一種抗菌肽se37及其應(yīng)用
【專利摘要】本專利公開了生物技術(shù)領(lǐng)域的一種抗菌肽SE37，其氨基酸序列為：Ser?Glu?Thr?Arg?Pro?Val?Leu?Asn?Arg?Leu?Phe?Asp?Lys?Ile?Arg?Gln?Val?Ile?Arg?Lys?Phe?Glu?Lys?Gly?Ile?Lys?Glu?Lys?Ser?Lys?Arg?Phe?Phe?Asp?Gly?Leu?Leu。通過實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明抗菌肽不但對大腸桿菌，銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球菌，四種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，而且具有很低的溶血活性，穩(wěn)定性好，抗菌活性強(qiáng)，具有高效廣譜抑菌作用，可作為抗生素替代品使用。
【專利說明】
一種抗菌肽SE37及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域的一種多肽，具體涉及一種抗菌肽SE37及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物體防御外界病原體侵襲時產(chǎn)生的 由基因編碼、核糖體合成的一類小分子活性多肽，是生物體內(nèi)先天性防御系統(tǒng)的重要組成 成分。AMP作為一種生物活性小分子，普遍具有抗細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲等活性，另外，還可 以作為藥物傳遞載體，抗腫瘤劑，免疫調(diào)節(jié)劑以及信號分子等。
[0003] 抗生素作為一類重要的臨床用藥，自被應(yīng)用以來已拯救了無數(shù)人的生命，但近年 來，由于藥物濫用藥物殘留和細(xì)菌耐藥性等問題日益嚴(yán)重，越來越多的國家開始尋求抗生 素替代品，而抗菌肽因其獨(dú)特的生物活性以及不同于傳統(tǒng)抗生素的特殊的作用機(jī)理，已成 為最具潛力的抗生素替代品之一，同時在新型食品、藥品、護(hù)膚品以及化妝品防腐劑中的應(yīng) 用也越來越廣泛，具有良好的發(fā)展前景。
[0004] 抗菌肽的相關(guān)研究最早可以追溯到1975年，當(dāng)時瑞典科學(xué)家G.Bomam等在惜古比 天才蛹中注入大腸桿菌，之后在其血液淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種具有抗菌活性的堿性多肽類 物質(zhì)，即抗菌肽Ceropins。經(jīng)過40幾年的研究，目前已從動物、植物、細(xì)菌和病毒中發(fā)現(xiàn)了超 過2500種抗菌肽。
[0005] 雖然天然抗菌肽具有普遍的優(yōu)點(diǎn)，但也存在著某些明顯的不足。例如，相當(dāng)一部分 天然的抗菌肽抑菌活性較低、穩(wěn)定性較差、毒性較高，或者導(dǎo)致真核細(xì)胞發(fā)生溶血等；另外， 部分抗菌肽對耐藥菌的抑制效果差，不能滿足實(shí)際應(yīng)用的要求;而通過對天然抗菌肽進(jìn)行 改造或全新合成得到的人工抗菌肽可以在很大程度上改善以上某些甚至所有缺點(diǎn)，以適應(yīng) 不同應(yīng)用需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對上述存在的技術(shù)問題，提供一種抑菌活性強(qiáng)、可有效抑制耐藥菌的抗 菌肽SE37。以及提供該抗菌肽在抗菌藥中的應(yīng)用范圍。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:一種抗菌肽SE37,所述抗菌肽 的氨基酸序列為：Ser-Glu-Thr-Arg-Pro-Val-Leu-Asn-Arg-Leu-Phe-Asp-Lys-Ile-Arg-Gln-Val-Ile-Arg-Lys-Phe-Glu-Lys-Gly-Ile-Lys-Glu-Lys-Ser-Lys-Arg-Phe-Phe-Asp-Gly-Leu-Leu 〇
[0008] 本發(fā)明的抗菌肽SE37中，S和E是短肽前兩個氨基酸的縮寫，37是氨基酸數(shù)，為本領(lǐng) 域的常規(guī)命名方法。該抗菌肽SE37不但對大腸桿菌，銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球菌，四種 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，而且具有很低的溶血活性，穩(wěn)定性好，抗菌 活性強(qiáng)，具有高效廣譜抑菌作用，可作為抗生素替代品使用。
[0009] 進(jìn)一步，所述抗菌肽SE37為α螺旋直鏈多肽，含有37個氨基酸殘基，分子量大小為 4504.40Da，等電點(diǎn)是 11.34。
[0010]進(jìn)一步，所述抗菌肽SE37應(yīng)用于制備抗菌劑。
[0011] 進(jìn)一步，所述抗菌肽SE37應(yīng)用于制備治療革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌感染的廣 譜抗菌藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)一步說明： 本發(fā)明抗菌肽SE37產(chǎn)品為SEQ ID NO. 1中的氨基酸序列，其序列為：Ser-Glu-Thr-Arg-Pr〇-Val-Leu-Asn-Arg-Leu-Phe-Asp-Lys-Ile-Arg-Gln-Val-Ile-Arg-Lys-Phe-Glu-Lys-Gly-Ile-Lys-Glu-Lys-Ser-Lys-Arg-Phe-Phe-Asp-Gly-Leu-Leu〇
[0013] 序列特征:序列類型為氨基酸序列，含有37個氨基酸殘基(該抗菌肽也可稱為抗菌 肽SE37)，分子量大小為4504.40Da，等電點(diǎn)是11.34，鏈型為α螺旋直鏈。
[0014] 本實(shí)施例抗菌肽SE37產(chǎn)品是采用自動多肽合成儀按照常規(guī)多肽固相合成，最終得 到的抗菌肽SE37經(jīng)高效液相色譜分析，其純度多98%，其具體的合成步驟如下： 1)樹脂溶漲:稱取取代度為〇.4mmol/g的0.6g 2-Chlorotrityl Chloride Resin樹 月旨，將樹脂放入反應(yīng)管中，加 DCM( 15ml/g)溶劑，振蕩30min。
[0015] 2)接第一個氨基酸:通過沙芯抽濾掉DCM溶劑，加入3倍樹脂物質(zhì)的量的Fm〇C-L-Leu-OH氨基酸，再加入10倍樹脂物質(zhì)的量的DIEA，最后加入少量DMF溶解，振蕩lh后，用DMF 和DCM交替清洗6遍。
[0016] 3)脫保護(hù):加15ml 20%哌啶DMF溶液（15ml/g)，振蕩5min后抽掉哌啶DMF溶液，再 加 15ml 20%哌啶DMF溶液（15ml/g)，振蕩 15min。
[0017] 4)檢測：抽掉哌啶DMF溶液，取十幾粒樹脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚 溶液各一滴，105 °C~110°C加熱5min，變深藍(lán)色為陽性反應(yīng)。
[0018] 5)第一次清洗：依次用DMF(10ml/g)清洗兩次，甲醇（10ml/g)清洗兩次，DMF (10ml/g)清洗兩次。
[0019] 6)縮合:分別加入3倍樹脂物質(zhì)的量的Fmoc-L-Leu-OH氨基酸和HBTU到反應(yīng)管，用 盡量少的DMF溶解，立刻加入10倍樹脂物質(zhì)的量的NMM，反應(yīng)30min。
[0020] 7)第二次清洗:依次用DMF(10ml/g)清洗一次，甲醇（10ml/g)清洗兩次，DMF(10ml/ g)清洗兩次。
[0021] 8)重復(fù)二至六步操作，從右到左依次連接序列中的氨基酸。
[0022] 9)最后一個氨基酸連接后，脫保護(hù)，按照下列方法洗樹脂:DMF(10ml/g)兩次，甲 醇（10ml/g)兩次，DMF(10ml/g)兩次，DCM(10ml/g)兩次，抽干 10min。
[0023] 10)從樹脂上切割多肽:樹脂和切割液比例按照10ml/g，恒溫振蕩120min。（切割 液按體積百分?jǐn)?shù)配制，可以為TFA 94%、水2.5%、EDT 2.5%、TIS 1%或者TFA 95%、水2%、EDT 2%、TIS 1%)〇
[0024] 11)吹干洗滌：將裂解液用氮?dú)獗M量吹干，用乙醚層析出來，再用乙醚洗六次，然 后常溫?fù)]干。即得粗品肽序。
[0025] 12)用HPLC純化多肽： (1)取粗品肽序200mg放入器皿中，用2-5ml濃度為50%的乙腈水溶液溶清，可以稍微 超聲2min〇
[0026] (2)用0·45μπι濾膜過濾溶解液。
[0027] (3)分析:取3μ1用分析級HPLC分析粗品。流動相是水和乙腈，時間30min，梯度洗 脫，先將HPLC用起始梯度平衡5min然后進(jìn)樣，起始梯度水95%，乙腈5%，結(jié)束比例水5%，乙腈 95% ； (4)制備:將溶解好的樣品，做進(jìn)樣準(zhǔn)備。制備HPLC平衡1 Omin，起始梯度水95%，乙腈5%， 結(jié)束梯度水25%，乙腈75%梯度時間40min。收集從檢測器出來的樣品。
[0028] (5)鑒定:將收集下來的樣品，取樣進(jìn)行純度和MS的鑒定。
[0029] 13)將純化后的溶液凍干，得到成品。
[0030] 14)將白色粉末狀的多肽，密封包裝，-20度保存。
[0031] 抗菌肽SE37最小抑菌濃度(MIC)的測定： 分別將大腸桿菌(ATCC8739)，銅綠假單胞菌(CMCC10104)，金黃色葡萄球菌(ATCC6538) 培養(yǎng)對數(shù)期，用2 X液體MHB培養(yǎng)基稀釋至2 X 105 CFU/ml。在96孔板中依次加入稀釋成梯度 的抗菌肽母液50μ1，向各孔中加入已稀釋好的菌液50μ1，混勻后于37°C靜置培養(yǎng)16小時，震 蕩后測定600nm處的光吸收值，以lOOμg/ml氨芐青霉素做陽性對照。結(jié)果判定:取檢測不到 細(xì)菌生長的孔作為最小抑菌濃度，結(jié)果如表1所示。
[0032]表1抗菌肽SE37的抑菌效果
從表1可以看出，SE3 7對革蘭氏陰性和陽性菌都有較好的抑菌效果，其中對金黃色葡萄 球菌的抑制效果最好，具有較好的研究開發(fā)價(jià)值。
[0033]本發(fā)明產(chǎn)品抗菌肽SE37的溶血活性檢測： 1)采集新鮮的大鼠血液，待靜置分層，去除上層血清，加入生理鹽水，用吸管輕輕吹散 管底的紅細(xì)胞，1000 rpm離心5 min，用吸管小心吸取上層生理鹽水并棄去，直至上清液沒 有紅色。
[0034] 2)取底部壓實(shí)的紅細(xì)胞2滴，加入2.0ml的等滲roS重懸紅細(xì)胞，配置成4%血紅細(xì) 胞懸液。
[0035] 3)實(shí)驗(yàn)組:加入50μ1不同濃度的，用等滲PBS溶解的抗菌肽，然后加入50μ1配置好 的4%血紅細(xì)胞懸液。
[0036] 4)陽性對照:每一個孔加入50μ1純水，50μ1配置好的4%血紅細(xì)胞懸液。陰性對照： 每一個孔加入50μ1等滲PBS，50μ1配置好的4%血紅細(xì)胞懸液。
[0037] 5) 37°C孵育1 h后，1 000 g離心96孔板5 min后，從各孔吸取50μ1上清到96孔板 中，415 nm波長測定0D值，計(jì)算溶血百分比=[(實(shí)驗(yàn)孔0D值-陰性孔0D值)/(陽性孔0D值-陰 性孔0D值)]X100。
[0038] 結(jié)果表明，在400μΜ的濃度下，抗菌肽SE37對紅細(xì)胞的溶血率與陰性對照相當(dāng)，說 明本發(fā)明抗菌肽SE37對紅細(xì)胞的參透脆性可以忽列不計(jì)。
[0039] 本發(fā)明產(chǎn)品抗菌肽SE37對臨床分離耐藥菌株的抑菌活性測定： 采用前面MIC值測定方法，分別測定抗菌肽SE37對四個不同病人分離到的耐甲氧西林 金黃色葡萄球菌菌株的抑菌活性，結(jié)果見表2。
[0040] 表2抗菌肽SE37的對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抑菌效果
從表2可以看出，抗菌肽SE37對不同病人來源的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株都有 一定的抑菌效果，具有良好的抗生素替代品藥物研究開發(fā)價(jià)值。
[0041] 綜上所述，本發(fā)明抗菌肽產(chǎn)品不產(chǎn)生溶血性，抗菌譜廣，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏 陰性菌都具有較高小的抗菌作用。所以，本發(fā)明產(chǎn)品抗菌肽SE37在制備抗感染革蘭氏陽性 菌或/和革蘭氏陰性菌疾病藥物中能夠得到較佳的應(yīng)用。
[0042] 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí) 施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實(shí)施 例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等都不會影響本發(fā)明實(shí)施的效果和專利的 實(shí)用性，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗菌肽SE37，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列為:361-6111-1'111-4找-?1'〇-Val-Leu-Asn-Arg-Leu-Phe-Asp-Lys-Ile-Arg-Gln-Val-Ile-Arg-Lys-Phe-Glu-Lys-Gly-Ile-Lys-Glu-Lys-Ser-Lys-Arg-Phe-Phe-Asp-Gly-Leu-Leu〇2. 如權(quán)利要求1所述的抗菌肽SE37，其特征在于:所述抗菌肽為α螺旋直鏈多肽，含有37 個氨基酸殘基，分子量大小為4504.40Da，等電點(diǎn)是11.34。3. 如權(quán)利要求1或2所述的抗菌肽SE37，其特征在于:所述抗菌肽應(yīng)用于制備抗菌劑。4. 如權(quán)利要求1或2所述的抗菌肽SE37，其特征在于:所述抗菌肽應(yīng)用于制備治療革蘭 氏陽性菌或革蘭氏陰性菌感染的廣譜抗菌藥物。
【文檔編號】C07K14/00GK106008677SQ201610632145
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月4日
【發(fā)明人】楊愈豐, 馮嘉敏, 夏嬙, 李均, 劉振勇, 張曉青, 向紅英, 柳敦耀, 彭莉萍, 呂延成
【申請人】遵義醫(yī)學(xué)院