基因vii型新城疫病毒株、其疫苗組合物、制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了具有良好免疫原性的基因VII型新城疫病毒株以及由該新城疫病毒株傳代致弱的弱毒株，所述新城疫病毒株F基因含有實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID NO.2所示蛋白序列的核苷酸序列，以及所述病毒株HN基因含有實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID NO.6所示的蛋白序列的核苷酸序列。本發(fā)明提供的新城疫病毒株，其毒力強(qiáng)、在雞胚上生長速度快，相比于常規(guī)新城疫疫苗株，具有安全性好、免疫保護(hù)能力強(qiáng)、免疫效力高等優(yōu)點(diǎn)。CCTCC NO: V 20143520141106
【專利說明】
基因 VI I型新城疫病毒株、其疫苗組合物、制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種基因 VII型新城疫病毒株強(qiáng)毒株、由其通過反向遺傳技術(shù)致弱的 弱毒疫苗株，本發(fā)明還涉及由該弱毒株制備的疫苗組合物以及該疫苗組合物的制備方法和 應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 新城疫是由新城疫病毒引起的多種禽類發(fā)生高度死亡的一種重要傳染病。新城疫 病毒在中國已存在幾十年，近年來由于疫苗的廣泛使用，新城疫的發(fā)病率和死亡率均得到 了較好的控制，但自90年代初以來，非典型新城疫病爆發(fā)的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，同時(shí)，臨床上新 城疫病毒與其它呼吸道病原體協(xié)同致病的現(xiàn)象也較為常見，因此，新城疫仍然成為當(dāng)前困 擾廣大養(yǎng)殖戶重要疾病之一。從近十年來的新城疫流行特點(diǎn)來看，臨床上所分離到的新城 疫病毒毒株除傳統(tǒng)的I型和II型外，大多數(shù)屬于基因 VII型，而常規(guī)的新城疫疫苗株的基 因型主要為I和II型（如V4、LaSota等），在遺傳距離上新城疫新分離株與常規(guī)新城疫疫 苗株相差較遠(yuǎn)，因此，常規(guī)疫苗對當(dāng)前新城疫病毒強(qiáng)毒株的攻擊并不能提供理想的免疫保 護(hù)效力。
[0003] 然而，不同新城疫病毒分離株之間的毒力差異很大，在雞胚上的生長特性差異明 顯，合適的基因 VII型新城疫病毒株的分離顯得異常困難。因此，需要免疫原性良好的基因 VII型新城疫病毒株來制備疫苗，從而解決上述問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種F基因，所述F基因含有實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID N0. 2所示的蛋白 序列的核苷酸序列。
[0005] 術(shù)語"實(shí)質(zhì)上編碼"指其編碼的蛋白可以通過添加、刪除、替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸 殘基同時(shí)保持其功能和免疫原性。
[0006] 本發(fā)明提供了一種F基因，所述F基因?qū)嵸|(zhì)上含有序列表中SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列。
[0007] 本發(fā)明提供了一種F基因，所述F基因含有實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID N0. 4所示的蛋白序 列的核苷酸序列。本發(fā)明提供了一種F基因，所述F基因?qū)嵸|(zhì)上含有序列表中SEQ ID N0. 3 所示的核苷酸序列。
[0008] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述F基因含有的編碼序列SEQ ID N0. 4是通過將 強(qiáng)毒F裂解位點(diǎn)112R/K-R-Q-K/R-R-F117突變?yōu)槿醵玖呀馕稽c(diǎn)112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117 來實(shí)現(xiàn)的。
[0009] 本發(fā)明提供了一種HN基因，所述HN基因含有實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID N0. 6所示的蛋 白序列的核苷酸序列。
[0010] 本發(fā)明提供了一種HN基因，所述HN基因?qū)嵸|(zhì)上含有序列表中SEQ ID N0. 5所示 的核苷酸序列。
[0011] 本發(fā)明另一目的在于提供一種基因 VII型新城疫病毒株，所述病毒株含有序列表 中SEQ ID N0. 2所示的蛋白序列。
[0012] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明提供的基因 VII型新城疫病毒株進(jìn)一步 含有序列表中SEQ ID N0. 6所示的蛋白序列。
[0013] 本發(fā)明另一目的在于提供一種基因 VII型新城疫病毒株，所述病毒株F基因含有 實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID N0. 2所示蛋白序列的核苷酸序列。
[0014] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明提供的基因 VII型新城疫病毒株HN基因 進(jìn)一步含有實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID N0. 6所示的蛋白序列的核苷酸序列。作為本發(fā)明的一種優(yōu) 選實(shí)施方式，所述病毒株為HN1101株，所述HN1101株生物保藏號為CCTCC N0:V201435。
[0015] 雞新城疫病毒 HN1101 株（Newcastle disease virus，stain HN1101)，保藏號為 CCTCC N0:V 201435;保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為湖北省武漢·武漢大 學(xué)，保藏日期為2014年11月06日。
[0016] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明提供的基因 VII型新城疫病毒株為 HN1101株或其培養(yǎng)物。
[0017] 本發(fā)明又一個(gè)目的在于提供一種基因 VII型新城疫病毒弱毒株，所述弱毒株含有 序列表中SEQ ID N0. 4所示的蛋白序列。
[0018] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述弱毒株為本發(fā)明的所述病毒株F基因變異 為含有實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID N0. 4所示的蛋白序列的核苷酸序列。
[0019] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述弱毒株為所述HN1101株F基因變異為含有 實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID N0. 4所示的蛋白序列的核苷酸序列的致弱株HNllOlFm。
[0020] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的基因 VII型新城疫病毒弱毒疫苗株為HNllOlFm株或其培養(yǎng) 物。
[0021] 術(shù)語"培養(yǎng)物"是病毒的不同代次傳代培養(yǎng)物，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉不同代次之間 其基因序列僅可能會(huì)發(fā)生微小的變異，優(yōu)選地，所述培養(yǎng)物是2-35代以內(nèi)的培養(yǎng)物。
[0022] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明提供的基因 VII型新城疫病毒弱毒疫苗株 HNllOlFm株是基因 VII型新城疫病毒株HN1101株通過反向遺傳技術(shù)將強(qiáng)毒F裂解位點(diǎn) 112R/K-R-Q-K/R-R-F117 突變?yōu)槿醵玖呀馕稽c(diǎn) 112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117 致弱得到的。
[0023] 本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量 的本發(fā)明所述基因 VII型新城疫病毒株抗原和藥學(xué)上可接受的載體。
[0024] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的所述疫苗組合物包括免疫量的HN1101株 抗原和藥學(xué)上可接受的載體。
[0025] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明的所述疫苗組合物包括免疫量的HNllOlFm 株抗原和藥學(xué)上可接受的載體。
[0026] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，上述基因 VII型新城疫病毒株抗原包括減毒活病毒 抗原、滅活病毒抗原、亞單位抗原或合成肽抗原。本發(fā)明所用術(shù)語"疫苗組合物"指含有基因 VII型新城疫病毒免疫原性的藥物組合物，該藥物組合物可誘發(fā)、刺激或增強(qiáng)雞只針對基因 VII型新城疫病毒的免疫反應(yīng)。所述疫苗組合物包括免疫量的基因 VII型新城疫病毒株的 減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗或合成肽疫苗。
[0027] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物包括免疫量的基因 VII型新城疫病毒株HN1101株或其培 養(yǎng)物的減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗或合成肽疫苗。
[0028] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物包括免疫量的基因 VII型新城疫病毒株HNllOlFm株或其 培養(yǎng)物的減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗或合成肽疫苗。
[0029] 本發(fā)明所用的術(shù)語"活疫苗"指的是毒力已經(jīng)減弱但仍可在宿主體內(nèi)或細(xì)胞上復(fù) 制的病毒制備的疫苗。
[0030] 本發(fā)明所用的術(shù)語"減毒"用于指使病原喪失致病性、但保持免疫原性的方式對基 因進(jìn)行突變來人工降低病原體毒性。通常，通過UV輻射、化學(xué)處理或體外連續(xù)高階繼代培 養(yǎng)實(shí)現(xiàn)減毒?；蛘咄ㄟ^人工的基因改變，例如將已知序列中的特定核苷酸缺失或替換以使 毒力減弱。
[0031] 本發(fā)明所用的術(shù)語"滅活疫苗"，也稱作失活疫苗，指的是用作抗原以產(chǎn)生免疫力 的滅活病毒的混懸液。滅活疫苗的例子包括全病毒疫苗和裂解型疫苗。使用已知方法可以 很容易地產(chǎn)生滅活疫苗。例如，通過用甲醛溶液處理病毒可獲得全病毒滅活疫苗。裂解型 疫苗可在用醚處理后由病毒包膜制備得到。例如用本發(fā)明的強(qiáng)毒株HN1101株可以通過滅 活的方法制備成滅活疫苗。
[0032] 本發(fā)明所用的術(shù)語"亞單位疫苗"指的是利用基因工程方法將病原體的保護(hù)性抗 原基因克隆到原核或真核表達(dá)系統(tǒng)中，使其高效表達(dá)而制成的疫苗。它比全病毒疫苗引起 副反應(yīng)的可能性小。例如，表達(dá)的基因 VII型新城疫病毒的F基因、HN基因所編碼的蛋白 可用于制備亞單位疫苗。
[0033] 本發(fā)明所用的術(shù)語"合成肽疫苗"指的是一種僅含免疫決定簇組分的小肽，即用 人工方法按天然蛋白質(zhì)的氨基酸順序合成保護(hù)性短肽，與載體連接后加佐劑所制成的疫 苗。
[0034] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物含有免疫量的基因 VII型新城疫病毒，該基因 VII型新城 疫病毒含有編碼序列表中SEQ ID NO. 2所示氨基酸的核苷酸序列SEQ ID NO. 1、編碼SEQ ID NO. 4所示氨基酸的核苷酸序列SEQ ID NO. 3、編碼SEQ ID NO. 6所示氨基酸的核苷酸序 列 SEQ ID N0. 5。
[0035] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述疫苗組合物含有免疫量的基因 VII型新城疫病 毒，所述基因 VII型新城疫病毒含有蛋白序列為SEQ ID N0. 2、4、6及核苷酸序列為SEQ ID NO. 1、3、5所示的變體。
[0036] "變體"旨在表示基本上類似序列。對于多核苷酸，變體包含在天然多核苷酸之內(nèi) 的一個(gè)或更多位點(diǎn)的一個(gè)或更多核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中一個(gè) 或更多位點(diǎn)的一個(gè)或更多核苷酸的取代。如本文所用，"天然"多核苷酸或多肽分別包含天 然存在的核苷酸序列或蛋白序列。本發(fā)明的特定多核苷酸（即，參照多核苷酸）的變體也 可通過比較由變體多核苷酸編碼的多肽和由參照多核苷酸編碼的多肽之間的百分率序列 同一性來評價(jià)。"變體"蛋白旨在表示通過在天然蛋白中的一個(gè)或更多位點(diǎn)的一個(gè)或更多 氨基酸的缺失或添加，和/或天然蛋白中的一個(gè)或更多位點(diǎn)的一個(gè)或更多氨基酸的取代而 源于天然蛋白的蛋白。本發(fā)明包括的變體蛋白有生物學(xué)活性，即，它們有引發(fā)免疫應(yīng)答的能 力，能對基因 VII型新城疫病毒攻擊具有保護(hù)性反應(yīng)的能力。
[0037] 變體包括等位基因變體。術(shù)語〃等位基因變體〃指稱含有導(dǎo)致蛋白的蛋白序列變 化及在天然的群（例如，病毒物種或變種）之內(nèi)存在的多態(tài)性的多核苷酸或多肽。該天然 的等位基因變異可一般導(dǎo)致多核苷酸或多肽的1%~5%變異。等位基因變體可通過在許 多不同物種中測序目的核酸序列來鑒定，其可通過使用鑒定那些物種中的相同的遺傳座位 的雜交探針來容易進(jìn)行。任何和全部該核酸變異及得到的氨基酸多態(tài)性或是天然的等位基 因變異的結(jié)果且不改變目的基因的功能活性的變異旨在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0038] 術(shù)語"預(yù)防"指通過其與基因 VII型新城疫病毒相關(guān)的感染或疾病的癥狀被阻斷 或延遲；術(shù)語"治療"指通過與基因 VII型新城疫病毒相關(guān)的感染或疾病的癥狀被緩和或完 全消除的過程。
[0039] 術(shù)語"保護(hù)性反應(yīng)"意為在動(dòng)物中預(yù)防基因 VII型新城疫病毒相關(guān)疾病或由基因 VII型新城疫病毒導(dǎo)致的感染的發(fā)作或減輕存在的這樣的疾病的嚴(yán)重性。
[0040] 本發(fā)明涉及的基因 VII型新城疫病毒基因，其有利地激發(fā)動(dòng)物中的保護(hù)性反應(yīng)。 具體地，本發(fā)明實(shí)施方式的基因序列包含與其功能衍生物基本相同的蛋白序列。
[0041] "基本上相同"可以理解為本發(fā)明的基因優(yōu)選地具有這樣的蛋白序列，其與SEQ ID NO :2、4、6中所示的序列的部分或全部具有至少70%同源性，或甚至優(yōu)選地80%同源性，或 甚至更優(yōu)選地90 %同源性，或最優(yōu)選地95 %同源性。
[0042] 在本文中術(shù)語"同源性"還包括與參比序列相同或類似，同時(shí)提供任何氨基酸的簡 單替換/修飾。可以用BLAST-P(基本局部排比檢索工具），本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的程序進(jìn) 行該方面的同源性檢索。對于相應(yīng)的核酸序列，同源性涉及在本領(lǐng)域中已知的BLASTX和 BLASTN 程序。
[0043] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物中基因 VII型新城疫病毒抗原為滅活的所述基因 VII型 新城疫病毒HN1101株全病毒抗原；所述疫苗組合物進(jìn)一步包含佐劑。
[0044] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述基因 VII型新城疫病毒抗原為滅 活的HNllOlFm株全病毒抗原；所述滅活的HNllOlFm株全病毒抗原含量為滅活前 ^ 108-°EID50/0. 1ml 〇
[0045] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述疫苗組合物中所述滅活的HNllOlFm株全 病毒抗原含量為 l〇s'°EID5Q/(X lml ~l(f°EID5Q/(X lml。
[0046] 術(shù)語"佐劑"指加入到本發(fā)明的組合物中以增加組合物的免疫原性的物質(zhì)。已知 的佐劑包括，但不限于：（1)氫氧化錯(cuò)、阜苷（Saponine)(例如QuilA)、阿夫立定、DDA，（2) 丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物的聚合物，或（3)疫苗可以 以水包油、油包水或水包油包水乳劑形式制成。
[0047] 尤其是，乳劑可以基于輕液體石蠟油、類異戊二烯油，例如角鯊?fù)榛蚪酋徬?；烯烴， 特別是異丁烯或癸烯低聚化產(chǎn)生的油，帶直鏈烷基的酸或醇形成的酯，更特別是植物油，油 酸乙基酯，丙二醇二（辛酸酯/癸酸酯），甘油三（辛酸酯/癸酸酯），丙二醇二油酸酯；分 支脂肪酸酯或醇的酯，特別是異硬脂酸酯。油與乳化劑一起使用形成乳劑。乳化劑優(yōu)選 非離子表面活性劑，特別是聚氧乙烯化脂肪酸（例如油酸），脫水山梨糖醇、甘露醇（例如 脫水甘露醇油酸酯）、甘油、聚甘油、丙二醇和可選地乙氧基化的油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸、 羥基硬脂酸形成的酯，脂肪醇和多元醇（例如油醇）的醚，聚氧丙稀-聚氧乙烯嵌段共聚 物，特別是 PluronicR，尤其是 L121(參照 Hunter 等，1995, "The Theory and Practical Application ofAdjuvants"（Steward_Tull，D.E.S 主編）John Wiley andSons，NY，51_94; Todd 等，Vaccine，1997,15, 564-570)〇
[0048] 特別地，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物通過糖或多元醇的聚鏈烯基醚交聯(lián)。這些化 合物被稱作卡波姆。
[0049] 優(yōu)選地，本發(fā)明選用佐劑為白油佐劑，制備油包水乳劑。
[0050] 在最終疫苗組合物中，佐劑的濃度范圍是從10 %到70% V/V，優(yōu)選從30 %到60% V/V，更優(yōu)選 60% V/V。
[0051] 本發(fā)明的疫苗組合物進(jìn)一步包含其他病原體或抗原組合使用以制備抵抗包括基 因 VII型新城疫病毒感染的各種疾病的聯(lián)合疫苗或復(fù)合疫苗。術(shù)語"聯(lián)合疫苗"用于指從本 發(fā)明的基因 VII型新城疫病毒與至少一種不同病毒的病毒混合物制備的疫苗。術(shù)語"復(fù)合 疫苗"指從病毒和細(xì)菌制備的疫苗。例如，本發(fā)明的基因 VII型新城疫病毒可與傳染性支氣 管炎病毒、禽流感病毒、法氏囊病毒、減蛋綜合癥病毒、病毒性關(guān)節(jié)炎病毒和/或大腸桿菌、 滑液囊支原體混合或組合。
[0052] 本發(fā)明疫苗組合物還可以進(jìn)一步將其他的試劑加入到本發(fā)明的組合物。例如，本 發(fā)明的組合物還可以包含試劑，如：藥物，免疫刺激劑（如：α -干擾素 、β -干擾素 、γ -干 擾素、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF)和白介素 2 (IL2))、抗氧化劑、表面活性劑、著色劑、揮發(fā)性油、緩沖劑、分散劑、推進(jìn)劑和防腐劑。為了 制備這樣的組合物，可以使用本領(lǐng)域公知的方法。
[0053] 本發(fā)明的組合物的成分或組分的量優(yōu)選地是治療有效量。所述治療有效量是指在 組合物施用的宿主中發(fā)揮它們的免疫學(xué)作用而不導(dǎo)致過度副作用所必需量。所用的成分和 待施用的組合物的精確的量將根據(jù)因素如治療的疾病的類型，待治療的動(dòng)物的類型和年 齡，施用的方式，以及組合物中的其它成分而變化。
[0054] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物中基因 VII型新城疫病毒抗原含量為滅活前 ^ 108-°EID50/0. 1ml 〇
[0055] 優(yōu)選地，所述疫苗組合物中基因 VII型新城疫病毒抗原含量為滅活 前l(fā)(f°EID5Q/0. lml~l(f°EID5Q/0. lml。當(dāng)基因 VII型新城疫病毒以滅活前少于 10s'°EIDM/0. lml的量使用時(shí)，疫苗不能有效刺激抗體產(chǎn)生。另一方面，超過的量可能是不經(jīng) 濟(jì)的。
[0056] 本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種預(yù)防和/或治療基因 VII型新城疫病毒感染的 疫苗組合物的制備方法，其中，所述方法包括：
[0057] (1)培養(yǎng)增殖所述基因 VII型新城疫病毒；
[0058] (2)滅活所述增殖的基因 VII型新城疫病毒；
[0059] (3)加入佐劑，乳化。
[0060] 本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供所述的新城疫F基因及HN基因在制備預(yù)防和治療 新城疫相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0061] 本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療新城疫相關(guān) 疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0062] 本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)：NDV雖然只有一個(gè)血清型，但是疫苗株和流行株在 基因型和抗原位點(diǎn)上都差異較大；國內(nèi)外研究表明，當(dāng)疫苗株與流行株的基因型一致時(shí)，其 不僅能提供理想的臨床保護(hù)，而且能顯著降低免疫雞的強(qiáng)毒感染率和排毒量，在臨床上可 有效控制免疫雞群中非典型新城疫的發(fā)生；本發(fā)明提供的基因 νπ型新城疫病毒株，其毒力、 在雞胚上生長速度等特性顯著優(yōu)異，克服了基因 w型新城疫病毒株難以分離出合適疫苗株 的困難，免疫效果良好，有利地預(yù)防新城疫病毒的感染。
[0063] 序列表中：
[0064] SEQ ID NO. 1為基因 VII型新城疫病毒F基因的核苷酸序列；
[0065] SEQ ID N0. 2為基因 VII型新城疫病毒F基因的編碼蛋白序列；
[0066] SEQ ID N0. 3為基因 VII型新城疫病毒Fm基因的核苷酸序列；
[0067] SEQ ID N0. 4為基因 VII型新城疫病毒Fm基因的編碼蛋白序列；
[0068] SEQ ID N0. 5為基因 VII型新城疫病毒HN基因的核苷酸序列；
[0069] SEQ ID N0. 6為基因 VII型新城疫病毒HN基因的編碼蛋白序列。
【具體實(shí)施方式】
[0070] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更 為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn) 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0071] 實(shí)施例1基因 VII型新城疫病毒株的分離鑒定
[0072] 1. 1樣品的采集及處理
[0073] 采山東、廣東、四川、江蘇、河南等地雞場發(fā)病死亡雞的腦、心、肝、脾、腎、氣囊等組 織，按照1 :5比例加入生理鹽水或磷酸鹽緩沖液（PBS，PH7. 4)研成乳液，溶液中加入青霉素 (終濃度為l〇〇〇U/ml)和鏈霉素（終濃度為lmg/ml)，37°C作用lh或者4°C過夜，lOOOrpm 離心10min，取上清備用。
[0074] L 2病毒的分離和鑒定
[0075] 將步驟1. 1得到的上清接種9~11日齡SPF雞胚，將接種后24h內(nèi)死胚棄去，于接 種后24h~120h每天照胚，將死亡的雞胚放置于4°C，不死亡的雞胚于接種后120h收獲，取 所有雞胚尿囊液，檢查尿囊液是否具有血凝性（HA)以及這種血凝性能否被新城疫特異抗 血清所抑制（HI)。有血凝性（HA效價(jià)>24,血凝價(jià)低于24再傳一代），血凝性能被新城疫特 異血清所抑制，證明分離到了新城疫病毒，共分離10株新城疫病毒株，分別命名為SD1101、 SD1102、⑶1101、⑶1102、SC1101、SC1102、JS1101、JS1102、HN1101、HN1102。
[0076] 1.3病毒的純化
[0077] 取步驟1. 2鑒定得到的新城疫病毒的樣品用生理鹽水分別進(jìn)行10 6、10 7、10 8、10 9 稀釋，每個(gè)稀釋度經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚3枚，每枚雞胚接種0. lml，石蠟封口后置 37°C孵化器內(nèi)繼續(xù)孵化，每天照蛋觀察雞胚的死亡情況。將接種后24h內(nèi)死胚棄去，將死亡 的雞胚和接種后5天未死的雞胚測HA，取最高稀釋度中HA效價(jià)較高的感染胚收獲雞胚尿囊 液。以同樣的方法進(jìn)行三次純化。
[0078] 1. 4病毒的遺傳進(jìn)化分析
[0079] 參照姚春峰碩士論文《我國部分地區(qū)新城疫病毒的部分生物學(xué)特性鑒定及分子流 行病學(xué)研究》論文的方法設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增F基因的引物：
[0080] NDV F-F:GCCGAATTCCCGAATCATCACGACGCTTAA,
[0081] NDV F-R:GTGAAGCTTGAGTCTGTGAGTCGTAC
[0082] 擴(kuò)增出來的PCR片段克隆入pEasy-blunt vector，送測序公司測NDV分離株的F 基因，采用NJ方法（Neighbor-joining Method，鄰接法）構(gòu)建分離株遺傳進(jìn)化樹，并進(jìn)行基 因分型，結(jié)果僅有3株為基因 W型新城疫病毒株，其他3株為基因 I型，，4株為基因 II型。 具體結(jié)果見表1。
[0083] 表1新城疫病毒分離株基因型鑒定結(jié)果
[0084]
[0085] 雖然非典型性新城疫時(shí)有發(fā)生，但從以上結(jié)果可以看出，不同地區(qū)分離的新城疫 病毒，基因 W型新城疫病毒株分離率依然較低，只有30%。
[0086] 1. 5.基因 W型新城疫病毒株進(jìn)一步篩選
[0087] 測定步驟1. 4中鑒定出的3株基因 W型新城疫病毒株的血凝價(jià)（HA)、雞胚平均致 死時(shí)間（MDT)、1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI)和雞胚半數(shù)致死量（ELD50)。具體方法 如下。
[0088] 血凝價(jià)測定按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行測定。
[0089] 雞胚平均致死時(shí)間（MDT)測定方法：
[0090] (1)將新鮮感染的尿囊液用滅菌的生理鹽水連續(xù)10倍遞增稀釋成10 6~10 9;
[0091] (2)每個(gè)稀釋度尿囊腔接種10枚9~11日齡SPF雞胚，每枚接種0. 1ml，置37°C 培養(yǎng)；
[0092] (3)每日照蛋4次，連續(xù)觀察7天，記錄各雞胚死亡時(shí)間；
[0093] (4)最小致死量是指能引起所有用此稀釋度接種的雞胚死亡的最大稀釋度；
[0094] (5)MDT是指最小致死量引起所有雞胚死亡的平均時(shí)間（小時(shí)）。
[0095] 1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI)的測定方法：
[0096] (1)將HA滴度大于41og2的新鮮感染尿囊液，用等滲無菌生理鹽水作10倍稀釋；
[0097] (2)將稀釋后的尿囊液腦內(nèi)接種于出殼后24~40h之間的SPF雛雞，每份樣品接 種10只，每只接種0. 05ml，并設(shè)PBS陰性對照組和標(biāo)準(zhǔn)毒株陽性對照組；
[0098] (3)每24h觀察一次，共觀察8天；
[0099] (4)每天觀察并給雞打分，正常記作0,病雞記作1，死雞作2 (不能采食、飲水的雞 只應(yīng)剖殺，并在下次觀察時(shí)記作死亡，每只死雞在其死后的每日觀察中仍記為2);
[0100] (5) ICPI是每只雞8天內(nèi)每次觀察分值的平均數(shù)（最強(qiáng)毒力病毒的ICPI將接近最 大值2. 0,而溫和型毒株的值近于0)。
[0101] 雞胚半數(shù)致死量測定（ELD50):
[0102] 取待測病毒用生理鹽水進(jìn)行10 6、10 \ 10'10 9稀釋，每個(gè)稀釋度接胚5枚，分 別經(jīng)尿囊腔接種9-11日齡SPF雞胚，每個(gè)雞胚接種0. lml，石蠟封口后置37 °C孵化器內(nèi) 孵化，每天照蛋將死亡雞胚置于4°C，逐日連續(xù)觀察120h，測定所有雞胚尿囊液的HA，根據(jù) Reed-Muench法計(jì)算每個(gè)毒株的ELD50。
[0103] 結(jié)果：對分離的三株基因 W型新城疫病毒進(jìn)行了生長特性和毒力的測定，結(jié)果顯 不三株病毒在雞胚上生長狀況不一，雖然三株病毒均為強(qiáng)毒或者中強(qiáng)毒，但從病毒的生長 特性上來看，HN1101株的生長速度明顯快于其他兩個(gè)毒株，而且HA滴度也明顯高于其他兩 個(gè)毒株，毒力也是最強(qiáng)的，具體結(jié)果見表2。
[0104] 表2基因 W型新城疫病毒株進(jìn)一步篩選
[0105]
[0106] 證明基因 W型新城疫病毒HN1101株是一株典型的基因 W型新城疫病毒強(qiáng)毒株， 其毒力、在雞胚上生長速度等特性明顯高于其他兩株病毒。從不同地區(qū)篩選的10株新城疫 病毒，最終只篩選出一株合適的基因 w型新城疫病毒，進(jìn)一步說明合適的基因 w型新城疫 病毒篩選的難度?；诨?W型新城疫病毒HN1101株各方面指標(biāo)的優(yōu)異，所以選擇HN1101 株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
[0107] 實(shí)施例2HN1101株新城疫病毒主要免疫原性基因測定
[0108] 2. 1HN1101株新城疫病毒RNA的抽提
[0109] 利用Trizol法抽提雞胚尿囊液中的病毒基因組RNA,詳細(xì)步驟如下：
[0110] (1)取雞胚尿囊液 250 μ1，加入 750 μ1 Trizol(invitrogen，USA)，振蕩混勻，室 溫放置5分鐘；
[0111] (2)每管加入氯仿200 μ 1，蓋緊離心管，劇烈振蕩離心管15秒，室溫放置10分鐘， 12000rpm離心15分鐘；
[0112] (3)取上層水相放置于新的離心管中，加入700 μ 1異丙醇，4°C放置10分鐘， 12000rpm離心10分鐘；
[0113] (4)棄掉上清液，按每毫升Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混勻， 4°C下12000rpm離心5分鐘；
[0114] (5)小心棄去上清液，室溫干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會(huì)降低RNA的 溶解度；最后將RNA溶于水中。
[0115] 2. 2病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄
[0116] 在20 μ 1反轉(zhuǎn)錄體系中（見表3)，依次加入以下成分：M-MLV Reverse Trascriptase (購自北京全式金生物技術(shù)有限公司）1. 0 μ 1，RNase inhibitor (購自北京 全式金生物技術(shù)有限公司）〇· 5 μ 1，5XM-MLV buffer4. 0 μ 1，dNTP(2. 5mM)2. 0 μ l，6nts primers (lOpmol) 1 μ 1，新城疫病毒RNA 11. 5 μ 1，混勻后置PCR儀中42°C lh進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接用于PCR或者4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0117] 表3反轉(zhuǎn)錄體系
[0118]

[0119] 2. 3PCR擴(kuò)增F和HN基因
[0120] 參照Genbank上NDV的F基因和HN基因測序，設(shè)計(jì)擴(kuò)增F基因的引物和HN基因 的引物分別為：
[0121] NDFM-F 5' -TGCTCACTCCTCTTGGCGACTC-3'
[0122] NDFM-R 5' -TGCCCAAGAGTTGAGTCTGTGA-3'
[0123] NDHN-F 5' -GAACTCATAGTGGACGACATCA-3'
[0124] NDHN-R 5' -AACCATACACGGTCGTCAATA-3'
[0125] 按照表4的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。
[0126] 表4 PCR反應(yīng)體系
[0127]
[0128] PCR擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性95°C，5min ;變性98°C，30s ;退火55°C，30s ;延伸72°C， 2min ;運(yùn)行30個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸lOmin，同時(shí)設(shè)無模板的陰性對照，反應(yīng)結(jié)束后在 1 %瓊脂糖凝膠上電泳后，切下目的條帶，用于回收。
[0129] 2. 4PCR產(chǎn)物回收
[0130] 電泳結(jié)束后在紫外光下從凝膠上切下含有目的片段的瓊脂糖凝膠，用DNA快速回 收試劑盒（E. N. Z. A.)回收DNA。方法如下：切下含有目的DNA的凝膠，放入一無菌的1. 5ml 的EP管中，加入3倍體積binding buffer，于50_60°C水浴中5min，其間輕彈EP管，使凝膠 完全溶化。然后將溶化的液體加入到回收柱內(nèi)，lOOOOrpm離心lmin，倒掉收集管中廢液，加 入 300 μ 1 binding buffer，lOOOOrpm離心 lmin，倒掉收集管中廢液，用 500ml wash buffer lOOOOrpm離心洗柱子兩次，倒掉廢液后空離lmin，與柱子中央加入15-30 μ 1 ddH20,室溫靜 置2min，12000rpm離心2min，收集管中即為回收的DNA片段。
[0131] 2. 5連接反應(yīng)
[0132] 收回的PCR產(chǎn)物直接連接到pEASY-blunt vector (購自北京全式金生物技術(shù)有限 公司）中，連接體系和條件為：PCR產(chǎn)物4yl，pEASY-blunt vector ΙμL，輕輕混勻后，室溫 (20-37Γ )反應(yīng)5min，反應(yīng)結(jié)束后，將離心管至于冰上準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。
[0133] 2. 6連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
[0134] 加連接產(chǎn)物與50 μ 1 transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中（在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時(shí)加入 連接產(chǎn)物），輕彈混勻后，冰浴20-30min ;42°C熱激30S，立即置于冰上2min ;加入250 μ 1平 衡至室溫的 S0B 或者 LB，200 轉(zhuǎn)，37°C孵育 lh ;取 8 μ l，500mM IPTG，40 μ l，20mg/ml X-gal 混勻后，均勻地涂于準(zhǔn)備好的平板上，在37°C放置30min ;待IPTG，X-gal被吸收后，取 200 μ 1菌液鋪板，培養(yǎng)過夜。
[0135] 2. 7PCR方法鑒定陽性重組子
[0136] 挑選白色克隆至10 μ 1無菌水中，渦旋混勻；25 μ 1反應(yīng)體系中，取1 μ 1混合液 用作PCR反應(yīng)的模板，用M13F和M13R鑒定重組子；PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性lOmin (裂 解細(xì)胞，失活核酸酶），94°C變性30S，55°C退火30S，72°C延伸（根據(jù)片段的大小確定延伸 時(shí)間）。30個(gè)循環(huán)，72°C后延伸10分鐘，確定包含重組子的克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后菌液用M13F， M13R引物測序。
[0137] 2. 8序列測定和分析
[0138] 序列送Invitrogen測序后，應(yīng)用DNASTAR分析結(jié)果，結(jié)果顯示序列為基因 W型新 城疫病毒的F基因和ΗΝ基因，序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 5。
[0139] 實(shí)施例3HN1101株新城疫病毒株的致弱
[0140] 參照揚(yáng)州大學(xué)胡順林的博士論文鵝源新城疫病毒反向遺傳技術(shù)平臺的建立及其 應(yīng)用和新城疫La Sota疫苗株反向遺傳操作系統(tǒng)及其應(yīng)用（專利公開號：CN 1772909A)采 用分段克隆的方法建構(gòu)全基因組cDNA克隆（轉(zhuǎn)錄載體），并分別擴(kuò)增克隆NP、P與L到真 核表達(dá)載體pCI-neo中為NDV拯救的輔助質(zhì)粒。NDV的拯救過程是將構(gòu)建全基因組cDNA克 隆和含基因 NP、P與L的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達(dá)T7RNA聚合酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在輔助質(zhì)粒提 供有關(guān)酶的作用下，cDNA克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生基因組正義單鏈RNA，輔助質(zhì)粒表達(dá)的聚合酶 蛋白包裹該基因組正義單鏈RNA，形成核糖核蛋白復(fù)合體（RNPs)，然后以RNPs形式復(fù)制成 基因組負(fù)義單鏈RNA，由此進(jìn)入NDV的正常生命循環(huán)，病毒各基因表達(dá)出相應(yīng)的病毒蛋白后 通過出芽方式組裝成有感染性的病毒粒子，然后通過接種雞胚或敏感等細(xì)胞來擴(kuò)增"人工 制造"的病毒粒子而獲得大量拯救的NDV。
[0141] 像其它大多數(shù)RNA病毒的反向遺傳研究一樣，通過對NDV基因組cDNA克隆進(jìn)行有 目的的人工改造，便可對改造后的病毒進(jìn)行各種表型研究，例如，對NDV基因組中的強(qiáng)毒F 裂解位點(diǎn) 112R/K-R-Q-K/R-R-F117 突變?yōu)槿醵玖呀馕稽c(diǎn) 112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117,獲得 F 裂解位點(diǎn)為弱毒株的NDV命名為NDV HNllOlFm。
[0142] 實(shí)施例4HN1101Fm株新城疫病毒弱毒株的生物學(xué)特性比較
[0143] 參考實(shí)施例1列舉的方法測定HNllOlFm株與HN1101株新城疫病毒株的生物學(xué)特 性，結(jié)果見表5。
[0144] 表5 HNllOlFm株新城疫病毒弱毒株的生物學(xué)特性比較
[0145]
[0146] 結(jié)果顯示，將裂解位點(diǎn)強(qiáng)毒F裂解位點(diǎn)112R/K-R-Q-K/R-R-F117突變?yōu)槿醵玖呀?位點(diǎn)112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117獲得的NDV HNllOlFm病毒生長特性不受影響，而毒力卻大 幅度下降。
[0147] 說明NDV HNllOlFm的生長特性較快和低毒力的特性適合作為疫苗進(jìn)行后續(xù)研究。
[0148] 實(shí)施例5HN1101Fm株新城疫病毒滅活疫苗制備
[0149] NDV HNllOlFm株E4代毒種用滅菌生理鹽水稀釋10, 000倍，接種10日齡SPF雞胚 20枚，每胚接種0. lml，置37°C繼續(xù)孵育。將接種后24h內(nèi)死胚棄去，24h~96h死胚及時(shí) 放4°C，96h收混合樣，經(jīng)濃縮后，測定制苗毒的HA和EID 5。分別為10和109·5ΕΙ05(]/0. lml。 將測定好效價(jià)的新城疫病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計(jì)量加入10 %甲醛溶液，開啟攪拌機(jī)攪拌，使 其充分混合，甲醛的最終濃度為0. 1%，37°C滅活16小時(shí)。
[0150] 按照表6組分配比，將滅活完全的病毒液徐徐加入到白油佐劑中，同時(shí)開動(dòng)電 機(jī)，以4000r/min攪拌30~40分鐘，在終止攪拌前加入1 %硫柳汞溶液，使其最終濃度為 0· 01%〇
[0151] 表6 HNllOlFm株新城疫滅活疫苗配比
[0152]
[0153] 實(shí)施例6HN1101Fm株新城疫病毒滅活疫苗效力試驗(yàn)
[0154] 取30日齡的SPF雞30只，分成3組，每組10只，第1組和第2組分別胸部肌肉注 射免疫實(shí)施例5制備的疫苗1和疫苗2,免疫劑量為20 μ 1，第3組不免疫作為對照。所有試 驗(yàn)雞均隔離飼養(yǎng)，免疫21日后，連同對照組采血分離血清，測定HI抗體效價(jià)，同時(shí)用ΗΝ1101 株10 5EID5。/只的劑量肌肉注射攻擊，觀察14日，記錄發(fā)病、死亡及保護(hù)數(shù)。結(jié)果見表7。
[0155] 表7 HNllOlFm株新城疫病毒滅活疫苗效力試驗(yàn)結(jié)果
[0156]
[0157] 注：HI抗體測定為免疫雞抗體的幾何平均數(shù)，表示為X土 SD，X代表平均數(shù)，SD代表 離散度。
[0158] 結(jié)果顯示，疫苗1和疫苗2組在免疫后21天均能產(chǎn)生較高的抗體，而且兩組和對 照相比，可以完全保護(hù)強(qiáng)毒的攻擊。
[0159] 證明了疫苗1和疫苗2均能保護(hù)致死劑量的強(qiáng)毒攻擊，疫苗含量不小于 10&°EID 5Q/0. lml即可提供對雞群的完全保護(hù)。
[0160] 實(shí)施例7La Sota株新城疫病毒滅活疫苗的制備
[0161] 取La Sota株E6代毒種按照實(shí)施例5的制備方法制備La Sota株新城疫病毒滅 活疫苗，疫苗組分含量見表8。
[0162] 表8 La Sota株新城疫滅活疫苗配比
[0163]
[0164] 實(shí)施例8HN1101Fm株新城疫病毒滅活疫苗免疫原性對比試驗(yàn)
[0165] 取實(shí)施5制備的疫苗1及實(shí)施例7制備的疫苗3分別免疫21~28日齡SPF雞， 疫苗1免疫20只雞，疫苗3免疫20只雞，20 μ 1/只，共40只，對照組10只雞，胸部肌肉注 射，免前、免后21日和28日對全部雞只采血分離血清，進(jìn)行HI抗體效價(jià)測定（自身抗原）。 免后28日，用HN1101株和F48E9攻毒，攻毒劑量10 5ELD5。，滴鼻點(diǎn)眼進(jìn)行攻毒，攻毒后每天 觀察，觀察14日，記錄免疫組和攻毒對照組雞只食欲、糞便、發(fā)病癥狀及有無死亡，在攻毒 后第5天分別采集免疫組每只雞的喉頭和泄殖腔拭子，將所有的喉頭和泄殖腔拭子分別接 胚，每個(gè)拭子接胚3枚進(jìn)行病毒分離，雞胚液HA > 0即判為病毒分離陽性。陰性樣本需盲 傳一代后再進(jìn)行判定。試驗(yàn)分組情況見表9。
[0166] 表9試驗(yàn)分組情況
[0167]
[0168] 疫苗1免疫組免疫后21日至28日HI抗體平均值達(dá)到了 1 : 64以上，且對照組 雞均不高于1 : 4。說明疫苗的血清學(xué)方法檢驗(yàn)結(jié)果均達(dá)到了現(xiàn)在疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而且在 免疫后28天疫苗1對自身抗原產(chǎn)生的HI抗體較疫苗3高。具體結(jié)果見表10。
[0169] 表10免疫后7天、14天、21天和28天HI抗體檢測情況
[0170]
[0171] 各免疫組攻毒后觀察14天，各免疫組均未見發(fā)病或死亡，均達(dá)到了現(xiàn)在NDV疫苗 的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。攻毒后第5天采集喉頭和泄殖腔棉拭子，分別進(jìn)行病毒分離檢測排毒，陰性樣 品盲傳一代。HNllOlFm結(jié)果各免疫組均未見排毒。對照組存活雞兩種拭子樣品均為排毒陽 性。具體結(jié)果見表11、12。
[0172] 表11攻毒保護(hù)結(jié)果
[0173]
[0174] 表12攻毒第5天喉頭和泄殖腔的排毒情況
[0175]
[0176] 注："/"表示此項(xiàng)無內(nèi)容；"+A"表示喉頭和泄殖腔排毒均為陽性；"一"表示喉頭 和泄殖腔排毒均為陰性。
[0177] 結(jié)論：免疫后第7天可以檢測到抗體，免疫28天后抗體滴度較高，而且NDV HNllOlFm較經(jīng)典疫苗株La Sota抗體稍高，NDV HNllOlFm免疫后可以完全保護(hù)野毒和標(biāo) 準(zhǔn)強(qiáng)毒F48E9的攻擊，說明本發(fā)明的疫苗組合物不僅能夠預(yù)防基因 VII型NDV的感染且對 經(jīng)典NDV也能有效免疫，并較La Sota免疫組保護(hù)率更高，而且比La Sota免疫組攻毒后相 比，無排毒。
[0178] 實(shí)施例9新城疫重組火雞皰疹病毒疫苗的制備及其效力試驗(yàn)
[0179] 參考中國專利CN1774264A中重組火雞皰疹病毒的制備方法，將新城疫編碼SEQ ID N0. 2所示的蛋白序列的核苷酸序列、編碼SEQ ID N0. 4所示的蛋白序列的核苷酸序列、 編碼SEQIDN0.6所示的蛋白序列的核苷酸序列分別插入到火雞皰疹病毒FC126株（ATCC VR-584B) UL44與UL46之間的0RF間區(qū)域，分別得到重組病毒rHVT-F、rHVT-Fm和rHVT-HN。
[0180] 以2000PFU/100 μ L/只的劑量將重組病毒rHVT-F、rHVT-Fm和rHVT-HN分別皮下 接種10只1日齡SPF雞，同時(shí)設(shè)立對照組。接種后六周，用10 5ELD5。劑量的新城疫HN1101 株肌肉注射，觀察發(fā)病情況。
[0181] 表13重組火雞皰疹病毒疫苗效力試驗(yàn)結(jié)果
[0182]
[0183] 結(jié)果表明，本發(fā)明編碼SEQ ID N0. 2、SEQ ID N0. 4及SEQ ID N0. 6所示的蛋白具 有良好的免疫原性，利用該基因制備的重組活載體疫苗能夠較好的抵抗流行毒株的攻擊。
[0184] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，雖 然本發(fā)明已以優(yōu)選實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動(dòng)或修 飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí) 質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍 內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種F基因，所述F基因含有實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID NO. 2所示的蛋白序列的核苷酸序 列。2. -種F基因，所述F基因含有實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID NO. 4所示的蛋白序列的核苷酸序 列。3. -種HN基因，所述HN基因含有實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID NO. 6所示的蛋白序列的核苷酸 序列。4. 一種基因 VII型新城疫病毒株，其特征在于，所述病毒株F基因含有實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID NO. 2所示蛋白序列的核苷酸序列，以及所述病毒株HN基因含有實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID NO. 6 所示的蛋白序列的核苷酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的病毒株，其特征在于，所述病毒株為HN1101株，所述HN1101 株生物保藏號為CCTCC NO :V201435。6. -種基因 VII型新城疫病毒的弱毒株，其特征在于，所述弱毒株為權(quán)利要求4或5 任一項(xiàng)所述病毒株F基因變異為含有實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID NO. 4所示的蛋白序列的核苷酸序 列；優(yōu)選地，所述弱毒株為權(quán)利要求5中所述HN1101株F基因變異為含有實(shí)質(zhì)上編碼SEQ ID NO. 4所示的蛋白序列的核苷酸序列的致弱株HNllOlFm株。7. -種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的權(quán)利要求4~6任一項(xiàng)所述基 因 VII型新城疫病毒株抗原和藥學(xué)上可接受的載體；所述基因 VII型新城疫病毒株抗原包 括減毒活病毒抗原、滅活病毒抗原、亞單位抗原或合成肽抗原。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗組合物，其中，所述基因 VII型新城疫病毒抗原為 滅活的HN1101 Fm株全病毒抗原；所述滅活的HN1101 Fm株全病毒抗原含量為滅活前 彡l(f°EID5Q/0. lml ;優(yōu)選地，所述疫苗組合物中所述滅活的HN1101 Fm株全病毒抗原含量 為 10s.°EID5(]/0· lml ~109.°EID5(]/0· lml。9. 一種制備權(quán)利要求7所述的疫苗組合物的方法，其中，所述方法包括： (1) 培養(yǎng)增殖所述基因 VII型新城疫病毒； (2) 滅活所述增殖的基因 VII型新城疫病毒； (3) 加入佐劑，乳化。10. 根據(jù)權(quán)利要求7~8任一項(xiàng)所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療新城疫相關(guān)疾病 的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/14GK105985966SQ201510099834
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月6日
【發(fā)明人】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 王同燕, 田克恭
【申請人】普萊柯生物工程股份有限公司