一種十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及近紅外菁染料藥物載體的技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽（BS?CyP）及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明將巰基十二硼烷二鈉鹽（BSH）通過共價鍵結(jié)合于馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁鹽（CyP）上獲得所述共聚物BS?CyP。所述制備方法操作簡單，效率高。所述共聚物用于對BSH的體外檢測以及體內(nèi)顯影示蹤，有利于實現(xiàn)硼中子治療過程中的實時檢測與硼靶標(biāo)的體內(nèi)精確定位。本發(fā)明通過熒光分子載體共價結(jié)合目標(biāo)小分子的模式形成的共聚物可以保障示蹤顯影的準(zhǔn)度與精度，避免采用包合手段進(jìn)行藥物顯影示蹤時，熒光物質(zhì)滲漏導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。
【專利說明】
一種十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽及其制備 方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及近紅外菁染料藥物載體的技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及，一種十二硼烷馬來 酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽及其制備方法和應(yīng)用。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 硼中子革巴向捕獲治療（Boron Neutron Capture Therapy;BNCT)概念起源至今有 七十年以上，1951年，W. Sweet等神經(jīng)外科醫(yī)生首次使用硼中子捕獲療法治療腦膠質(zhì)細(xì)胞 瘤，BNCT的主要原理在于將含硼-10同位素的藥物以臨床有效之方式施予腫瘤細(xì)胞中，然后 透過熱中子源的照射，產(chǎn)生具有強大生物效應(yīng)的α粒子及反跳性鋰核，對腫瘤細(xì)胞造成致死 性破壞(如雙股螺旋DNA的斷裂）。更重要的是，反應(yīng)所產(chǎn)生的α粒子及鋰粒子的射程極短(9μ m及5μπι)，不超過一般單一腫瘤細(xì)胞之直徑范圍（約10-20μπι)，由于腫瘤細(xì)胞相對具有較明 顯的對含硼藥物吸收能力，因此核反應(yīng)后破壞的范圍僅局限于腫瘤細(xì)胞周圍，對于正常細(xì) 胞以及組織，并不會造成太大之損害，不但能有效地破壞腫瘤細(xì)胞(α粒子之生物效應(yīng)為傳 統(tǒng)光子的三倍），相對于傳統(tǒng)放射線治療對腫瘤組織旁周邊正常組織具有較低之傷害性。除 此之外，BNCT主要透過利用調(diào)控腫瘤內(nèi)含硼藥物濃度的高低來影響腫瘤治療反應(yīng)，因此靶 向?qū)⒏吆鹚幬镒饔糜谀[瘤細(xì)胞，是實現(xiàn)腫瘤治療效果的關(guān)鍵所在。
[0004] 現(xiàn)行由美國FDA批準(zhǔn)為臨床試治藥物巰基十二硼烷二鈉鹽(Na2B12H nSH，簡稱BSH)， 是一種巰基多面體硼籠化合物。要想實現(xiàn)良好的治療效果，通常臨床要求富集在每克腫瘤 的硼的濃度要達(dá)到10~30微克，BSH雖然具有很高的含硼量，但是基本不具有靶向性，因此 其在病灶部位的監(jiān)測，是有效控制其治療效果的重要手段。
[0005] 不容忽視的是，限制BNCT運用的一個重大因素就是硼含量的檢測問題，BNCT的治 療效果取決于硼的含量以及中子源照射的強度，根據(jù)硼的含量及時調(diào)整中子照射的強度， 目前，硼元素的檢測主要依賴于ICP-MS，這大大限制了檢測范圍，并且無法實現(xiàn)活體檢測， 因此發(fā)明一種更為新穎的檢測手段具有非常重要的臨床意義。同時，值得關(guān)注的是，中子照 射的位置取決于硼原子所在的位置，能夠正確的顯示硼所在的位置就顯得至關(guān)重要，這也 是個體化治療、定向治療、降低放射療法副作用提出的必然要求。
[0006] 有研究將BSH與熒光材料或磁性材料特定方法包裹在一起形成特定制劑，再利用 熒光或核磁共振的技術(shù)對其示蹤，一定程度上解決了 ICP-MS不能用于活體內(nèi)檢測的問題。 但這種方式的缺陷是，一旦所得制劑在體內(nèi)由于各種原因分解，BSH與熒光材料或磁性材料 在生物體內(nèi)則存在分離可能，觀察到的熒光或核磁信號并不能代表真正BSH的位置與強度， 造成檢測誤差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種十二硼烷馬來酰亞 胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁鹽(簡稱CyP)與巰 基十二硼烷的共聚物十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽(簡稱BS-CyP)的制備 方法。
[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽的應(yīng) 用。
[0010]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0011] -種十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽，所述化合物為2-(-2-(-2-(4-(3-(3-十二硼烷基-2，5_二氧-吡咯-1-基)丙?；?哌嗪-1-基)-3-(-2-(1-乙基-3，3_二 甲基吲哚-2-叉)亞乙基)環(huán)己-1-烯-1-基）乙烯基)-1-乙基_3,3二甲基-3H-1-吲哚鹽，所述 共聚物的結(jié)構(gòu)式如式1所示：
[0012；
[0013] 其中，所述硼元素為硼10同位素;X+為藥學(xué)上可接受的陽離子。
[0014] 優(yōu)選地，所述X+為Na+。
[0015] 本發(fā)明通過馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁鹽CyP上強親電基團的馬來酰亞胺結(jié)構(gòu) 與未核基團如氣基、疏基之間的尚反應(yīng)活性，將含有疏基的棚中子藥物疏基十^?棚燒^?納 鹽(BSH)高效的共價結(jié)合到CyP上，形成十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽BS-CyP〇
[0016] 馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁鹽CyP具有優(yōu)良的共價結(jié)合有機小分子、多肽、蛋白 質(zhì)等物質(zhì)的能力，且具有熒光示蹤性能，本發(fā)明將BSH通過共價鍵作用與特定的馬來酰亞胺 丙酰哌嗪七甲川菁鹽CyP相連，所獲得的穩(wěn)定共聚物分子BS-CyP，使得硼元素的含量與共聚 物的熒光強度密切相關(guān)，在實施硼中子治療時，在檢測中觀察到的熒光位置即為硼靶位置， 實現(xiàn)所見即所得，可以克服非共價結(jié)合時顯影劑滲漏帶來的假陽性的結(jié)果。同時，也可以在 實現(xiàn)治療效應(yīng)的同時，最大程度的降低放射性治療對正常組織的損傷。
[0017] -種所述十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽的制備方法，包括以下制 備步驟：
[0018]
[0019] SI.用水將巰基十二硼烷鹽溶解，再加入堿后攪拌均勻；
[0020] S2.將馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁鹽用有機溶劑溶解后，加入S1制得的巰基十 二硼烷鹽溶液，常溫避光反應(yīng)，分離后得到所述共聚物。
[0021] 優(yōu)選地，S1中所述堿為碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀或三乙胺、N，N_二異丙 基乙胺中一種或幾種;通過S1的處理使巰基獲得強的親核性；
[0022] S2中所述有機溶劑為乙腈、二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃中的一種或幾種。
[0023] 優(yōu)選地，一種十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽的制備方法，包括以 下步驟：
[0024] S1.用水將巰基十二硼烷二鈉鹽溶解后，加入其2倍物質(zhì)的量的N，N-二異丙基乙胺 后攪拌5-10分鐘，使巰基獲得強的親核性；
[0025] S2.將與巰基十二硼烷二鈉鹽相等物質(zhì)的量的馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁鹽用 乙腈溶解后，加入到S1制得的巰基十二硼烷二鈉鹽溶液中，常溫避光反應(yīng)2小時，薄層層析 色譜監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。旋干有機溶劑，用乙醇將剩余的水共沸蒸出，二氯甲烷/甲醇體系柱層 析提純后得到所述共聚物。
[0026] -種所述十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽在制備硼中子治療藥物 中的應(yīng)用。
[0027] -種所述十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽在制備硼中子治療中定 位示蹤試劑的應(yīng)用。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0029] 本發(fā)明充分利用馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁鹽上的馬來酰亞胺結(jié)構(gòu)，快速高效 的將高含硼的巰基十二硼烷二鈉鹽掛載在馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁鹽上，利用馬來酰 亞胺丙酰哌嗪七甲川菁鹽具有熒光示蹤性能，實現(xiàn)了對含硼藥物的近紅外熒光標(biāo)記，具備 了含硼藥物在體內(nèi)示蹤的先決條件。
[0030] 本發(fā)明通過熒光分子載體共價結(jié)合目標(biāo)小分子的模式形成的共聚物可以保障示 蹤顯影的準(zhǔn)度與精度，避免采用包合手段進(jìn)行藥物顯影示蹤時，熒光物質(zhì)滲漏導(dǎo)致的假陽 性結(jié)果。
【附圖說明】
[0031] 圖1為BS-CyP與CyP的紫外可見光譜圖；
[0032]圖2為BS-CyP與ICG的熒光光譜圖；
[0033]圖3為BS-CyP對人腎上皮細(xì)胞293、人肝癌細(xì)胞HepG2和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞3T3細(xì) 胞毒性結(jié)果；
[0034]圖4為BS-CyP在4T1細(xì)胞株內(nèi)的細(xì)胞成像圖。A、B、C分別代表BS-CyP濃度為50yg/ mL、100yg/mL和200yg/mL時細(xì)胞成像圖；
[0035]圖5為BS-CyP在4T1移植瘤小鼠體內(nèi)的顯影示蹤圖。A圖表示尾靜脈注射BS-CyP 24、48、72h小鼠成像圖；B圖表示該時段內(nèi)小鼠腫瘤區(qū)域的熒光強度。
【具體實施方式】
[0036]下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明實施例中采用的 原料、設(shè)備和方法為本領(lǐng)域常規(guī)市購的原料、常規(guī)使用的設(shè)備和方法，BS-CyP以鈉鹽為實施 例做具體的說明。
[0037]實施例1十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鈉鹽的制備本實施中的2-(_ 2-(-2-(4-(3-(2，5_ 二氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基）丙?；?哌嗪-1-基)-3-(-2-(1-乙基-3，3_二甲基吲哚-2-叉)亞乙基)環(huán)己-1-烯-1-基）乙烯基)-1-乙基-3,3二甲基-3H-吲哚碘 化物，即馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁碘化物(CyP)有以下方法制備得到。制備方法包括以 下步驟：
[0038] S1:將327.01mg( 3.80mM)的哌嗪加入單頸瓶，加入適量的乙腈溶解，升溫至40 °C攪 拌，隨后稱取240.40mg(0.38mM)的氯代七甲川菁碘化物，用適量乙腈溶解后緩慢滴加于哌 嗪溶液中，薄層層析法監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)液逐漸由翠綠色變?yōu)樗{(lán)色，2~3h反應(yīng)完全后，旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用二氯甲烷/水體系萃取，合并有機層，旋干二氯甲烷，多余的水分采用乙 醇共沸蒸出，得到中間體2粗品301mg，產(chǎn)率93.11%。產(chǎn)物經(jīng)低分辨質(zhì)譜確證為561.1，與理 論計算值相符。粗品避光保存，也可直接用于下一步反應(yīng)。
[0039] S2:稱取115 · 9mg(0 · 68mM)的3-馬來酰亞胺丙酸，投入于100mL的單頸瓶，加入適量 乙腈溶解，取96.6mg(0.77mM)的N，N-二異丙基碳二亞胺加入單頸瓶中，室溫攪拌lh。取 120mg的中間體2，用乙腈溶解后緩慢加入到單頸瓶中，室溫攪拌3h，薄層層析法監(jiān)測反應(yīng)進(jìn) 程，反應(yīng)完畢后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用二氯甲烷/甲醇體系作為流動相硅膠柱層析提純，得 至lj 113mg的終產(chǎn)物CyP，產(chǎn)率78.51 %。質(zhì)譜經(jīng)驗證為712.1，與理論計算值相符。核磁共振氫 譜：1!1匪1?(40010^，0)(^3)37.76((1，了=13.6!^，2!1)，7.35(^ = 7.4!^，4!1)，7.18(^ = 7.5Hz,2H) ,7.02 (d,J = 7.8Hz, 2H) ,6.74( s,2H) ,5.93 (d,J= 13.5Hz, 2H) ,4.07(q,J = 7.1Hz,4H),3.96(t,2H),3.89-3.82(m,4H),3.81-3.75(m,2H),3.63-3.54(m,2H),2.87(t,J = 7.3Hz,2H),2.54(t ,J = 6.4Hz,4H),1.87(m ,J=12.8,6.4Hz,2H),1.69(s,12H),1.42(t ,J = 7.2Hz,6H)〇
[0040] 本實施例十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鈉鹽的制備方法包括以下 步驟：
[0041] 方法一、
[0042] 準(zhǔn)確稱取25.2mg(0.12mM)的巰基十二硼烷二鈉鹽(BSH)于10mL的單頸瓶中，加入 2mL的水溶解，然后加42yL(0.24mM)的N，N -二異丙基乙胺，攪拌5分鐘。稱取CyP 35.4mg (0.042mM)，用2mL乙腈溶解后加入到上述巰基十二硼烷二鈉鹽溶液中，氮氣保護，避光，常 溫攪拌，薄層層析色譜(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，3小時后關(guān)停反應(yīng)，旋干溶劑，二氯甲烷/甲醇體 系柱層析提純，得到20mg的純品，產(chǎn)率52.23%。質(zhì)譜測定數(shù)據(jù)為876.6,與理論計算值相符。
[0043] ΧΗ NMR(400MHz,DMS0)57.70(d ,J= 13.6Hz, 2Η) ,7.57(d ,J = 7.3Hz , 2H), 7.35(t ,J = 7.7Hz,2H),7.27(d,J = 7.9Hz,2H),7.16(t,J = 7.4Hz,2H),5.99(d,J=13.6Hz,2H) ,4.11 (q,J = 12.9,5.9Hz,4H) ,3.81-3.69(m,4H) ,3.69-3.60(m,4H) ,3.62-3.53(m,J = 8.1, 3.1Hz,4H) ,3.01(dd,J=18.5,8.1Hz,lH),2.90(d,J = 4.9Hz,2H),2.72(d,2H) ,2.68(dt,J = 15.7,7.7Hz,2H),1.80-1.73(m,2H),1.26(t ,J = 7.1Hz,6H)0.5-1.2(m,llH)〇
[0044] 方法二、
[0045] 準(zhǔn)確稱取44.0mg(0.21mM)的巰基十二硼烷二鈉鹽于lOmL的單頸瓶中，加入2mL的 水溶解，然后加44 · 5mg(0 · 42mM)的碳酸鈉，攪拌10分鐘。稱取CyP88 · lmg(0 · 105mM)，用2mL二 氯甲烷溶解后加入到上述巰基十二硼烷二鈉鹽溶液中，氮氣保護，避光，常溫攪拌，薄層層 析色譜(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，10小時后關(guān)停反應(yīng)，旋干溶劑，二氯甲烷/甲醇體系柱層析提 純，得到51.3mg的純品，產(chǎn)率54.31 %。質(zhì)譜測定數(shù)據(jù)為876.6，與理論計算值相符。
[0046] ΧΗ NMR(400MHz,DMS0)57.70(d ,J= 13.6Hz, 2Η) ,7.57(d ,J = 7.3Hz , 2H), 7.35(t ,J = 7.7Hz,2H),7.27(d,J = 7.9Hz,2H),7.16(t,J = 7.4Hz,2H),5.99(d,J=13.6Hz,2H) ,4.11 (q,J = 12.9,5.9Hz,4H) ,3.81-3.69(m,4H) ,3.69-3.60(m,4H) ,3.62-3.53(m,J = 8.1, 3.1Hz,4H) ,3.01(dd,J=18.5,8.1Hz,lH),2.90(d,J = 4.9Hz,2H),2.72(d,2H) ,2.68(dt,J = 15.7,7.7Hz,2H),1.80-1.73(m,2H),1.26(t ,J = 7.1Hz,6H)0.5-1.2(m,llH)〇
[0047] 方法三、
[0048] 準(zhǔn)確稱取42.0mg(0.2mM)的巰基十二硼烷二鈉鹽于lOmL的單頸瓶中，加入2mL的水 溶解，然后加55.3mg(0.4mM)的三乙胺，攪拌8分鐘。稱取CyP 84. lmg(0.1 mM)，用2mL四氫呋 喃溶解后加入到上述巰基十二硼烷二鈉鹽溶液中，氮氣保護，避光，常溫攪拌，薄層層析色 譜(TLC)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，6小時后關(guān)停反應(yīng)，旋干溶劑，二氯甲烷/甲醇體系柱層析提純，得到 52.3mg的純品，產(chǎn)率58.12%。質(zhì)譜測定數(shù)據(jù)為876.6,與理論計算值相符。
[0049] ΧΗ NMR(400MHz,DMS0)57.70(d ,J= 13.6Hz, 2Η) ,7.57(d ,J = 7.3Hz , 2H), 7.35(t ,J = 7.7Hz,2H),7.27(d,J = 7.9Hz,2H),7.16(t,J = 7.4Hz,2H),5.99(d,J=13.6Hz,2H) ,4.11 (q,J = 12.9,5.9Hz,4H) ,3.81-3.69(m,4H) ,3.69-3.60(m,4H) ,3.62-3.53(m,J = 8.1, 3.1Hz,4H),3.01(dd ,J=18.5,8.1Hz,lH),2.90(d ,J = 4.9Hz,2H),2.72(d,2H),2.68(m ,J = 15.7,7.7Hz,2H),1.80-1.73(m,2H),1.26(t,J=7.1Hz,6H)0.5-1.2(m,llH)〇
[0050] 實施例2理化性質(zhì)實驗
[0051] (一)十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鈉鹽BS-CyP的紫外可見光譜 [0052]實施例1中制備得到的馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁鹽與巰基十二硼烷的共聚物 溶于甲醇中，制備濃度為ImM的儲備液，稀釋至3.13μΜ，分別掃描紫外吸收光譜，測得其紫外 可見光譜如圖1所示。由圖1中BS-CyP呈現(xiàn)雙吸收峰，最大吸收波長為765nm和703nm，對比 CyP的吸收光譜，兩者的吸收圖譜趨勢基本一致，有相同的最大吸收雙峰，表明BSH的引入基 本不影響CyP的光學(xué)性質(zhì)。
[0053](二)十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鈉鹽的熒光光譜 [0054]將ICG和實施例1中配制的BS-CyP的倍半稀釋液用于掃描熒光光譜，激發(fā)波長 700nm，檢測波長范圍為750-850nm，測得的熒光光譜如圖2所示。由圖2可知，在選擇700nm激 發(fā)波長情況下，BS-CyP的最大發(fā)射波長為792nm，斯托克斯位移為89nm;ICG的最大發(fā)射波長 為825nm，與其最大吸收峰相比，斯托克斯位移為35nm。這些數(shù)據(jù)說明BS-CyP具有更好的熒 光光學(xué)性質(zhì)，可更方便地用于示蹤。
[0055]實施例3十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鈉鹽BS-CyP的細(xì)胞毒性實驗 [0056] 1.用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基對人腎上皮細(xì)胞293、人肝癌細(xì)胞HepG2和腫瘤相 關(guān)成纖維細(xì)胞3T3進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)及傳代。將胰酶消化的細(xì)胞懸浮液(3000個）以lOOyL/孔濃 度接種于96孔板中，在5 % C02及37 °C條件培養(yǎng)24h。
[0057] 2. BS-CyP分別在設(shè)定藥物濃度范圍內(nèi)（6.25~200yg/mL BS-CyP)設(shè)置6個加藥濃 度梯度：6 · 25yg/mL、12 · 5yg/mL、25yg/mL、50yg/mL、100yg/mL 和200yg/mL，同時設(shè)置等體積 藥物溶媒的空白對照組。經(jīng)加藥處理24h、48h后，采用MTT檢測細(xì)胞的存活率。細(xì)胞毒性結(jié)果 如圖3所示，BS-CyP在6.25~200yg/mL濃度范圍內(nèi)對正常細(xì)胞株人腎上皮細(xì)胞293及人肝癌 細(xì)胞HepG2和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞3T3作用24h均未顯示細(xì)胞毒性。BS-CyP在濃度未超過100 yg/mL時與上述細(xì)胞株作用24h或48h未見明顯細(xì)胞毒性，成活率均在80%以上，但濃度為 200yg/mL時與3T3細(xì)胞作用48小時細(xì)胞存活率為60%，顯示出一定的細(xì)胞毒性，然而對293 和HepG2依舊未見明顯細(xì)胞毒性。
[0058] 實施例4十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鈉鹽BS-CyP體外成像圖 [0059] 精密稱取BS-CyP 5mg，加入100yL的DMS0攪拌使其混合均勻，配制50mg/mL的母液， 置于4°C冰箱保存。取長滿的4T1細(xì)胞，加入2mL胰酶消化2min后加入2mL完全培養(yǎng)基中和胰 酶。用lmL移液槍輕輕反復(fù)吹打皿壁使其進(jìn)入溶液中，然后收集于15mL的離心管中，lOOOrpm 離心5min后棄上清液，加入2mL新鮮培養(yǎng)基輕輕吹打均勻，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，取10000個細(xì) 胞加入裝有5mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，混合均勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取2份培養(yǎng)好的細(xì)胞棄 培養(yǎng)基，分別加入BS-CyP母液，使?jié)舛确謩e為50yg/mL、100yg/mL和200yg/mL，分別培養(yǎng)4h。 檢測條件:激發(fā)強度50 %，激發(fā)波長為700nm，發(fā)射波長為780nm〇
[0060] 結(jié)果表明高濃度和低濃度的BS-CyP與4T1細(xì)胞孵育后均能檢測出明顯的熒光，也 就是BS-CyP被4T1細(xì)胞攝取，攝取后可在近紅外區(qū)域內(nèi)發(fā)出熒光，說明BS-CyP具備熒光示蹤 的能力，濃度為l〇〇yg/mL時，熒光強度最大，濃度繼續(xù)升高到200yg/mL，熒光強度未見明顯 增高，可能是4T1細(xì)胞在100yg/mL濃度時對BS-CyP的攝取基本達(dá)到飽和狀態(tài)。結(jié)果如圖4示。
[0061] 實施例5:十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鈉鹽BS-CyP的體內(nèi)示蹤性 能考察。
[0062] 1.取腫瘤長至100mm3的4T1乳腺癌移植瘤小鼠，尾靜脈給藥2mL制備完成的BS-CYP 葉酸脂質(zhì)體溶液，分別在給藥24h、48h和72h以50%激發(fā)強度、激發(fā)波長為700nm、發(fā)射波長 為780nm的條件下檢測BS-CyP在小動物活體成像儀中的熒光情況。
[0063] 2.72h檢測完成后，脫日處死小鼠，取其心、肝、脾、肺、腎、腫瘤，在相同的條件下檢 測各器官與腫瘤的熒光強度，以此分析BS-CyP在動物體內(nèi)的分布特性。
[0064] 如圖5所示，結(jié)果表明BS-CyP經(jīng)尾靜脈注射后24h內(nèi)基本分布于小鼠體內(nèi)各處器 官，肝臟、腎臟處發(fā)出的熒光相對較強，腫瘤區(qū)域也顯示出一定的熒光，從注射24h起到72h 內(nèi)，腫瘤區(qū)域的熒光強度逐漸衰減，顯示出BS-CyP靈敏性的體內(nèi)示蹤效果。
[0065]綜上所述:本發(fā)明公開了十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽的制備及 其用途，高含硼藥物BSH通過共價鍵模式結(jié)合于馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁鹽CyP上，可 以通過CyP熒光載體的顯像功能精確確定硼原子的位置，同時通過熒光檢測的方式可以避 免ICP-MS監(jiān)測硼元素濃度帶來的不足，從而大大簡化技術(shù)流程，MTT實驗表明BS-CyP對正常 細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性小，安全性強。示蹤結(jié)果表明，BS-CyP在細(xì)胞水平和動物體內(nèi)水 平都具有顯影的特性，為熱中子轟擊提供了奠定了重要的基礎(chǔ)。
【主權(quán)項】
1. 一種十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽，其特征在于，所述化合物為2-(-2-(-2-(4-(3-(3-十二硼烷基-2，5_二氧-吡咯-1-基)丙酰基)哌嗪-1-基)-3-(-2-(1-乙 基-3,3-二甲基吲哚-2-叉)亞乙基)環(huán)己-1-烯-1-基）乙烯基)-1-乙-3,3二甲基-3!1-1-吲哚 鹽，所述共聚物的結(jié)構(gòu)式如式1所示：其中，所述硼元素為硼10同位素;X+為藥學(xué)上可接受的陽離子。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽，其特征在于，所 述X+為鈉離子。3. -種權(quán)利要求1~2所述十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽的制備方法， 其特征在于，包括以下制備步驟：51. 用水將巰基十二硼烷鹽溶解，再加入堿后攪拌均勻；52. 將馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁鹽用有機溶劑溶解后，加入Sl制得的巰基十二硼 烷鹽溶液，常溫避光反應(yīng)，分離后得到所述共聚物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽的制備方法，其 特征在于，Sl中所述堿為碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀或三乙胺、N，N-二異丙基乙胺 中一種或幾種； S2中所述有機溶劑為乙腈、二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃中的一種或幾種。5. -種權(quán)利要求1~2所述十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽在制備硼中 子治療藥物中的應(yīng)用。6. -種權(quán)利要求5所述十二硼烷馬來酰亞胺丙酰哌嗪七甲川菁硫醚鹽在制備硼中子治 療中定位示蹤試劑的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K49/00GK106008578SQ201610411511
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】卜憲章, 杜軍, 黃景溫, 蔡紹暉, 陳道遠(yuǎn)
【申請人】煦普生物技術(shù)（珠海）有限公司