一種倍半萜化合物及其制備與應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種倍半萜化合物及其制備與應(yīng)用，將擴(kuò)展青霉接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在25?28℃、150rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，獲得所述倍半萜化合物；本發(fā)明所涉及的倍半萜化合物具有比上市藥物阿卡波糖更好的α?葡萄糖苷酶抑制活性，活性為阿卡波糖的4倍，而且其分子量較小，因而具有服用量少的優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種倍半萜化合物及其制備與應(yīng)用 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，特別涉及一種新的倍半萜化合物及其制備 方法和其在作用于α-葡萄糖苷酶方面的應(yīng)用。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種由多基因遺傳與環(huán)境因素共同作用所引發(fā)的、以持續(xù)高血糖為特征 的代謝紊亂綜合癥。其病理特征表現(xiàn)為胰島素分泌不足或者胰島素抵抗，導(dǎo)致體內(nèi)糖、月旨 肪、蛋白質(zhì)、水、電解質(zhì)代謝紊亂。調(diào)查表明，糖尿病可引發(fā)心、腦、肝、肺、腎、神經(jīng)等急性或 慢性并發(fā)癥，是繼心腦血管疾病、癌癥之后危害人類(lèi)身體健康的第三大疾病。糖尿病的高發(fā) 病率、高致殘率及其終身性對(duì)人類(lèi)健康的危害十分嚴(yán)重，給個(gè)人和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù) 擔(dān)。為此，關(guān)于糖尿病的防治己引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者和政府的高度重視。
[0003] α-葡萄糖苷酶抑制劑是20世紀(jì)70年代開(kāi)發(fā)的一類(lèi)新型口服降血糖藥物，能競(jìng)爭(zhēng)性 抑制小腸內(nèi)葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道內(nèi)的吸收，有效降低餐后高血 糖，已被廣泛用于糖尿病的治療。目前，市場(chǎng)以α-葡萄糖苷酶為靶點(diǎn)的糖尿病治療藥物主要 有阿卡波糖與米格列醇。阿卡波糖是第一個(gè)上市的葡萄糖苷酶抑制劑，其副作用小，但活 性不強(qiáng)，日服用量大，且藥品價(jià)格較高，病人經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較大。米格列醇的活性較阿卡波糖強(qiáng)， 但應(yīng)用時(shí)胃腸道不良反應(yīng)發(fā)生率高，市場(chǎng)反應(yīng)并不好。新型葡萄糖苷酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)，是 糖尿病治療藥物研發(fā)的重要方向之一。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是克服目前現(xiàn)有α_葡萄糖苷酶抑制劑類(lèi)藥物活性弱、不良反應(yīng)率高等 缺陷，提供兩個(gè)具有強(qiáng)效葡萄糖苷酶抑制活性的化合物及其制備與應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種式(1)所示的倍半萜化合物，
[0007]
[0008] 所述倍半萜化合物為佛手柑烷型倍半萜，側(cè)鏈含有兩個(gè)含氧螺環(huán)。
[0009] 本發(fā)明還提供一種所述倍半萜化合物的制備方法，以擴(kuò)展青霉為發(fā)酵菌，按常規(guī) 方法培養(yǎng)發(fā)酵、提取分離得到，優(yōu)選所述方法是將擴(kuò)展青霉接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在25-28Γ、 150rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，獲得所述倍半萜化合物;所述發(fā)酵培養(yǎng)基 質(zhì)量終濃度組成為:碳源5-30g/L、氮源10-25g/L、無(wú)機(jī)鹽l-5g/L，溶劑為水，pH值自然。
[0010]進(jìn)一步，所述碳源為：葡萄糖、甘露醇、甘油、糊精和半乳糖中的一種或任幾種，優(yōu) 選葡萄糖。
[0011]進(jìn)一步，所述氮源為黃豆粉、蛋白胨或馬鈴薯浸出粉中的一種或任幾種，優(yōu)選馬鈴 薯浸出粉。
[0012] 進(jìn)一步，所述無(wú)機(jī)鹽為磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀，優(yōu)選磷酸氫二鉀。
[0013] 進(jìn)一步，所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖5-30g/L，馬鈴薯浸出粉10-25g/L， KH2P〇4l_5g/L，溶劑為水，pH值自然，更優(yōu)選所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖20g/L，馬 鈴薯浸出粉25g/L，KH 2P〇42g/L，溶劑為水，pH值自然。
[0014] 本發(fā)明所述擴(kuò)展青霉優(yōu)選為中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心菌種編號(hào)為 1511C0001ACCC37275 的擴(kuò)展青霉。
[0015] 進(jìn)一步，擴(kuò)展青霉發(fā)酵液制備方法為：（1)將擴(kuò)展青霉接種至斜面培養(yǎng)基，在25-28 °C培養(yǎng)5-7天，獲得斜面菌體;所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為:碳源10-30g/L，氮源5-25g/L， 無(wú)機(jī)鹽0.5-2g/L，瓊脂10-20g/L，溶劑為水，pH值自然;所述碳源為:葡萄糖、甘露醇、甘油、 糊精或半乳糖中的一種或任幾種，優(yōu)選葡萄糖;所述氮源為黃豆粉、蛋白胨或馬鈴薯浸出粉 中的一種或任幾種，優(yōu)選馬鈴薯浸出粉;所述無(wú)機(jī)鹽為磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀，優(yōu)選磷酸 氫二鉀;優(yōu)選斜面培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖30g/L，馬鈴薯浸出粉5g/L，KH 2P〇42g/L，瓊脂 15g/L，溶劑為水，pH值自然；（2)將斜面菌體接種至種子培養(yǎng)基，在25-28 °C、150rpm、體積裝 液量30 %條件下培養(yǎng)15天，獲得種子液;所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為:碳源10-50g/L，氮 源5-25g/L，無(wú)機(jī)鹽0.5-2g/L，溶劑為水，pH值自然;所述碳源為:葡萄糖、甘露醇、甘油、糊精 或半乳糖中的一種或任幾種，優(yōu)選葡萄糖;所述氮源為黃豆粉、蛋白胨或馬鈴薯浸出粉中的 一種或任幾種，優(yōu)選馬鈴薯浸出粉;所述無(wú)機(jī)鹽為磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀，優(yōu)選磷酸氫二 鉀;優(yōu)選種子培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖30g/L，馬鈴薯浸出粉10g/L，KH 2P〇42g/L，溶劑為 水，pH值自然；（3)將種子液以體積濃度5-10 % (優(yōu)選10 % )的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在 25-28 °C、150rpm、體積裝液量30 %條件下培養(yǎng)15天，獲得發(fā)酵液;所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組 成為:葡萄糖5-30g/L，馬鈴薯浸出粉10-25g/L，KH 2P〇4l_5g/L，溶劑為水，pH值自然。
[0016] 進(jìn)一步，所述發(fā)酵液分離純化方法可以采用常規(guī)的方法進(jìn)行提取分離，比如經(jīng)過(guò) 過(guò)濾得菌絲體，菌絲體干燥后可以用浸提、萃取、硅膠柱層析等常規(guī)方法和常用溶劑進(jìn)行提 取分離，具體優(yōu)選方法為：（1)將發(fā)酵液過(guò)濾，菌絲體干燥后用丙酮室溫浸泡提取三次，每次 1.6L，提取時(shí)間每次24小時(shí)，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)液體流出，獲得丙酮提取物；（2)將 步驟（1)丙酮提取物懸浮于水中，用乙酸乙酯萃取3次，每次500mL，合并有機(jī)層，減壓濃縮至 無(wú)液體流出，得乙酸乙酯萃取物；（3)將步驟(2)乙酸乙酯萃取物經(jīng)MCI CHP20P樹(shù)脂柱層析， 依次用體積比2:8的甲醇-水溶液，體積比3:7的甲醇-水溶液，體積比4:6的甲醇-水溶液，體 積比5 :5的甲醇-水溶液，體積比6:4的甲醇-水溶液洗脫，每個(gè)洗脫液洗脫2個(gè)柱體積，收集 體積比4:6的甲醇-水溶液的流出液；（4)將步驟(4)收集的流出液濃縮至干，用硅膠柱層析 進(jìn)行純化，依次用體積比8:1石油醚-乙酸乙酯、體積比6:1石油醚-乙酸乙酯、體積比4:1石 油醚-乙酸乙酯洗脫，每個(gè)洗脫液均洗脫2個(gè)柱體積，薄層層析檢測(cè)各個(gè)流出液，合并含目標(biāo) 組分的流出液，減壓濃縮即得倍半萜化合物。
[0017] 本發(fā)明還提供一種所述倍半萜化合物在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明所涉及的倍半萜化合物具 有比上市藥物阿卡波糖更好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，活性為阿卡波糖的4倍，而且其分子 量較小，因而具有服用量少的優(yōu)點(diǎn)。 (四）【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0020] 實(shí)施例1化合物1的制備方法
[0021] 1、發(fā)酵培養(yǎng)制備擴(kuò)展青霉發(fā)酵物
[0022] 1)菌種:擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理 中心，菌種編號(hào)為1511C0001ACCC37275。
[0023] 2)斜面培養(yǎng)及保存
[0024]固體培養(yǎng)基：葡萄糖3g，馬鈴薯浸出粉0 · 5g，KH2P〇4〇 · 2g，瓊脂1 · 5g，加水到100mL， pH值自然。
[0025] 固體培養(yǎng)方法:擴(kuò)展青霉菌株接種于固體培養(yǎng)基斜面上，28°C培養(yǎng)5-7天。固體培 養(yǎng)結(jié)束后，斜面放置4-10°C冷藏備用。30%的甘油冷凍管的制備:在無(wú)菌狀態(tài)下，將試管斜 面用6ml滅菌的30%甘油洗下，分裝至甘油管中（3ml/支），放置-20°C冷藏備用。
[0026] 3)搖瓶種子培養(yǎng)
[0027]培養(yǎng)基:葡萄糖3g，馬鈴薯浸出粉lg，KH2P〇4〇. 2g，加水到100mL，pH值自然。
[0028] 裝液量:500mL三角瓶里裝150mL培養(yǎng)基
[0029] 接種量:30%的甘油冷凍菌絲3mL
[0030] 培養(yǎng)溫度：28 Γ [0031] 培養(yǎng)時(shí)間：7天 [0032]搖床轉(zhuǎn)速：150rpm
[0033]將30%的甘油冷凍菌絲按以上接種量接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后，鏡檢菌絲 粗壯，染色深，無(wú)染菌，菌濃多15%。
[0034] 4)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
[0035]培養(yǎng)基:葡萄糖2g，馬鈴薯浸出粉2 · 5g，KH2P〇4〇 · 2g，加水到100mL，pH值自然。
[0036] 裝量:500mL三角瓶里裝150mL培養(yǎng)基，共使用300個(gè)三角瓶。
[0037]接種量:培養(yǎng)基體積的10% ;
[0038] 培養(yǎng)溫度：28 Γ;
[0039] 培養(yǎng)時(shí)間：15天；
[0040] 搖床轉(zhuǎn)速:150rpm;
[0041] 2、提取分離獲得化合物1
[0042]過(guò)濾發(fā)酵產(chǎn)物，濾餅干燥獲得發(fā)酵產(chǎn)物菌絲體共400g。
[0043]擴(kuò)展青霉的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾得菌絲體，菌絲體干燥后(400g)用丙酮室溫浸泡提取三 次(每次1.6L，提取時(shí)間每次24小時(shí)），合并提取液，減壓濃縮得提取物(52.5g);將上述提取 物懸浮于500mL水中，用乙酸乙酯萃取3次(每次500mL)，合并有機(jī)層，減壓濃縮后得乙酸乙 酯提取物(23.5g)。乙酸乙酯提取物經(jīng)MCI CHP20P樹(shù)脂柱層析，洗脫條件為（甲醇-水2:8,甲 醇-水3:7，甲醇-水4:6，甲醇-水5:5，甲醇-水6:4，以上體積比例溶劑均洗脫2個(gè)柱體積），收 集甲醇-水(4:6)部分(3.6g)。上述部分用硅膠柱層析進(jìn)行純化，洗脫條件為(石油醚-乙酸 乙酯8:1，石油醚-乙酸乙酯6:1，石油醚-乙酸乙酯4:1，以上每個(gè)體積比例均洗脫2個(gè)柱體 積）。以石油醚-乙酸乙酯3:2為展開(kāi)劑進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并比移值(Rf值)為0.6左右的 部分，減壓濃縮即得化合物1 (14mg)。
[0044] 實(shí)施例2化合物1的理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)
[0045] 化合物1:白色無(wú)定型粉末;分子式為C15H2Q〇4;旋光[α]秒-36 · 7(c0 · 15，MeOH);紅 外 vmax3441，2923，2583，1745，1649，1462，1356，1266，1208，1144，1064，996，923，883，848， 762，722，690cm-1;氫譜及碳譜見(jiàn)表 1;高分辨質(zhì)譜(ESI )m/z: 265.1426 [M+H] +。
[0046] 表1化合物1核磁數(shù)據(jù)
[0047]
[0049] 實(shí)施例3化合物1的α-葡萄糖苷酶抑制活性
[0050] 將25yL、0.085U/mLa-葡萄糖苷酶的磷酸鉀緩沖溶液(pH 6.8)及100yL含有不同濃 度(0.48、0.24、0.12、0.06、0.03mg/mL)化合物1的磷酸鉀緩沖液(pH 6.8)加入96孔板中，混 合均勻，（各濃度對(duì)應(yīng)的背景組此時(shí)加入80yL 1.0M Na2C03水溶液終止反應(yīng)），在37°C孵育 15min。加入25yL濃度為5.0mM的4-硝基酚-β-D-吡喃糖葡萄糖苷(pNPG)磷酸鉀緩沖液，在37 °C孵育30min后，加入80yL 1.0M Na2C03水溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀出405nm的吸光值并計(jì) 算抑制率，抑制率=l-(AnAtiess)/(As[a-Asatf；)，其中，Anas為加入待測(cè)樣品但不發(fā)生酶 促反應(yīng)時(shí)體系的吸光度，Asass為不加待測(cè)樣品時(shí)體系的吸光度；同時(shí)設(shè)置空白組和陽(yáng)性對(duì) 照組，空白組不添加化合物1，陽(yáng)性對(duì)照組用阿卡波糖替代化合物1。根據(jù)不同濃度下抑制率 計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC5Q)?；?及陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖的IC5Q值見(jiàn)表2。
[0051]從表中數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明涉及的化合物1具有很強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其活 性約為陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖的4倍。
[0052]化合物1有望成為新型的α-葡萄糖苷酶抑制劑藥物用于糖尿病的治療。
[0053]表2化合物1的α-葡萄糖苷酶抑制活性
[0054]
[0055] 對(duì)比例lexpansolide Α的α-葡萄糖苷酶抑制活性
[0056]
[0057] expansolide Α的結(jié)構(gòu)式
[0058] 對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例3。
[0059] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，expansolide Α在同等條件下，活性極弱，其IC5〇>100mM。
[0060] 對(duì)比例2采用相同菌株發(fā)酵還可獲得其他類(lèi)型的化合物
[0061] Alantrypinone
[0062]
[0063] Alantrypinone 的結(jié)構(gòu)式 [0064]制備過(guò)程的發(fā)酵部分同實(shí)施例1。
[0065] 提取分離過(guò)程如下：
[0066]過(guò)濾發(fā)酵產(chǎn)物，濾餅干燥獲得發(fā)酵產(chǎn)物菌絲體共400g。
[0067]擴(kuò)展青霉的發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾得菌絲體，菌絲體干燥后(400g)用丙酮室溫浸泡提取三 次(每次1.6L，提取時(shí)間每次24小時(shí)），合并提取液，減壓濃縮得提取物(52.5g);將上述提取 物懸浮于500mL水中，用乙酸乙酯萃取3次(每次500mL)，合并有機(jī)層，減壓濃縮后得乙酸乙 酯提取物(23.5g)。乙酸乙酯提取物經(jīng)MCI CHP20P樹(shù)脂柱層析，洗脫條件為（甲醇-水2:8,甲 醇-水3:7，甲醇-水4:6，甲醇-水5:5，甲醇-水6:4，以上體積比例溶劑均洗脫2個(gè)柱體積），收 集甲醇-水(3:7)部分（1.2g)。上述部分用0DS C18柱層析進(jìn)行純化，洗脫條件為（甲醇-水 30:70，甲醇-水35:65，甲醇-水40:60，以上每個(gè)體積比例均洗脫2個(gè)柱體積），收集甲醇-水 40:60洗脫部分(132mg)。該部分再以硅膠柱層析分離，洗脫條件為石油醚-乙酸乙酯1:1，以 氯仿-甲醇10:1為展開(kāi)劑進(jìn)行薄層層析檢測(cè)，合并比移值(Rf值)為0.7左右的部分，減壓濃 縮即得化合物Alantrypinone(7mg) 〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種式(I)所示的倍半萜化合物，y2. -種權(quán)利要求1所述倍半萜化合物的制備方法，其特征在于所述方法是將擴(kuò)展青霉 接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在25-28°C、150rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，獲得所述 倍半砲化合物;所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為碳源5_30g/L、氮源10-25g/L、無(wú)機(jī)鹽l-5g/L， 溶劑為水，pH值自然。3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述碳源為：葡萄糖、甘露醇、甘油、糊精或半 乳糖中的一種或任幾種。4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述氮源為黃豆粉、蛋白胨或馬鈴薯浸出粉中 的一種或任幾種。5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述無(wú)機(jī)鹽為磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀。6. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于擴(kuò)展青霉為中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中 心菌種編號(hào)為1511C0001ACCC37275的擴(kuò)展青霉。7. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于擴(kuò)展青霉發(fā)酵液制備方法為：（1)將擴(kuò)展青霉 接種至斜面培養(yǎng)基，在25-28 °C培養(yǎng)5-7天，獲得斜面菌體;所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為： 葡萄糖10-30g/L，馬鈴薯浸出粉5-25g/L，KH 2P〇4 0.5-2g/L，瓊脂10-20g/L，溶劑為水，pH值 自然；（2)將斜面菌體接種至種子培養(yǎng)基，在25-28 °C、150rpm、體積裝液量30 %條件下培養(yǎng) 15天，獲得種子液;所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖10_50g/L，馬鈴薯浸出粉5-25g/ L，KH2P〇4 0.5-2g/L，溶劑為水，pH值自然；（3)將種子液以體積濃度5-10%的接種量接種至 發(fā)酵培養(yǎng)基，在25-28°C、150rpm、體積裝液量30%條件下培養(yǎng)15天，獲得發(fā)酵液;所述發(fā)酵 培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖5_30g/L，馬鈴薯浸出粉l〇-25g/L，KH 2P〇4 l_5g/L，溶劑為水， pH值自然。8. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵液分離純化方法為：（1)將發(fā)酵液過(guò) 濾，菌絲體干燥后用丙酮室溫浸泡提取三次，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)液體流出，獲得丙 酮提取物；（2)將步驟(1)丙酮提取物懸浮于水中，用乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)層，減壓濃 縮至無(wú)液體流出，得乙酸乙酯萃取物；（3)將步驟(2)乙酸乙酯萃取物經(jīng)MCI CHP20P樹(shù)脂柱 層析，依次用體積比2:8的甲醇-水溶液，體積比3:7的甲醇-水溶液，體積比4:6的甲醇-水溶 液，體積比5:5的甲醇-水溶液，體積比6:4的甲醇-水溶液洗脫，每個(gè)洗脫液洗脫2個(gè)柱體積， 收集體積比4:6的甲醇-水溶液的流出液；（4)將步驟(4)收集的流出液濃縮至干，用硅膠柱 層析進(jìn)行純化，依次用體積比8:1的石油醚-乙酸乙酯溶液、體積比6:1的石油醚-乙酸乙酯 溶液、體積比4:1的石油醚-乙酸乙酯溶液洗脫，每個(gè)洗脫液均洗脫2個(gè)柱體積，薄層層析檢 測(cè)各個(gè)流出液，合并含目標(biāo)組分的流出液，減壓濃縮即得倍半萜化合物。9. 一種權(quán)利要求1所述倍半萜化合物在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P17/18GK106008547SQ201610324071
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】應(yīng)優(yōu)敏, 姚楓麒, 方成安, 占扎君, 單偉光
【申請(qǐng)人】浙江工業(yè)大學(xué)