抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用。所述siRNA的核苷酸序列為以下雙鏈RNA分子中的任意一種：正義鏈：5’?GCAGAUCAUCAGAGGAAAU?3’，反義鏈：5’?AUUUCCUCUGAUGAUCUGC?3’；正義鏈：5’?CCAAGGAAGCCAAGCCAAA?3’，反義鏈：5’?UUUGGCUUGGCUUCCUUGG?3’；正義鏈：5’?GGAGAUAAGUGAUGGAGAU?3’，反義鏈：5’?AUCUCCAUCACUUAUCUCC?3’。這些siRNA可以特異高效地抑制EGFR基因表達(dá)，降低細(xì)胞生長增殖速率。
【專利說明】
抑制EGFR基因表達(dá)的s i RNA及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及一種抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用，屬于分子生物與生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi) 同源mRNA從而阻斷靶基因表達(dá)，是細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)為21-25個核苷酸的小分子干擾核糖核酸，可有效地定位目標(biāo) mRNA，siRNA具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，即5 '端磷酸基團和3 '端的羥基，其兩條鏈的3 '端各有兩 個堿基突出于末端。由siRNA中的反義鏈指導(dǎo)合成一種被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC) 的核糖體，再由RISC介導(dǎo)切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補的區(qū)域，從而實現(xiàn)干擾靶 基因表達(dá)的功能。同時，siRNA可以作為特殊的引物，在依賴于RNA的RNA聚合酶的作用下，以 目的mRNA為模版合成dsRNA，后者又可被降解為新的siRNA，重新進(jìn)入上述循環(huán)。因此，即使 外源siRNA的注入量較低，該信號也可能迅速被放大，導(dǎo)致全面的基因沉默。
[0003] 表皮生長因子受體（epidermal growth factory receptor，EGFR)是一個由單一 肽鏈組成的跨膜糖蛋白，由氨基端細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、疏水性單一跨膜螺旋和胞漿 酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成，C-端含有數(shù)個重要的酪氨酸殘基和受體調(diào)芐基序，屬于HER家族， 主要分布于細(xì)胞膜的表面。EGFR在許多腫瘤中過表達(dá)或發(fā)生突變，其主要作用機制是通過 與細(xì)胞外的配體結(jié)合后進(jìn)行同源或異源二聚化，引起胞內(nèi)酪氨酸殘基自身磷酸化，活化的 受體募集信號合體并活化下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)化、血管 生成及轉(zhuǎn)移。
[0004] 人類惡性腫瘤普遍表達(dá)EGFR，上消化道、結(jié)腸、胰腺、乳腺、卵巢、膀胱、腎等組織惡 性腫瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中EGFR mRNA或蛋白表達(dá)過量，或伴有EGFR基因的擴增。研究顯示，與 不表達(dá)EGFR配體的腫瘤相比，共表達(dá)EGFR及其配體的腫瘤生長迅速，惡性度高，患者生存期 短。EGFR除了能刺激腫瘤細(xì)胞增殖外，還與腫瘤細(xì)胞血管形成有關(guān)。
[0005] 許多腫瘤組織同時表達(dá)EGFR及其配體，能夠通過自分泌和旁分泌途徑活化EGFR。 已有的體內(nèi)外研究表明，用EGFR抑制劑阻斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)EGFR活化的信號通路能夠抑制腫瘤 細(xì)胞的增殖和生存。另外，研究發(fā)現(xiàn)成人EGFR缺乏明顯的生理作用，而EGFR過表達(dá)與腫瘤患 者預(yù)后較差相關(guān)，這些研究結(jié)果表明EGFR及其配體網(wǎng)絡(luò)可作為腫瘤分子治療策略的合理靶 位。采用RNAi技術(shù)研究EGFR在腫瘤發(fā)病過程中行使的功能是對腫瘤發(fā)病機制研究的重要補 充。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供能夠特異高效地抑制EGFR基因表達(dá)的s iRNA及其 應(yīng)用。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 抑制EGFR基因表達(dá)的s iRNA，其核苷酸序列為以下雙鏈RNA分子中的任意一種：
[0009] 正義鏈:5' -GCAGAUCAUCAGAGGAAAU-3'，反義鏈:5' -AUUUCCUCUGAUGAUCUGC-3' ； [0010]正義鏈:5 ' -CCAAGGAAGCCAAGCCAAA-3 '，反義鏈:5 ' -UUUGGCUUGGCUUCCUUGG-3 ' ；
[0011] 正義鏈:5 ' -GGAGAUAAGUGAUGGAGAU-3 '，反義鏈:5 ' -AUCUCCAUCACUUAUCUCC-3 '。
[0012] 本發(fā)明還包括上述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA在制備預(yù)防或治療人類表皮生長因 子受體相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。具體的，所述的疾病為肺癌。
[0013] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種降低人非小細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞生長增殖率的方 法，具體為:將上述siRNA導(dǎo)入目的細(xì)胞，使目的細(xì)胞的生長增殖速率下降。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供一系列新的抑制EGFR基因表達(dá)的SiRNA及其在制藥 中的應(yīng)用，體外試驗結(jié)果表明，這些siRNA可以特異高效地抑制EGFR基因表達(dá)，降低細(xì)胞生 長增殖速率。
【附圖說明】
[0015]圖1為實施例2中各實驗組和對照組分別作用于叱1-!1460細(xì)胞后16 8七6以 blotting檢測各處理組細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平的實時拍照圖；
[0016] 圖2為實施例2中各實驗組和對照組分別作用于NCI-H460細(xì)胞后We stern blotting檢測各處理組細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平定量圖；
[0017]圖3為實施例3中各實驗組和對照組分別作用于NCI-H460細(xì)胞后各處理組細(xì)胞被 Α0/ΕΒ染色的形態(tài)圖，其中（a)為空白對照組，（b)為陰性對照組，（c)為EGFR siRNA正常實驗 組；
[0018] 圖4為實施例4中各實驗組和對照組分別作用于NCI-H460細(xì)胞后We stern blotting檢測各處理組細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平的實時拍照圖；
[0019] 圖5為實施例4中各實驗組和對照組分別作用于NCI-H460細(xì)胞后We stern blotting檢測各處理組細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平定量圖；
[0020] 圖6為實施例5中各實驗組和對照組分別作用于NCI-H460細(xì)胞后各處理組細(xì)胞胞 被Α0/ΕΒ染色的形態(tài)圖，其中（a)為空白對照組，（b)為陰性對照組，（c)為EGFR siRNA正常實 驗組；
[0021] 圖7為實施例6中各實驗組和對照組分別作用于NCI-H460細(xì)胞后We stern blotting檢測各處理組細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平的實時拍照圖；
[0022] 圖8為實施例6中各實驗組和對照組分別作用于NCI-H460細(xì)胞后We stern blotting檢測各處理組細(xì)胞中EGFR的表達(dá)水平定量圖。
[0023]圖9為實施例7中各實驗組和對照組分別作用于NCI-H460細(xì)胞后各處理組細(xì)胞被 Α0/ΕΒ染色的形態(tài)圖，其中（a)為空白對照組，（b)為陰性對照組，（c)為EGFR siRNA正常實驗 組。
【具體實施方式】
[0024] 本發(fā)明提供了三種抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA，分別如下：
[0025] 第一種：正義鏈：5'-GCAGAUCAUCAGAGGAAAU-3'（SEQIDN0·l)，反義鏈 ：5'-AUUUCCUCUGAUGAUCUGC-3'（SEQ ID N0.2);
[0026] 第二種：正義鏈：5'-CCAAGGAAGCCAAGCCAAA-3'（SEQIDN0·3)，反義鏈 ：5'-UUUGGCUUGGCUUCCUUGG-3'（SEQ ID N0.4);
[0027] 第三種：正義鏈：5'-GGAGAUAAGUGAUGGAGAU-3'（SEQIDN0·5)，反義鏈 ：5'-AUCUCCAUCACUUAUCUCC-3'（SEQ ID N0.6)。
[0028] 本發(fā)明還提供上述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA在制備預(yù)防或治療人類表皮生長因 子受體相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用，具體是在制備預(yù)防或治療人類肺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明進(jìn)一步還提供一種降低人非小細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞生長增殖率的方法， 具體為:將上述siRNA導(dǎo)入目的細(xì)胞，使目的細(xì)胞的生長增殖速率下降。
[0030] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述，以更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，但 本發(fā)明并不限于以下實施例。
[0031 ]下述各實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述各實施例中所用 的實驗材料，如無特殊說明，均為來自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0032]人非小細(xì)胞肺癌NCI-H460,購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。
[0033] Gibco? DMEM basic(lX)培養(yǎng)液、Gibco? FBS Qualifieg Australia Origin胎 牛血清購自Lifetechnologies公司。兔抗人EGFR-抗、鼠抗人β-actin購自Abeam公司?？雇?IgG二抗、抗鼠 IgG二抗購自北京中杉金橋公司。PBS、RIPA裂解液、BCA法蛋白測定試劑盒購 自北京碧云天公司。Lipofectamine? 2000購自Invitrogen?；瘜W(xué)發(fā)光劑Supersignal West Pico購自Thermo AO-EB雙染試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。
[0034] 實施例1:EGFR siRNA的設(shè)計合成
[0035] -、EGFR siRNA的合成
[0036] 通過Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫中獲取人EGFR喊 基序列全長(T01001)，如下：
[0038] 根據(jù)RNAi原理，結(jié)合設(shè)計軟件，在實驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計合成三條EGFRsiRNA和一條 陰性對照siRNA。進(jìn)行BLAST比對檢查一保證和其他基因沒有同源性。
[0039] 第一條：正義鏈：5'-GCAGAUCAUCAGAGGAAAU-3'（SEQIDN0·l)，反義鏈 ：5'-AUUUCCUCUGAUGAUCUGC-3'（SEQ ID N0.2);
[0040] 第二條：正義鏈：5'-CCAAGGAAGCCAAGCCAAA-3'（SEQIDN0·3)，反義鏈 ：5'-UUUGGCUUGGCUUCCUUGG-3'（SEQ ID N0.4);
[0041] 第三條：正義鏈：5'-GGAGAUAAGUGAUGGAGAU-3'（SEQIDN0·5)，反義鏈 ：5'- AUCUCCAUCACUUAUCUCC-3'（SEQ ID N0.6)。
[0042] 上述各EGFR siRNA序列均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司（廠址：北京東三環(huán)北 路2號南銀大廈1711，郵編：100027)進(jìn)行化學(xué)合成：以NTP為原料，利用ABI3900核酸合成儀 分別化學(xué)合成單鏈RNA，最后在退火緩沖液的條件下各單鏈RNA退火形成雙鏈RNA。為提高 siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性，在各鏈化學(xué)合成前，利用化學(xué)反應(yīng)將各鏈合成原料中的嘧啶核苷酸 的核糖進(jìn)行2 '羥基的甲氧基替代修飾。
[0043] 二、陰性對照siRNA的合成
[0044] 正義鏈：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'（SEQ ID N0.7)，反義鏈：5'_ ACGUGACACGUUCGGAGAA-3'（SEQ ID N0.8)。
[0045] 由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司（廠址:北京東三環(huán)北路2號南銀大廈1711，郵編： 100027)進(jìn)行化學(xué)合成：以NTP為原料，利用ABI3900核酸合成儀分別化學(xué)合成單鏈RNA，最后 在退火緩沖液的條件下各單鏈RNA退火形成雙鏈RNA。為提高siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性，在各鏈 化學(xué)合成前，利用化學(xué)反應(yīng)將各鏈合成原料中的嘧啶核苷酸的核糖進(jìn)行2'羥基的甲氧基替 代修飾。
[0046] 實施例2:實施例1中第一條EGFR siRNA在體外對NCI-H460細(xì)胞EGFR基因表達(dá)的影 響
[0047] 一、分組轉(zhuǎn)染
[0048] 將NCI-H460細(xì)胞均勻鋪在6孔板種，分為3組：
[0049] 空白對照組：含有10% (體積分?jǐn)?shù)含量）滅活的胎牛血清的DMEM basic(IX)培養(yǎng) 液。
[0050] EGFR SiRNA正常實驗組:含有10% (體積分?jǐn)?shù)含量)滅活的胎牛血清的DMEM basic (IX)培養(yǎng)液;轉(zhuǎn)染1 OOprno 1實施例1中第一條EGFR siRNA。
[0051 ] 陰性對照組(Negative Control):含有10% (體積分?jǐn)?shù)含量)滅活的胎牛血清DMEM bas i c (1X)培養(yǎng)液;轉(zhuǎn)染1 OOpmo 1實施例1中的陰性對照s iRNA。
[0052] 三組細(xì)胞先常規(guī)培養(yǎng)24h，然后根據(jù)組別進(jìn)行轉(zhuǎn)染(按Lipofectamine?2000試劑說 明書操作），轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)6h后，根據(jù)組別更換相應(yīng)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后進(jìn)行實驗； 培養(yǎng)條件:置于37 °C、5 % C02、飽和濕度的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0053]二、Western blotting檢測EGFR蛋白的表達(dá)
[0054]移除干凈6孔板中的培養(yǎng)液，用冷PBS洗滌2次，收集細(xì)胞后充分裂解，4°C、12000轉(zhuǎn) 離心15min，收集上部澄清裂解液后使用BCA蛋白測定試劑盒測定3組裂解液的蛋白濃度，按 裂解液比Loading Buf f er為4:1混勻，與100°C加熱變性5min，按每個泳道30yg總蛋白量換 算上樣體積上樣，行10 % SDS-PAGE電泳，待蛋白充分分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于含5 %脫 脂奶粉TBST的封閉液中，室溫封閉lh，取出膜用IX TBST溶液洗膜5次，每次5min，將裁剪好 的膜分別置于EGFR-抗（1:5000稀釋)和內(nèi)參β-actin-抗（1:800稀釋)4°C孵育過夜，然后 用IX TBST洗膜5次，每次5min，分別與抗兔IgG二抗（1:3000稀釋）、抗鼠 IgG二抗（1:3000稀 釋)室溫孵育2h，將膜與化學(xué)發(fā)光液孵育后進(jìn)行顯色，掃描圖片。檢測各組EGFR蛋白和內(nèi)參 β-actin蛋白所對應(yīng)的條帶A值，然后將Aegfr/Ajs-actin的比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析(Quantity One 軟件）。
[0055] 結(jié)果如圖1、圖2。與陰性對照組比較，EGFR s iRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)顯著 下調(diào)(P〈0.01)。
[0056] 實施例3:實施例1中第一條EGFR siRNA在體外對NCI-H460細(xì)胞凋亡的影響 [0057] 一、分組轉(zhuǎn)染
[0058] 將NCI-H460細(xì)胞均勻鋪在6孔板中，分為3組。具體分組同實施例2的步驟一。
[0059] 二、EGFR siRNA在體外對NCI-H460細(xì)胞凋亡的影響
[0060]消化各組細(xì)胞并收集，用冷PBS清洗2次后，在用新鮮冷PBS懸浮細(xì)胞，按lml細(xì)胞懸 浮液加入20μ1 Α0-ΕΒ混合液(Α0-ΕΒ試劑使用方法見說明書），避光染色3-5分鐘后，制片于 熒光顯微鏡下觀察拍照。
[0061] 吖啶橙(Α0)能透過胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA，與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出綠色 熒光，溴化乙錠(ΕΒ)僅能透過胞膜受損的細(xì)胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn) 為染色增強，熒光更為明亮，均勻一致的圓狀或固縮狀、團塊狀結(jié)構(gòu)。非凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)熒 光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征。二者很容易判別。在熒光顯微鏡下觀察，可見四種細(xì)胞形態(tài):活 細(xì)胞(VN)，核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)；早期凋亡細(xì)胞(VA)，核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或 圓珠狀;晚期凋亡細(xì)胞(NVA)，核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀;非凋亡的死亡細(xì)胞 (NVN)，核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖3所示，空白對照組和陰性對照組細(xì)胞形 態(tài)與正常實驗組有明顯差別，有顯著性差異(Ρ〈〇.05)。
[0062] 上述實驗結(jié)果說明在體外NCI-H460細(xì)胞中，EGFR siRNA可以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。 [0063] 實施例4:實施例1中第二條EGFR siRNA在體外對NCI-H460細(xì)胞EGFR基因表達(dá)的影 響
[0064] 一、分組轉(zhuǎn)染
[0065] 將NCI-H460細(xì)胞均勻鋪在6孔板種，分為3組：
[0066] 空白對照組：含有10% (體積分?jǐn)?shù)含量）滅活的胎牛血清的DMEM basic(IX)培養(yǎng) 液。
[0067] EGFR siRNA正常實驗組:含有10% (體積分?jǐn)?shù)含量)滅活的胎牛血清的DMEM basic (IX)培養(yǎng)液;轉(zhuǎn)染1 OOprno 1實施例1中第二條EGFR siRNA。
[0068] 陰性對照組:含有10% (體積分?jǐn)?shù)含量)滅活的胎牛血清DMEM basic(lX)培養(yǎng)液； 轉(zhuǎn)染lOOpmol實施例1中的陰性對照siRNA。
[0069] 三組細(xì)胞先常規(guī)培養(yǎng)24h，然后根據(jù)組別進(jìn)行轉(zhuǎn)染(按Lipofectamine?2000試劑說 明書操作），轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)6h后，根據(jù)組別更換相應(yīng)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后進(jìn)行實驗； 培養(yǎng)條件:置于37 °C、5 % C02、飽和濕度的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0070] 二、Western blotting檢測EGFR蛋白的表達(dá)
[0071]移除干凈6孔板中的培養(yǎng)液，用冷PBS洗滌2次，收集細(xì)胞后充分裂解，4°C、12000轉(zhuǎn) 離心15min，收集上部澄清裂解液后使用BCA蛋白測定試劑盒測定3組裂解液的蛋白濃度，按 裂解液比Loading Buf f er為4:1混勻，與100°C加熱變性5min，按每個泳道30yg總蛋白量換 算上樣體積上樣，行10 % SDS-PAGE電泳，待蛋白充分分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于含5 %脫 脂奶粉TBST的封閉液中，室溫封閉lh，取出膜用IX TBST溶液洗膜5次，每次5min，將裁剪好 的膜分別置于EGFR-抗（1:5000稀釋)和內(nèi)參β-actin-抗（1:800稀釋)4°C孵育過夜，然后 用IX TBST洗膜5次，每次5min，分別與抗兔IgG二抗（1:3000稀釋）、抗鼠 IgG二抗（1:3000稀 釋)室溫孵育2h，將膜與化學(xué)發(fā)光液孵育后進(jìn)行顯色，使用紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。檢測各 組EGFR蛋白和內(nèi)參β-act in蛋白所對應(yīng)的條帶A值，然后將AECFR/Afiitin的比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分 析(Quantity One軟件）。
[0072] 結(jié)果如圖4、圖5。與陰性對照組比較，EGFR siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)下 調(diào)。
[0073] 實施例5:實施例1中第二條EGFR siRNA在體外對NCI-H460細(xì)胞凋亡的影響 [0074] 一、分組轉(zhuǎn)染
[0075] 將NCI-H460細(xì)胞均勻鋪在6孔板中，分為3組。具體分組同實施例4的步驟一。
[0076] 二、EGFR siRNA在體外對NCI-H460細(xì)胞凋亡的影響
[0077]消化各組細(xì)胞并收集，用冷PBS清洗2次后，在用新鮮冷PBS懸浮細(xì)胞，按lml細(xì)胞懸 浮液加入20μ1 Α0-ΕΒ混合液(Α0-ΕΒ試劑使用方法見說明書），避光染色3~5分鐘后，制片于 熒光顯微鏡下觀察拍照。
[0078] 吖啶橙(Α0)能透過胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA，與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出綠色 熒光，溴化乙錠(ΕΒ)僅能透過胞膜受損的細(xì)胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn) 為染色增強，熒光更為明亮，均勻一致的圓狀或固縮狀、團塊狀結(jié)構(gòu)。非凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)熒 光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征。二者很容易判別。在熒光顯微鏡下觀察，可見四種細(xì)胞形態(tài):活 細(xì)胞(VN)，核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)；早期凋亡細(xì)胞(VA)，核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或 圓珠狀;晚期凋亡細(xì)胞(NVA)，核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀;非凋亡的死亡細(xì)胞 (NVN)，核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖6所示，空白對照組和陰性對照組細(xì)胞形 態(tài)與正常實驗組有明顯差別。
[0079] 上述實驗結(jié)果說明在體外NCI-H460細(xì)胞中，EGFR siRNA可以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
[0080] 實施例6:實施例1中第三條EGFR SiRNA在體外對NCI-H460細(xì)胞EGFR基因表達(dá)的影 響
[0081 ] 一、分組轉(zhuǎn)染
[0082] 將NCI-H460細(xì)胞均勻鋪在6孔板種，分為3組：
[0083] 空白對照組：含有10% (體積分?jǐn)?shù)含量）滅活的胎牛血清的DMEM basic(IX)培養(yǎng) 液。
[0084] EGFR siRNA正常實驗組:含有10% (體積分?jǐn)?shù)含量)滅活的胎牛血清的DMEM basic (1X)培養(yǎng)液;轉(zhuǎn)染1 OOprno 1實施例1中第三條EGFR s iRNA。
[0085] 陰性對照組:含有10% (體積分?jǐn)?shù)含量)滅活的胎牛血清DMEM basic(lX)培養(yǎng)液； 轉(zhuǎn)染lOOpmol實施例1中的陰性對照siRNA。
[0086] 三組細(xì)胞先常規(guī)培養(yǎng)24h，然后根據(jù)組別進(jìn)行轉(zhuǎn)染(按Lipofectamine?2000試劑說 明書操作），轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)6h后，根據(jù)組別更換相應(yīng)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后進(jìn)行實驗； 培養(yǎng)條件:置于37 °C、5 % C02、飽和濕度的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0087] 二、Western blotting檢測EGFR蛋白的表達(dá)
[0088]移除干凈6孔板中的培養(yǎng)液，用冷PBS洗滌2次，收集細(xì)胞后充分裂解，4°C、12000轉(zhuǎn) 離心15min，收集上部澄清裂解液后使用BCA蛋白測定試劑盒測定3組裂解液的蛋白濃度，按 裂解液比Loading Buf f er為4:1混勻，與100°C加熱變性5min，按每個泳道30yg總蛋白量換 算上樣體積上樣，行10 % SDS-PAGE電泳，待蛋白充分分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于含5 %脫 脂奶粉TBST的封閉液中，室溫封閉lh，取出膜用IX TBST溶液洗膜5次，每次5min，將裁剪好 的膜分別置于EGFR-抗（1:5000稀釋)和內(nèi)參β-actin-抗（1:800稀釋)4°C孵育過夜，然后 用IX TBST洗膜5次，每次5min，分別與抗兔IgG二抗（1:3000稀釋）、抗鼠 IgG二抗（1:3000稀 釋)室溫孵育2h，將膜與化學(xué)發(fā)光液孵育后進(jìn)行顯色，使用紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。檢測各 組EGFR蛋白和內(nèi)參β-act in蛋白所對應(yīng)的條帶A值，然后將AECFR/Afiitin的比值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分 析(Quantity One軟件）。
[0089] 結(jié)果如圖7、圖8。與陰性對照組比較，EGFR siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)下 調(diào)。
[0090] 實施例7:實施例1中第三條EGFR siRNA在體外對NCI-H460細(xì)胞凋亡的影響 [0091] 一、分組轉(zhuǎn)染
[0092] 將NCI-H460細(xì)胞均勻鋪在6孔板中，分為3組。具體分組同實施例6的步驟一。
[0093] 二、EGFR siRNA在體外對NCI-H460細(xì)胞凋亡的影響
[0094]消化各組細(xì)胞并收集，用冷PBS清洗2次后，在用新鮮冷PBS懸浮細(xì)胞，按lml細(xì)胞懸 浮液加入20μ1 Α0-ΕΒ混合液(Α0-ΕΒ試劑使用方法見說明書），避光染色3~5分鐘后，制片于 熒光顯微鏡下觀察拍照。
[0095] 吖啶橙(Α0)能透過胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA，與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出綠色 熒光，溴化乙錠(ΕΒ)僅能透過胞膜受損的細(xì)胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn) 為染色增強，熒光更為明亮，均勻一致的圓狀或固縮狀、團塊狀結(jié)構(gòu)。非凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)熒 光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征。二者很容易判別。在熒光顯微鏡下觀察，可見四種細(xì)胞形態(tài):活 細(xì)胞(VN)，核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)；早期凋亡細(xì)胞(VA)，核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或 圓珠狀;晚期凋亡細(xì)胞(NVA)，核染色質(zhì)為橘紅色并呈固縮狀或圓珠狀;非凋亡的死亡細(xì)胞 (NVN)，核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖9所示，空白對照組和陰性對照組細(xì)胞形 態(tài)與正常實驗組有明顯差別。
[0096] 上述實驗結(jié)果說明在體外NCI-H460細(xì)胞中，EGFR siRNA可以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
【主權(quán)項】
1. 抑制EGFR基因表達(dá)的s iRNA，其特征在于：其核苷酸序列為以下雙鏈RNA分子中的任 意一種： 正義鏈:5 ' -GCAGAUCAUCAGAGGAAAU-3 '，反義鏈:5 ' -AUUUCCUCUGAUGAUCUGC-3 ' ； 正義鏈:5 ' -CCAAGGAAGCCAAGCCAAA-3 '，反義鏈:5 ' -UUUGGCUUGGCUUCCUUGG-3 ' ； 正義鏈:5 ' -GGAGAUAAGUGAUGGAGAU-3 '，反義鏈:5 ' -AUCUCCAUCACUUAUCUCC-3，。2. 權(quán)利要求1所述抑制EGFR基因表達(dá)的siRNA在制備預(yù)防或治療人類表皮生長因子受 體相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的疾病為肺癌。4. 降低人非小細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞生長增殖率的方法，其特征在于:將權(quán)利要求1所 述siRNA導(dǎo)入目的細(xì)胞，使目的細(xì)胞的生長增殖速率下降。
【文檔編號】A61K48/00GK105985961SQ201610583517
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2016年7月22日
【發(fā)明人】張國海, 彭艷, 吳亦明, 曾淑蘭
【申請人】廣西師范大學(xué)