Nras基因突變檢測體系及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種NRAS基因突變檢測體系及其試劑盒，包括質(zhì)控引物探針內(nèi)標混合液和檢測引物探針內(nèi)標混合液，所述質(zhì)控引物探針內(nèi)標混合液包括質(zhì)控引物對、NRAS基因質(zhì)控特異探針、內(nèi)標引物對和內(nèi)標特異探針；檢測引物探針內(nèi)標混合液有四種，各種檢測引物探針內(nèi)標混合液包括兩個針對NRAS基因不同突變位點的檢測特異引物對、NRAS基因特異探針、內(nèi)標引物對和內(nèi)標特異探針。本發(fā)明試劑盒采用多重PCR反應體系分四次檢測包括G34A、G34T、G35A、G38A、C181A、A182G、A182T和A183T在內(nèi)的八個突變位點，有效避免假陰性、批內(nèi)和批間差及模板質(zhì)量問題引起的結(jié)果偏差，實現(xiàn)高效、低成本、高靈敏度和準確性，適合標準化生產(chǎn)。
【專利說明】
NRAS基因突變檢測體系及其試劑盒
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種基因突變的檢測產(chǎn)品，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] RAS基因在腫瘤形成和細胞增殖分化調(diào)控中起著重要作用。NRAS是RAS基因家族 中的一員，與人類早幼粒細胞性白血病密切相關，長度大約為4. 3kb。NRAS在許多不同的情 況下傳送細胞增殖和存活信號，也常常在癌細胞中發(fā)生突變組成性激活。
[0003] 黑色素瘤患者大約有一半的黑色素瘤患者有BRAF基因的突變，而四分之一的患 者有NRAS基因突變。2012年Nature Medicine上得克薩斯大學MD安德森癌癥中心科學家 的研究證實了一種新的藥物組合，即以Cdk4為藥物靶標的抑制劑與MEK抑制劑聯(lián)合使用可 以治療NRAS突變的黑色素瘤患者。另據(jù)2013年發(fā)表在Lancet Oncology上的一項II期臨 床試驗研究顯示，對于NRAS基因變異的黑色素瘤患者，MEK162是第一個有效的靶向治療藥 物，并且可能為幾乎無有效治療方法的癌癥患者提供一種新的治療選擇。同年來自ESM0的 PMME研究的腫瘤基因分析顯示，KRAS，NRAS和BRAF突變可作為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌（mCRC)接受 帕尼單抗（pmab)+F0LF0X-線治療的生物學預測指標。另一方面，Nras基因突變還可能是 急性髓系白血?。ˋML)發(fā)生發(fā)展的原因之一，其機制可能是由于突變導致編碼的Ras蛋白 構型改變，使其處于功能持續(xù)活化狀態(tài)，從而激活了 Raf/Mek/Erk和PI3K/Akt等下游信號 傳導通路，最終導致AML的發(fā)生。另外部分患者所發(fā)生的肝癌NRAS基因突變也成為了臨 床研究的新話題，相應的藥物也在不斷地研發(fā)中。Nras基因突變檢測對于臨床診斷和用藥 指導均具有重要參考價值。
[0004] 目前Nras的檢測方法主要有液相芯片技術和測序等。本發(fā)明利用擴增阻礙突變 系統(tǒng)（Amplification Refractory Mutation System, ARMS)衍生的系列技術，采用四組二 重PCR反應檢測NRAS基因八個熱點突變位點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開了一種可通過四次反應快速準確檢測NRAS基因八個熱點突變位點的 NRAS基因突變檢測體系及其試劑盒。
[0006] 本發(fā)明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是：一種NRAS基因突變檢測體 系，包括質(zhì)控引物探針內(nèi)標混合液和檢測引物探針內(nèi)標混合液；
[0007] 所述質(zhì)控引物探針內(nèi)標混合液包括質(zhì)控引物對、NRAS基因質(zhì)控特異探針、內(nèi)標引 物對和內(nèi)標特異探針；
[0008] 所述檢測引物探針內(nèi)標混合液包括檢測引物探針內(nèi)標混合液A、檢測引物探針內(nèi) 標混合液B、檢測引物探針內(nèi)標混合液C和檢測引物探針內(nèi)標混合液D ;
[0009] 所述檢測引物探針內(nèi)標混合液A包括NRAS基因 G34A突變檢測特異引物對、NRAS 基因 G34T突變檢測特異引物對、NRAS基因12/13密碼子特異探針、內(nèi)標引物對和內(nèi)標特異 探針；
[0010] 所述檢測引物探針內(nèi)標混合液B包括NRAS基因 G35A突變檢測特異引物對、NRAS 基因 G38A突變檢測特異引物對、NRAS基因12/13密碼子特異探針、內(nèi)標引物對和內(nèi)標特異 探針；
[0011] 所述檢測引物探針內(nèi)標混合液C包括NRAS基因 C181A突變檢測特異引物對、NRAS 基因 A182G突變檢測特異引物對、NRAS基因61密碼子特異探針、內(nèi)標引物對和內(nèi)標特異探 針；
[0012] 所述檢測引物探針內(nèi)標混合液D包括NRAS基因 A182T突變檢測特異引物對、NRAS 基因 A183T突變檢測特異引物對、NRAS基因61密碼子特異探針、內(nèi)標引物對和內(nèi)標特異探 針；
[0013] 所述質(zhì)控引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述質(zhì)控引物對 的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；
[0014] 所述NRAS基因質(zhì)控特異探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；
[0015] 所述NRAS基因 G34A突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示；
[0016] 所述NRAS基因 G34T突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 8所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示；
[0017] 所述NRAS基因 G35A突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示；
[0018] 所述NRAS基因 G38A突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示；
[0019] 所述NRAS基因 C181A突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；
[0020] 所述NRAS基因 A182G突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；
[0021] 所述NRAS基因 A182T突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 13所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；
[0022] 所述NRAS基因 A183T突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；
[0023] 所述NRAS基因12/13密碼子特異探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；
[0024] 所述NRAS基因61密碼子特異探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示；
[0025] 所述內(nèi)標引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示，其下游引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 16所示；
[0026] 所述內(nèi)標特異探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示；
[0027] 所述探針均帶有熒光基團。
[0028] 上述NRAS基因質(zhì)控特異探針和內(nèi)標特異探針的5'端帶有相互區(qū)別的報告熒光基 團，所述NRAS基因質(zhì)控特異探針、NRAS基因12/13密碼子特異探針和NRAS基因61密碼子 特異探針的5'端帶有相同的報告熒光基團，所述NRAS基因質(zhì)控特異探針、NRAS基因12/13 密碼子特異探針、NRAS基因61密碼子特異探針和內(nèi)標特異探針的3'端均帶有淬滅熒光基 團。
[0029] 上述相互區(qū)別的報告熒光基團有兩種，第一種是FAM、Cy5或R0X，第二種是HEX、 VIC、TET或Cy3 ;所述淬滅熒光基團是BHQ1。
[0030] 上述與熒光基團相關的另一技術方案是：上述NRAS基因質(zhì)控特異探針、NRAS基因 61密碼子特異探針和內(nèi)標特異探針的5'端帶有相互區(qū)別的報告熒光基團，所述NRAS基因 質(zhì)控特異探針和NRAS基因12/13密碼子特異探針的5'端帶有相同的報告熒光基團，所述 NRAS基因質(zhì)控特異探針、NRAS基因12/13密碼子特異探針、NRAS基因61密碼子特異探針 和內(nèi)標特異探針的3'端均帶有淬滅熒光基團。
[0031] 上述相互區(qū)別的報告熒光基團有三種，第一種是FAM，第二種是HEX、VIC、TET或 Cy3,第三種是Cy5或R0X ;所述淬滅熒光基團是BHQ1。
[0032] 本發(fā)明為解決上述技術問題提出的另一種技術方案是：一種采用上述的檢測體系 的NRAS基因突變檢測試劑盒。
[0033] 上述NRAS基因突變檢測試劑盒包括PCR反應液，陽性對照液Al、A2、Bl、B2、C1、 C2、D1、D2,以及陰性對照液；
[0034] 陽性對照液A1是含NRAS基因 G34A突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液；
[0035] 陽性對照液A2是含NRAS基因 G34T突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液；
[0036] 陽性對照液B1是含NRAS基因 G35A突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液；
[0037] 陽性對照液B2是含NRAS基因 G38A突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液；
[0038] 陽性對照液C1是含NRAS基因 C181A突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液；
[0039] 陽性對照液C2是含NRAS基因 A182G突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液；
[0040] 陽性對照液D1是含NRAS基因 A182T突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液；
[0041] 陽性對照液D2是含NRAS基因 A183T突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液。
[0042] 上述NRAS基因突變檢測試劑盒的反應體系的體積為10 μ 1或20 μ 1，所述質(zhì)控引 物對的終濃度分別為0. 3 μ Μ，所述NRAS基因質(zhì)控特異探針的終濃度為0. 15 μ Μ，所述內(nèi)標 引物對的終濃度分別為〇. 1 μ Μ，所述內(nèi)標特異探針的終濃度為0. 1 μ Μ，各突變檢測特異引 物對的終濃度分別為0. 3 μ M，NRAS基因12/13密碼子特異探針的終濃度分別為0. 3 μ Μ，所 述NRAS基因61密碼子特異探針的終濃度為0. 3 μ Μ，所述陽性對照的終濃度為1~2. 5ng/ μ 1〇
[0043] 上述PCR反應液包括PCR緩沖液、2. 5mM的dNTPs和5U/ μ 1的Taq DNA聚合酶； 所述PCR緩沖液包括lOOmM的Tris-HCl、500mM的KC1和15mM的MgCl2，用于配置所述PCR 緩沖液的Tris-HCl緩沖液的pH值為8. 3 ;所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP ;所述 陰性對照液是雙蒸水。
[0044] 本發(fā)明具有積極的效果：
[0045] (1)本發(fā)明的NRAS基因突變檢測體系及其試劑盒采用ARMS-TaqMAN PCR技術和經(jīng) 優(yōu)化的多重PCR反應體系，將不影響質(zhì)控PCR反應體系或檢測PCR反應體系的內(nèi)標系統(tǒng)分 別作為質(zhì)控PCR反應或檢測PCR反應的有效對照，避免假陰性及孔間差，并檢測模板質(zhì)量及 監(jiān)測批內(nèi)及批間差。
[0046] (2)本發(fā)明的NRAS基因突變檢測體系及其試劑盒用于檢測NRAS基因突變的試劑 盒敏感度達到〇. 5%，批內(nèi)CV和批間CV小于3% ;檢測時間為90分鐘；單次檢測成本低。 該產(chǎn)品可以使得NRAS基因熱點突變檢測具有高效、低成本、高靈敏度和高準確性的特點， 適合產(chǎn)業(yè)化的標準生產(chǎn)及應用，更能有效控制批內(nèi)及批間差。
【附圖說明】
[0047] 圖1是采用實施例1的NRAS基因突變檢測試劑盒檢測樣本1的擴增曲線圖；
[0048] 圖2是采用實施例1的NRAS基因突變檢測試劑盒檢測樣本2的擴增曲線圖；
[0049] 圖3是采用實施例1的NRAS基因突變檢測試劑盒檢測樣本3的擴增曲線圖；
[0050] 圖4是采用實施例1的NRAS基因突變檢測試劑盒檢測樣本4的擴增曲線圖；
[0051] 圖5是采用實施例1的NRAS基因突變檢測試劑盒檢測樣本5的擴增曲線圖；
[0052] 圖6是采用實施例1的NRAS基因突變檢測試劑盒檢測樣本6的擴增曲線圖。
【具體實施方式】
[0053] 下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用 于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域的技術人員可 以根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。下述實施例中，若非特意 表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實驗 方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著的科學出版社2002年出版的《分子克隆實 驗指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所 有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或 均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。
[0054] 實施例1
[0055] 一、試劑盒的組成。
[0056] 本實施例的NRAS基因突變檢測試劑盒，包括PCR反應液、質(zhì)控引物探針內(nèi)標混合 液、檢測引物探針內(nèi)標混合液、弱陽性對照液和空白對照液。試劑盒各組分及其使用濃度和 在反應體系中的終濃度如表1所示。
[0057] 表1試劑盒組成表
[0058]

[0060] 上述表1中試劑盒各組分的說明如下：
[0061] PCR反應液由10XPCR緩沖液、2mM的dNTPs和5U/yl的熱啟動酶配制而成。 10XPCR緩沖液包括lOOmM的Tris-HCl、500mM的KC1和15mM的MgCl 2，用于配制PCR緩沖 液的Tris-HCl緩沖液的pH值為8. 3。2mM的dNTPs分別包括2mM的dATP、2mM的dGTP、2mM 的dCTP和2mM的dTTP。熱啟動酶是Taq DNA聚合酶，單獨封裝。
[0062] 質(zhì)控引物探針內(nèi)標混合液包括質(zhì)控引物對、NRAS基因質(zhì)控特異探針、內(nèi)標引物對、 內(nèi)標特異性探針。
[0063] 檢測引物探針內(nèi)標混合液A包括NRAS基因 G34A突變檢測特異引物對、NRAS基因 G34T突變檢測特異引物對、NRAS基因12/13密碼子特異探針、內(nèi)標引物對和內(nèi)標特異探針。
[0064] 檢測引物探針內(nèi)標混合液B包括NRAS基因 G35A突變檢測特異引物對、NRAS基因 G38A突變檢測特異引物對、NRAS基因12/13密碼子特異探針、內(nèi)標引物對和內(nèi)標特異探針。
[0065] 檢測引物探針內(nèi)標混合液C包括NRAS基因 C181A突變檢測特異引物對、NRAS基因 A182G突變檢測特異引物對、NRAS基因61密碼子特異探針、內(nèi)標引物對和內(nèi)標特異探針。
[0066] 檢測引物探針內(nèi)標混合液D包括NRAS基因 A182T突變檢測特異引物對、NRAS基因 A183T突變檢測特異引物對、NRAS基因61密碼子特異探針、內(nèi)標引物對和內(nèi)標特異探針。
[0067] 弱陽性對照液A1是濃度為10ng/ μ 1野生型基因組DNA水溶液（含10 % NRAS基 因 G34A突變陽性質(zhì)粒）。弱陽性對照液A2是濃度為10ng/ μ 1野生型基因組DNA水溶液 (含10% NRAS基因 G34T突變陽性質(zhì)粒）。
[0068] 弱陽性對照液B1是濃度為10ng/ μ 1野生型基因組DNA水溶液（含10% NRAS基 因 G35A突變陽性質(zhì)粒）。弱陽性對照液B2是濃度為10ng/ μ 1野生型基因組DNA水溶液 (含10% NRAS基因 G38A突變陽性質(zhì)粒）。
[0069] 弱陽性對照液C1是濃度為10ng/ μ 1野生型基因組DNA水溶液（含10 % NRAS基 因 C181A突變陽性質(zhì)粒）。弱陽性對照液C2是濃度為10ng/ μ 1野生型基因組DNA水溶液 (含10% NRAS基因 A182G突變陽性質(zhì)粒）。
[0070] 弱陽性對照液D1是濃度為long/ μ 1野生型基因組DNA水溶液（含10% NRAS基 因 A182T突變陽性質(zhì)粒）。弱陽性對照液D2是濃度為10ng/ μ 1野生型基因組DNA水溶液 (含10% NRAS基因 Α183Τ突變陽性質(zhì)粒）。
[0071] 野生型基因組及相關突變陽性質(zhì)粒均經(jīng)測序驗證。
[0072] 突變型質(zhì)粒的獲取為突變型質(zhì)粒常規(guī)構建步驟：設計一條覆蓋相應突變位點并將 突變堿基引入到引物序列中的特異引物，與相對應的上游或下游野生型引物配對，擴增含 相應突變點的目的片段產(chǎn)物，構建入質(zhì)粒，挑選并測序驗證。
[0073] 空白對照液為雙蒸水。
[0074] 其中，質(zhì)控引物對、NRAS基因質(zhì)控特異探針、各NRAS基因突變檢測特異引物對、 NRAS基因12/13密碼子特異探針、NRAS基因61密碼子特異探針、內(nèi)標引物對、內(nèi)標特異探 針的核苷酸序列如表2所示。
[0075] 表2引物和探針特征表
[0076]
[0077] NRAS基因質(zhì)控特異探針、NRAS基因12/13密碼子特異探針、NRAS基因61密碼子 特異探針和內(nèi)標特異探針均帶有熒光基團。依據(jù)熒光不同的波長來選定熒光基團。
[0078] NRAS基因質(zhì)控特異探針與NRAS基因12/13密碼子特異探針的核苷酸序列相同。 NRAS基因質(zhì)控特異探針、NRAS基因12/13密碼子特異探針與NRAS基因61密碼子特異探針 的核苷酸序列的5'端設有FAM熒光基團，其3'端設有BHQ1熒光基團。內(nèi)標特異探針的核 苷酸序列的5'端設有HEX熒光基團，其3'端設有BHQ1熒光基團。本實施例的試劑盒由于 只設置了 FAM熒光基團和HEX熒光基團，所以檢測到兩個位點中有一個發(fā)生了突變，即可判 斷NRAS基因發(fā)生了突變。
[0079] 各引物和探針均由上海生工生物工程有限公司合成。
[0080] 二、試劑盒的使用方法。
[0081] 本實施例的NRAS基因突變檢測試劑盒的具體檢測步驟如下：
[0082] 1、DNA 提取。
[0083] 米用試劑盒（Axygen Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)提取樣本DNA (樣 本1、樣本2和樣本3為全血樣本，樣本4、樣本5和樣本6為腫瘤組織樣本），具體的操作參 見試劑盒產(chǎn)品說明書。
[0084] 2、樣本DNA質(zhì)量檢測。
[0085] 獲得樣本DNA后，通過測定濃度和0D260/0D280的比值控制樣本質(zhì)量，最終加入 反應體系中的樣本，0D260/0D280的比值在1. 8~2. 0之間的可獲得最優(yōu)反應結(jié)果，濃度為 20 ~50ng/ μ 1。
[0086] 3、PCR 反應。
[0087] 1)配制 20 μ 1 (或 10 μ 1) PCR 反應體系：
[0088] 取4 μ 1的PCR反應液、8 μ 1的質(zhì)控引物探針內(nèi)標混合液和0. 2 μ 1的Taq DNA聚 合酶，加入樣本2 μ 1，用水補足至20 μ 1，配成質(zhì)控反應液。
[0089] 取4 μ 1的PCR反應液、10 μ 1的任一檢測引物探針內(nèi)標混合液和0. 2 μ 1的Taq DNA聚合酶，加入樣本2 μ 1，用水補足至20 μ 1，配成相應位點的檢測反應液。
[0090] 另以弱陽性對照液和空白對照液分別平行做對照實驗。PCR反應體系中的樣本和 弱陽性對照液所加入的量控制在20~50ng。
[0091] 檢測引物探針內(nèi)標混合液A對應弱陽性對照液A1和A2,檢測引物探針內(nèi)標混合 液B對應弱陽性對照液B1和B2,檢測引物探針內(nèi)標混合液C對應弱陽性對照液C1和C2， 檢測引物探針內(nèi)標混合液D對應弱陽性對照液D1和D2。
[0092] 各反應體系的配制如表3所示。反應時均采用復孔。
[0093] 表3 NRAS基因突變檢測PCR反應體系配制表（單位：μ 1)
[0094]
[0095] 表3中Ctl至Ctl3的說明如表4所示。
[0096] 表4CT值說明
[0097]
[0098] 2)PCR反應程序：
[0099] 隨后在實時焚光定量 PCR儀（Roche Light Cycler-Nano thermo cycler)上進行 實時熒光PCR反應程序，最優(yōu)反應程序如表5所示。
[0100] 表5 PCR反應程序表
[0101]
[0102] 4、PCR結(jié)果判定。
[0103] 1)試劑盒有效性的判定。
[0104] 弱陽性對照有效：Ct3所指向的擴增曲線有明顯的指數(shù)增長期，且Ct3 < 32 ;且 Ct9和CtlO所指向的擴增曲線有明顯的指數(shù)增長期，且Ct9且CtlO < 32。
[0105] 空白對照有效：Ct5和Ct6所指向的擴增曲線無明顯的指數(shù)增長期，或Ct5多40 且Ct6彡40 ;且Ctl2和Ctl3所指向的擴增曲線無明顯的指數(shù)增長期，或Ctl2彡40且 Ctl3 彡 40。
[0106] 內(nèi)標基因有效：Ct2、Ct4、Ct8、Ctll所指向的擴增曲線均有明顯的指數(shù)增長期，且 各CT值< 35。
[0107] 2)檢測樣本有效性的判定。
[0108] 根據(jù)質(zhì)控FAM通道的CT值進行判定。
[0109] 若Ctl < 20,則樣本基因組加入過量，建議稀釋后重新檢測；
[0110] 若20$ Ct 1 < 30，樣本加入量適中，適合進行結(jié)果判定；
[0111] 若Ctl>30,則樣本基因組加入量低，不能穩(wěn)定的進行突變結(jié)果判定。
[0112] 3)突變結(jié)果的判定。
[0113] 通過前述兩步，確定檢測樣本、弱陽性對照、空白對照和內(nèi)標基因檢測均有效的前 提下，再對各樣品進彳丁檢測。
[0114] 根據(jù)公式"Λ Ct值=檢測Ct值-質(zhì)控Ct值"計算有效檢測樣本的Λ Ct值，當檢 測NRAS基因突變位點時，Λ Ct =檢測Ct-質(zhì)控Ct = Ct7-Ctl，其中CT值的說明參見表3 和表4。按照以下步驟和表6對樣本檢測結(jié)果進行判讀，確定樣本是否存在突變。
[0115] 若檢測反應液中加檢測引物內(nèi)標混合液A時，以下的判定為針對NRAS基因 G34A 和G34T位點的判定；
[0116] 若檢測反應液中加檢測引物內(nèi)標混合液B時，以下的判定為針對NRAS基因 G35A 和G38A位點的判定；
[0117] 若檢測反應液中加檢測引物內(nèi)標混合液C時，以下的判定為針對NRAS基因 C181A 和A182G位點的判定；
[0118] 若檢測反應液中加檢測引物內(nèi)標混合液D時，以下的判定為針對NRAS基因 A182T 和A183T位點的判定。
[0119] A.陰性情況
[0120] i)若Ct7所指向的擴增曲線無明顯的指數(shù)增長期（無 Ct值），則判定該樣本此組 反應中的兩個突變位點均為陰性（野生型）；
[0121] ii)若Ct7>40,則判定該樣本此組反應中的兩個突變位點均為陰性（野生型）；
[0122] iii)若Ct7 < 39且有下列情形之一的：
[0123] 若檢測反應液中加檢測引物內(nèi)標混合液A時，Λ Ct多13 ;
[0124] 若檢測反應液中加檢測引物內(nèi)標混合液B時，Λ Ct多10 ;
[0125] 若檢測反應液中加檢測引物內(nèi)標混合液C時，Λ Ct多11 ;
[0126] 若檢測反應液中加檢測引物內(nèi)標混合液D時，Λ Ct多13 ;
[0127] 則判定該樣本對應反應組中的兩個突變位點均為陰性（野生型）。
[0128] B.陽性情況
[0129] iv)若Ct7彡39,且有下列情形之一的：
[0130] 若檢測反應液中加檢測引物內(nèi)標混合液A時，Λ Ct〈 13 ;
[0131] 若檢測反應液中加檢測引物內(nèi)標混合液B時，Λ Ct〈10 ;
[0132] 若檢測反應液中加檢測引物內(nèi)標混合液C時，Λ Ct〈ll ;
[0133] 若檢測反應液中加檢測引物內(nèi)標混合液D時，Λ Ct〈l3 ;
[0134] 則判定該樣本對應反應組中的兩個突變位點至少其中一個為陽性（突變型）。
[0135] 表6 :NRAS基因突變結(jié)果判定 [01361
[0137] 采用本實施例的試劑盒對樣品1至6進行了檢測，結(jié)果如圖1至圖6所示。PCR反 應時采用復孔，但圖示中為清晰只選了其中一孔的擴增曲線為例。
[0138] 圖1是采用本實施例的NRAS基因突變檢測試劑盒檢測樣本1的擴增曲線圖，檢測 結(jié)果為NRAS基因 G34A和/或G34T突變。
[0139] 圖2是采用本實施例的NRAS基因突變檢測試劑盒檢測樣本2的擴增曲線圖，檢測 結(jié)果為NRAS基因 G34A和G34T均未突變。
[0140] 圖3是采用本實施例的NRAS基因突變檢測試劑盒檢測樣本3的擴增曲線圖，檢測 結(jié)果為NRAS基因 G35A和/或G38A突變。
[0141] 圖4是采用本實施例的NRAS基因突變檢測試劑盒檢測樣本4的擴增曲線圖，檢測 結(jié)果為NRAS基因 G35A和G38A均未突變。
[0142] 圖5是采用本實施例的NRAS基因突變檢測試劑盒檢測樣本5的擴增曲線圖，檢測 結(jié)果為NRAS基因 C181A和A182G均未突變。
[0143] 圖6是采用本發(fā)實施例的NRAS基因突變檢測試劑盒檢測樣本6的擴增曲線圖，檢 測結(jié)果為NRAS基因 A182T和/或A183T突變。
[0144] 5、PCR結(jié)果驗證
[0145] 采用測序方法檢測各樣本的NRAS基因的突變位點，測序結(jié)果與采用本試劑盒的 檢測結(jié)果完全一致。
[0146] 三、試劑盒特性
[0147] 靈敏度分析：采用本實施例的試劑盒檢測10ng/ μ 1的NRAS基因突變位點野生型 質(zhì)粒溶液（含0. 5% NRAS基因?qū)稽c突變型質(zhì)粒），均可檢出，靈敏度達到0. 5%。
[0148] 重復性分析：上述檢測反應均采用復孔，每次重復三次，其間的CT值相差不超過 0.2個循環(huán)。
[0149] 實施例2
[0150] 本實施例的NRAS基因突變檢測試劑盒其余部分與實施例1相同，不同之處在于：
[0151] NRAS基因質(zhì)控特異探針與NRAS基因12/13密碼子特異探針的核苷酸序列的5'端 設有FAM熒光基團，其3'端設有BHQ1熒光基團。NRAS基因61密碼子特異探針的核苷酸序 列的5'端設有Cy5熒光基團，其3'端設有BHQ1熒光基團。內(nèi)標特異探針的核苷酸序列的 5'端設有HEX熒光基團，其3'端設有BHQ1熒光基團。
[0152] 本實施例的NRAS基因突變檢測試劑盒與實施例1的試劑盒的區(qū)別在于：增加了 Cy5熒光基團，所以可以檢測出兩個位點中具體是哪一個發(fā)生了突變，從而判斷NRAS基因 是否突變。
[0153] 顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的 實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其 它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬于本發(fā) 明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。
【主權項】
1. 一種NRAS基因突變檢測體系，包括質(zhì)控引物探針內(nèi)標混合液和檢測引物探針內(nèi)標 混合液，其特征在于： 所述質(zhì)控引物探針內(nèi)標混合液包括質(zhì)控引物對、NRAS基因質(zhì)控特異探針、內(nèi)標引物對 和內(nèi)標特異探針； 所述檢測引物探針內(nèi)標混合液包括檢測引物探針內(nèi)標混合液A、檢測引物探針內(nèi)標混 合液B、檢測引物探針內(nèi)標混合液C和檢測引物探針內(nèi)標混合液D ; 所述檢測引物探針內(nèi)標混合液A包括NRAS基因 G34A突變檢測特異引物對、NRAS基 因 G34T突變檢測特異引物對、NRAS基因12/13密碼子特異探針、內(nèi)標引物對和內(nèi)標特異探 針； 所述檢測引物探針內(nèi)標混合液B包括NRAS基因 G35A突變檢測特異引物對、NRAS基 因 G38A突變檢測特異引物對、NRAS基因12/13密碼子特異探針、內(nèi)標引物對和內(nèi)標特異探 針； 所述檢測引物探針內(nèi)標混合液C包括NRAS基因 C181A突變檢測特異引物對、NRAS基因 A182G突變檢測特異引物對、NRAS基因61密碼子特異探針、內(nèi)標引物對和內(nèi)標特異探針； 所述檢測引物探針內(nèi)標混合液D包括NRAS基因 A182T突變檢測特異引物對、NRAS基因 A183T突變檢測特異引物對、NRAS基因61密碼子特異探針、內(nèi)標引物對和內(nèi)標特異探針； 所述質(zhì)控引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述質(zhì)控引物對的下 游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； 所述NRAS基因質(zhì)控特異探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示； 所述NRAS基因 G34A突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所 示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示； 所述NRAS基因 G34T突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 8所 示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示； 所述NRAS基因 G35A突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 9所 示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示； 所述NRAS基因 G38A突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10 所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 7所示； 所述NRAS基因 C181A突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 11 所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示； 所述NRAS基因 A182G突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 12 所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示； 所述NRAS基因 A182T突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 13 所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示； 所述NRAS基因 A183T突變檢測特異引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 14 所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示； 所述NRAS基因12/13密碼子特異探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示； 所述NRAS基因61密碼子特異探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示； 所述內(nèi)標引物對的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示，其下游引物的核苷酸 序列如SEQ ID No. 16所示； 所述內(nèi)標特異探針的核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示； 所述探針均帶有熒光基團。2. 根據(jù)權利要求1所述的NRAS基因突變檢測體系，其特征在于：所述NRAS基因質(zhì)控 特異探針和內(nèi)標特異探針的5'端帶有相互區(qū)別的報告熒光基團，所述NRAS基因質(zhì)控特異 探針、NRAS基因12/13密碼子特異探針和NRAS基因61密碼子特異探針的5'端帶有相同 的報告熒光基團，所述NRAS基因質(zhì)控特異探針、NRAS基因12/13密碼子特異探針、NRAS基 因61密碼子特異探針和內(nèi)標特異探針的3'端均帶有淬滅熒光基團。3. 根據(jù)權利要求2所述的NRAS基因突變檢測體系，其特征在于：所述相互區(qū)別的報告 熒光基團有兩種，第一種是FAM、Cy5或R0X，第二種是HEX、VIC、TET或Cy3 ;所述淬滅熒光 基團是BHQ1。4. 根據(jù)權利要求1所述的NRAS基因突變檢測體系，其特征在于：所述NRAS基因質(zhì)控 特異探針、NRAS基因61密碼子特異探針和內(nèi)標特異探針的5'端帶有相互區(qū)別的報告熒光 基團，所述NRAS基因質(zhì)控特異探針和NRAS基因12/13密碼子特異探針的5'端帶有相同的 報告熒光基團，所述NRAS基因質(zhì)控特異探針、NRAS基因12/13密碼子特異探針、NRAS基因 61密碼子特異探針和內(nèi)標特異探針的3'端均帶有淬滅熒光基團。5. 根據(jù)權利要求4所述的NRAS基因突變檢測體系，其特征在于：所述相互區(qū)別的報告 熒光基團有三種，第一種是FAM，第二種是HEX、VIC、TET或Cy3,第三種是Cy5或R0X ;所述 淬滅熒光基團是BHQ1。6. -種采用如權利要求1所述的檢測體系的NRAS基因突變檢測試劑盒。7. 根據(jù)權利要求6所述的NRAS基因突變檢測試劑盒，其特征在于：包括PCR反應液， 陽性對照液Al、A2、Bl、B2、Cl、C2、D1和D2,以及陰性對照液； 陽性對照液A1是含NRAS基因 G34A突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液； 陽性對照液A2是含NRAS基因 G34T突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液； 陽性對照液B1是含NRAS基因 G35A突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液； 陽性對照液B2是含NRAS基因 G38A突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液； 陽性對照液C1是含NRAS基因 C181A突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液； 陽性對照液C2是含NRAS基因 A182G突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液； 陽性對照液D1是含NRAS基因 A182T突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液； 陽性對照液D2是含NRAS基因 A183T突變陽性質(zhì)粒的野生型基因組DNA水溶液。8. 根據(jù)權利要求7所述的NRAS基因突變檢測試劑盒，其特征在于：其反應體系的體積 為10 μ 1或20 μ 1，所述質(zhì)控引物對的終濃度分別為0. 3 μΜ，所述NRAS基因質(zhì)控特異探針 的終濃度為0. 15 μΜ，所述內(nèi)標引物對的終濃度分別為0. 1 μΜ，所述內(nèi)標特異探針的終濃 度為0. 1 μ Μ，各突變檢測特異引物對的終濃度分別為0. 3 μ M，NRAS基因12/13密碼子特異 探針的終濃度為0. 3 μ M，所述NRAS基因61密碼子特異探針的終濃度為0. 3 μ M，所述陽性 對照終濃度為1~2. 5ng/ μ 1。9. 根據(jù)權利要求8所述的NRAS基因突變檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR反應液包 括PCR緩沖液、2. 5mM的dNTPs和5U/ μ 1的Taq DNA聚合酶；所述PCR緩沖液包括lOOmM 的Tris-HCl、500mM的KC1和15mM的MgCl2，用于配置所述PCR緩沖液的Tris-HCl緩沖液 的pH值為8. 3 ;所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP ;所述陰性對照液是雙蒸水。
【文檔編號】C12Q1/68GK105986018SQ201510062008
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月6日
【發(fā)明人】趙新泰, 王明, 金芬芬
【申請人】上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司