H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，它確立了H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測方法，含有三個技術(shù)要點：確立了核酸檢測所需要的引物序列；確立了檢測反應(yīng)種類；確立了檢測反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。該核酸檢測方法可以用于H5亞型禽流感病毒的科學(xué)研究，也可以用于動物或人的臨床診斷檢測。
【專利說明】
H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域;具體說來，本發(fā)明確立了H5亞型高致病性禽流感病毒的快速檢測方法，用于H5亞型禽流感病毒的快速檢測，在體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全等領(lǐng)域有較大的使用價值。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]禽流感根據(jù)致病性的不同，可以分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無致病性禽流感。其中，高致病性禽流感是由H5和H7亞型的某些毒株引起的疾病。
[0004]病毒核酸檢測是病毒檢測重要方法之一。目前，國內(nèi)外對H5亞型高致病性禽流感病毒的各種核酸檢測方法，包括農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或國家標(biāo)準(zhǔn)，耗費時間都比較長，如農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(禽流感病毒RT-PCR檢測方法，NY/T 772-2013)至少需要2 h，國家標(biāo)準(zhǔn)(H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測方法，GB/T 19438.2-2004)至少需要1.2 h，目前沒有比這些方法效率更高的檢測方法。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對上述現(xiàn)有H5亞型高致病性禽流感病毒檢測技術(shù)的不足，開展了深入研究和測試，建立了基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測方法，僅需20 min即可完成檢測。該方法包括以下三個方面內(nèi)容:
(一)確立了核酸檢測所需要的引物序列，針對H5亞型禽流感病毒HA基因中保守區(qū)域，設(shè)計引物序列，其中上游引物序列含有3 O個堿基，序列為agggaggatggcaaggaatggtagatggtt(即序列表中SEQ ID N0.1)，下游上游引物序列含有30個堿基，序列為gctgtagtcggactttgtcataaaggttct(即序列表中SEQ ID N0.2)；
(二)確立了基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的快速檢測方法；
(三)確立了檢測反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中依次加入純水9.2 μ?、反應(yīng)緩沖液29.5 41(含有(^了？、(《^\(1111\(10^等四種核苷酸)、第一步所合成的上游引物
2.4μ?(濃度為10 μπιοΙ/L)、第一步所合成的下游引物2.4 μ?(濃度為10 μπιοΙ/L)、酶混合物[逆轉(zhuǎn)錄酶、能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶]1.0 口1、1?嫩酶抑制劑1.0 μ?、需要檢測的流感病毒核酸2.0 μ1(從臨床樣品或其他樣品中用核酸提取試劑盒提取的)、醋酸鎂(280 mmol/L)2.5 μ?;然后將反應(yīng)體系密閉，置于恒溫儀(或水浴鍋)上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為40°C 20 min;反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)產(chǎn)物中加入含有顏色的核酸電泳緩沖液，進(jìn)行瓊脂糖核酸凝膠電泳，如果出現(xiàn)大小約為345 bp
的核酸電泳條帶，則判斷為陽性，否則判斷為陰性。
[0007]
【具體實施方式】
[0008]下面通過實施例，說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于這個實施例。
[0009]本實施例用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)，對H5亞型高致病性禽流感病毒進(jìn)行核酸快速檢測，包括如下步驟:
第一步(合成引物):按照本發(fā)明指定的核酸序列(即序列表中SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2)，人工合成重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)所需要的上游引物和下游引物；
第二步(配置反應(yīng)體系):在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中依次加入純水9.2 μ?、反應(yīng)緩沖液29.5 41(含有(^了？、(16了？、(11'了？、(1013等四種核苷酸)、第一步所合成的上游引物2.4 μ?(濃度為10 ymol/L)、第一步所合成的下游引物2.4 μ1(濃度為10 ymol/L)、酶混合物[逆轉(zhuǎn)錄酶、能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶]1.0 41、1?^酶抑制劑1.0 μ?、需要檢測的流感病毒核酸2.0 μ?(從臨床樣品或其他樣品中用核酸提取試劑盒提取的)、醋酸鎂(280 mmol/L)2.5 μ?;
第三步(反應(yīng)):將第二步配置好的反應(yīng)體系密閉后，置于恒溫儀(或水浴鍋)上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為40°C 20 min；
第四步(結(jié)果檢測):在第三步的反應(yīng)產(chǎn)物中加入含有顏色的核酸電泳緩沖液，進(jìn)行瓊脂糖核酸凝膠電泳，如果出現(xiàn)大小約為345 bp的核酸電泳條帶，則判斷為陽性，否則判斷為陰性。
[0010]實際應(yīng)用結(jié)果:對96份H5亞型高致病性禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性臨床樣品進(jìn)行檢測，以及300份標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品，用上述H5亞型高致病性禽流感病毒快速核酸檢測技術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示該技術(shù)的靈敏度為100.0%，特異性為100.0%。
【主權(quán)項】
1.H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測方法，采用重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)，其特征是可以檢出所有H5亞型禽流感病毒。2.H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測方法，其特征有兩個:一是可以檢出所有H5亞型禽流感病毒;二是采用重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)。3.H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測方法，其特征有三個:一是可以檢出所有H5亞型禽流感病毒；二是采用針對H5亞型禽流感病毒HA基因保守的區(qū)域而設(shè)計的一對引物;三是采用重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)。4.H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測方法，可采用重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)，其特征有兩個:一是可以檢出所有H5亞型禽流感病毒;二是檢測反應(yīng)采用的一條引物的序列^agggaggatggcaaggaatggtagatggtt,或與 gctgtagtcggactttgtcataaaggttct 序列有 10 個或10個以上的堿基序列相同的序列(本段文字中，引物序列均為5撇端至3撇端，a、t、g、c表示相應(yīng)的堿基)。5.H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測方法，其特征有兩個:一是采用重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)；二是檢測反應(yīng)采用的兩條引物，其序列分別為agggaggatggcaaggaatggtagatggtt和gctgtagtcggactttgtcataaaggttct,或與這兩個序列有10個或10個以上的堿基序列相同的序列(本段文字中，引物序列均為5撇端至3撇端，a、1:^、(3表示相應(yīng)的堿基)。
【文檔編號】C12Q1/70GK105986043SQ201610063695
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2016年1月29日
【發(fā)明人】蔣文明, 陳繼明
【申請人】中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心