定液 (福爾馬林，冰醋酸和70%乙醇按體積1:1:18混合配制而成）中脫色固定10h，鏡檢成像 (BX500LYPUS 顯微鏡）。
[0120] 結果顯示2258bp長度的S1GH3. 4啟動子（pSlGH3. 4-2258)驅動⑶S基因在接種AM 真菌的根系中大量表達，表達部位主要集中在含有叢枝和內生菌絲的根系皮層細胞中（圖 2) 〇
[0121] 此外，654bp 和 550bp 長度的 S1GH3.4 啟動子（pSlGH3.4-654 和 pSlGH3.4-550)也 能夠驅動⑶S基因在接種AM真菌的根系中大量表達，表達部位同樣主要集中在含有叢枝和 內生菌絲的根系皮層細胞中（圖3a，b)，但335bp長度的S1GH3. 4啟動子已經不能驅動⑶S 基因在接種AM真菌的根系中大量表達（圖3c)。
[0122] 實施例6:不同長度PS1GH3. 4啟動子驅動⑶S基因在大豆中表達的組織化學檢測 分析
[0123] 將構建好的PS1GH3. 4-2258和pSlGH3. 4-550載體通過點擊轉化方法轉入到發(fā)根 農桿菌K599菌株中，LB培養(yǎng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)到0D600約為0. 5左右，通過注射器注射20ul 菌液到發(fā)芽3天的大豆下胚軸中，保持傷口在黑暗和濕潤的環(huán)境下生長至傷口處長出發(fā)根 (約14天左右），剪去大豆自身的根系。將長出發(fā)根的大豆接種AM真菌沙培營養(yǎng)液培養(yǎng)， 一個月后染色檢測根系中⑶S的表達情況。
[0124] 結果顯示pSlGH3. 4-2258和pSlGH3. 4-550在大豆中也能夠驅動⑶S基因在接種 的根系中特異性表達，表達模式與在煙草中的表達模式相同。即PS1GH3. 4-2258能夠驅動 GUS基因在接種AM真菌的根系中表達，表達部位主要集中在含有叢枝和內生菌絲的根系皮 層細胞中。而PS1GH3. 4-550也能夠驅動⑶S基因在接種AM真菌的根系中表達，表達部位 也集中在含有叢枝和內生菌絲的根系皮層細胞中（圖4)。
[0125] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【主權項】
1. 一種啟動子元件，其特征在于，所述的啟動子元件包括： (a) 核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多核苷酸；或 (b) 如SEQ ID NO: 1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短1-60個（較佳地1-30,更 佳地卜6個）核苷酸，且具有叢枝菌根真菌誘導啟動功能的多核苷酸。2. 如權利要求1所述的啟動子元件，其特征在于，所述的目的基因包括植物GH3基因。3. -種構建物，其特征在于，所述的構建物含有權利要求1所述的啟動子元件，和與所 述啟動子元件可操作連接的目的基因。4. 一種表達盒，其特征在于，所述表達盒從5'至3'依次具有下述元件：權利要求1所 述的啟動子元件、目的基因0RF序列和終止子。5. -種載體，其特征在于，所述的載體含有權利要求1所述的啟動子元件、或權利要求 3所述的構建物、或權利要求4所述的表達盒。6. -種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有本發(fā)明權利要求5所述的載體、或其 染色體上整合有外源性的權利要求1所述的啟動子元件或整合有權利要求3所述的構建物 或整合有權利要求4所述的表達盒。7. 權利要求1所述的啟動子元件、權利要求3所述的構建物、權利要求4所述的表達盒 或權利要求5所述的載體的用途，其特征在于，用于在宿主細胞中表達目的基因，其中所述 目的基因與所述的啟動子操作性連接，并且所述啟動子的具有叢枝菌根真菌誘導啟動功能 啟動子活性；或用于構建受叢枝菌根真菌誘導啟動功能并表達目的基因的轉錄表達體系。8. -種調控目的基因轉錄表達水平的方法，其特征在于，包括步驟： (a) 提供權利要求3所述的構建物； (b) 將步驟（a)中得到的構建物導入宿主細胞，獲得轉化的宿主細胞； (c) 將所述的宿主細胞再生為植株； (d) 在叢枝菌根真菌存在下培養(yǎng)所述的植株，從而使所述的目的基因在所述的植株中 特異性表達。9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的構建物通過以下步驟獲得： (i) 以番茄基因組為模板，PCR擴增SEQ ID NO. :1所示的序列； (ii) PCR擴增所述的目的基因多核苷酸片段，其中所述的目的基因為S1GH3. 4基因； (iii) 可操作連接所述啟動子和所述目的基因多核苷酸片段從而得到所述構建物。10. -種細胞培養(yǎng)物，其特征在于，所述的細胞培養(yǎng)物含有權利要求6所述的宿主細 胞，和外源添加的叢枝菌根真菌。
【文檔編號】C12N15/82GK105985959SQ201510083342
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月15日
【發(fā)明人】陳愛群, 陳瀟, 廖德華, 孫淑斌, 徐國華
【申請人】南京農業(yè)大學