信號肽酶抑制劑F25P preproinsulin及其在制備治療腫瘤藥物中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種信號肽酶抑制劑F25P preproinsulin及其在制備治療腫瘤藥物中的應用，屬于含肽的醫(yī)藥配置品領域。所述的信號肽酶抑制劑F25P preproinsulin是胰島素原前體的突變體，突變位點為胰島素原前體核苷酸序列的第73、74位堿基；所述F25P preproinsulin的核苷酸序列如序列表Sequence 1所示。本發(fā)明所述的信號肽酶抑制劑F25P preproinsulin 能較好地并特異性的抑制腫瘤細胞的信號肽酶活性，有效的抑制外分泌蛋白的合成，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和進展，起到了抗腫瘤的作用。本發(fā)明提供了一種全新的治療腫瘤的藥物，具有極大的臨床意義。
【專利說明】
信號肽酶抑制劑F25P prepro i nsu I i η及其在制備治療腫瘤藥 物中的應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于含肽的醫(yī)藥配置品領域，具體是一種信號肽酶抑制劑F25P preproinsulin及其在制備治療腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 細胞的外分泌現(xiàn)象在免疫監(jiān)視、炎癥反應及癌癥發(fā)生發(fā)展等生理和病理過程中起 著重要的作用，尤其在腫瘤細胞之間的交流，周圍腫瘤細胞的生長支持，腫瘤細胞外基質(zhì)的 改變，靶細胞中的基因重編碼以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移等方面尤為重要。目前研究 發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞的外分泌功能在不同的腫瘤中以及在同一腫瘤的不同區(qū)域中存在著特異性 的差異。因此，腫瘤細胞外分泌功能的探索在腫瘤的發(fā)病機制、早期診斷以及尋找新的治療 策略的研究中意義重大。
[0003] 腫瘤細胞外分泌功能異常是腫瘤的重要特征之一，與許多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，侵 襲轉(zhuǎn)移密切相關。以膠質(zhì)瘤為例，Xandra 0. Breakefield等人通過實驗驗證了膠質(zhì)瘤中 EGFRvIII陽性表達的腫瘤細胞能通過外分泌的方式向細胞外分泌帶有蛋白質(zhì)的微小囊泡， 從而來促進腫瘤的轉(zhuǎn)移及進展，并且證明了該外分泌的蛋白質(zhì)可以作為診斷腫瘤的特異性 指標。腫瘤細胞中外分泌蛋白是在細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成，前蛋白原通過信號肽的引導到達 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜上，然后通過信號肽酶的剪切作用，前蛋白原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上組裝、成熟，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 上釋放到細胞質(zhì)內(nèi)，從而分泌到細胞外發(fā)揮作用。因此，如果能有效調(diào)控腫瘤細胞外分泌過 程中的信號肽酶，則極其有助于推動腫瘤的治療發(fā)展。目前，還沒有確切有效的藥物能抑制 腫瘤細胞的外分泌作用，并且從外分泌蛋白合成角度研究腫瘤的治療也尚未報道。因此，發(fā) 現(xiàn)新的靶點以及藥物來調(diào)控腫瘤細胞的外分泌過程，成為極為迫切的研究領域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有治療腫瘤的藥物中不存在針對腫瘤細胞外分泌蛋白信 號肽酶的抑制劑的問題，所提出的一種信號肽酶抑制劑F25P preproinsulin及其在制備治 療腫瘤藥物中的應用。
[0005] 本發(fā)明是按照以下技術方案實現(xiàn)的。
[0006] 一種信號肽酶抑制劑F25P prepro insul in，所述信號肽酶抑制劑F25P preproinsulin是胰島素原前體的突變體，突變位點為胰島素原前體核苷酸序列的第73、74 位堿基;所述F25P preproinsulin的核苷酸序列如序列表Sequence 1所示。
[0007] 所述F25P preproinsulin的核苷酸序列是將胰島素原前體核苷酸序列第73、74位 的胸腺嘧啶突變成胞嘧啶。
[0008] 一種上述信號肽酶抑制劑F25P preproinsulin在制備治療腫瘤藥物中的用途。 [0009] 所述信號肽酶抑制劑F25P preproinsulin抑制腫瘤細胞信號肽酶活性，抑制外分 泌蛋白的合成。
[0010] 本發(fā)明獲得了如下有益效果。
[0011] 本發(fā)明有效的解決了現(xiàn)有治療腫瘤的藥物中不存在針對腫瘤細胞外分泌蛋白信 號肽酶的抑制劑的問題。本發(fā)明的信號肽酶抑制劑F25P preproinsulin能較好地并特異性 的抑制腫瘤細胞的信號肽酶活性，有效的抑制外分泌蛋白的合成，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和進展， 起到了抗腫瘤的作用。本發(fā)明提供了一種全新的治療腫瘤的藥物，具有極大的臨床意義。
【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明F25P preproinsulin(突變型胰島素)與野生型胰島素核苷酸序列對 比圖； 圖2是本發(fā)明D0X誘導試劑濃度對載有野生型核苷酸序列的重組慢病毒表達量影響圖； 圖3是本發(fā)明D0X誘導試劑濃度對載有突變型核苷酸序列的重組慢病毒表達量影響圖； 圖4是本發(fā)明載有野生型和突變型核苷酸序列的重組慢病毒對D0X誘導試劑的時間依 賴性對比圖； 圖5是本發(fā)明體外實驗中用ELI SA方法檢測細胞上清中EGF細胞因子濃度圖； 圖6是本發(fā)明體外實驗中用ELI SA方法檢測細胞上清中VEGF細胞因子濃度圖； 圖7是本發(fā)明體外實驗中用ELISA方法檢測細胞上清中MMP-9細胞因子濃度圖； 圖8是本發(fā)明體內(nèi)實驗中用ELI SA方法檢測小鼠血清中EGF細胞因子濃度圖； 圖9是本發(fā)明體內(nèi)實驗中用ELI SA方法檢測小鼠血清中VEGF細胞因子濃度圖； 圖10是本發(fā)明體內(nèi)實驗中用ELI SA方法檢測小鼠血清中MMP-9細胞因子濃度圖； 圖11是本發(fā)明體內(nèi)實驗中不同組別小鼠顱內(nèi)腫瘤大小及轉(zhuǎn)移灶形成圖。
【具體實施方式】
[0013] 下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明進行進一步的說明。
[0014] 1.核苷酸序列 1.1 F25P preproinsulin(突變型胰島素)核苷酸序列 TCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCACCGGCGCCACCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGC TGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCCCTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCT CTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGG GCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTG GCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGAATTCATGGACTAC AAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATGAACGCGTGG CCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCG CAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCC AGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACA GGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAA GGACGCGCCGGGTGTGGC 1.2野生型胰島素核苷酸序列(Gene ID:3630) CGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCACCGGCGCCACCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCT GCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTC TCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGG CAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGG CATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGAATTCATGGACTACA AGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATGAACGCGTGGC CTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGAC F25P preproinsulin(突變型胰島素)與野生型胰島素核苷酸序列對比圖如圖1所示。
[0015] 2.載有野生型和突變型核苷酸序列的重組慢病毒的構(gòu)建與表達 2.1重組慢病毒的構(gòu)建 A:慢病毒載體的制備:載體編號:GV208(購自上海吉凱基因化學技術有限公司）;元件 順序:Ubi-MCS-EGFP;焚光標記:EGFP;克隆位點:Agel;真核抗性:嘌呤霉素。
[0016] 載體酶切反應溫度:37°C;酶切反應時間：2 h，酶切反應體系:ddH20 42 uL，10X buffer 15 yL，純化的 DNA 質(zhì)粒（1 ug/yL) 2 yL，Age I (5 U/yL) lyL，Total 50yL〇
[0017] B:目的基因片段的獲取：引物（F:TCTACCTAGTGTGCGGGGAAR: AGAGGGAGCAGATGCTGGTA) PCR 擴增目的基因片段：PCR 反應體系：ddH20 12.4yL，5XTaq buffer 4yL，dNTPs (2.5mM) 1.6yL，Primer F(10y M) 0.4yL，Primer R(10y M) 0.4yL，Template(根據(jù) Sequencel、2由上海吉凱基因化學有限公司合成）（10ng/yL) lyL，Taq polymerase 0.2yL。 PCR 反應條件：94°C 5 min，94°C 30 sec，55°C 30 sec，72°C 2 min，72°C 10 min〇
[0018] C:質(zhì)粒構(gòu)建： PCR產(chǎn)物交換入線性化表達載體：反應條件:25°C 30分鐘-42°C 15分鐘。反應體 系：ddH2〇 8yL; 10 X In-Fusion交換酶緩沖液2yL; In-Fusion交換酶0.5yL;線性化載體 DNA 2yL;純化后PCR產(chǎn)物片段5yL。
[0019] 轉(zhuǎn)化：1)用冷卻的無菌吸頭從感受態(tài)細胞(五DH5a購自購自上海吉凱基因 化學技術有限公司）懸液中各取200 uL轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，每管加10 uL上述 連接液，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘。2)將管放到預加溫到42°C的循環(huán) 水浴中放好的EP管架上，恰恰放置90秒，不要搖動EP管架。3)快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴 中，使細胞冷卻1 一2分鐘。4)每管加800 uL LB培養(yǎng)基。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37°C， 然后將管轉(zhuǎn)移到37°C搖床上，溫育45分鐘使細菌復蘇。5)將150 uL已轉(zhuǎn)化的感受態(tài) 細胞轉(zhuǎn)移到AMP抗性（100ug/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)基上。6)將平板置于室溫直至液體被吸 收。7)倒置平皿，于37°C培養(yǎng)，16小時。8)長出的克隆進行后續(xù)PCR鑒定(PCR產(chǎn)物的測 序由上海吉凱基因化學技術有限公司進行）。
[0020] D:慢病毒包裝:細胞株:293T，慢病毒的包裝細胞，為貼壁依賴型成上皮樣細胞，生 長培養(yǎng)基為DMEM(含10%FBS)，貼壁細胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細胞。菌株:大腸桿菌菌 株DH5a，用于擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。病毒載體:GV208載體，pHelper 1.0 載體，pHelper 2.0載體（購自上海吉凱基因化學技術有限公司）ANA溶液的制備：以 Qiagen公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取慢病毒包裝系統(tǒng)中三種質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA溶于除菌 的TE中，以紫外光吸收法測定其濃度及純度，保證所提質(zhì)粒DNA的A260/A280在1.8~ 2.0之間。
[0021] Lentivirus病毒包裝：1)轉(zhuǎn)染前24 h，用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細 胞(購自上海吉凱基因化學技術有限公司），以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1.2X 1〇7細胞/20 ml，重新接種于15 cm細胞培養(yǎng)皿，37 °C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h 待細胞密度達70%~80%時即可用于轉(zhuǎn)染。
[0022] 2)轉(zhuǎn)染前2 h將細胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。
[0023] 3)向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(重組病毒質(zhì)粒20 yg，pHelper 1.0載體15yg，pHelper 2.0載體10 yg)，與相應體積的Opti-MEM(購自上海吉凱基因 化學技術有限公司）混合均勻，調(diào)整總體積為2.5 ml，在室溫下溫育5分鐘。
[0024] 4)將Lipofectamine 2000試劑(購自上海吉凱基因化學技術有限公司）輕柔搖 勻，取100以11^口(^6(^3111丨116 2000試劑在另一管中與2.4 1111(^衍-]\^]\1混合，在室溫下 溫育5分鐘。
[0025] 5)把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine 2000進行混合，輕輕地顛倒混 勻，不要振蕩。必須在5分鐘之內(nèi)混合。
[0026] 6)混合后，在室溫下溫育20分鐘，以便形成DNA與Lipofectamine 2000稀釋 液的轉(zhuǎn)染復合物。
[0027] 7)將DNA與Lipofectamine 2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細胞的培養(yǎng)液中，混勻， 于37 °C，5% C02細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0028] 8)培養(yǎng)8 h后倒去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細胞加入20 ml的PBS液， 輕輕左右晃動一下培養(yǎng)瓶以洗滌殘余的轉(zhuǎn)染混和物，然后倒去。
[0029] 9)每瓶細胞中加入含10%血清的細胞培養(yǎng)基25 ml，于37 °C，5% C02培養(yǎng)箱內(nèi) 繼續(xù)培養(yǎng)48小時。
[0030] E:病毒的收獲及濃縮：1)收集轉(zhuǎn)染后48小時(轉(zhuǎn)染即可為0小時計起）的293T 細胞上清液。
[0031] 2)于4 Γ，4000 g離心10 min，除去細胞碎片。
[0032] 3)以0·45μπι濾器過濾上清液于40 ml超速離心管中。
[0033] 4)把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中（最多19 ml)，蓋上蓋子。將過濾杯插到濾 過液收集管中。
[0034] 5)組合好后，做好平衡，放在轉(zhuǎn)頭上。
[0035] 6)在4000Xg離心，至需要的病毒濃縮體積。通常需要的時間為10-15分鐘。
[0036] 7)離心結(jié)束后，取出離心裝置，將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開。
[0037] 8)將過濾杯倒扣在樣品收集杯上。
[0038] 9)離心力不超過1000g，時間為2分鐘。把過濾杯從樣品收集杯上移開。樣品收 集杯中的即為病毒濃縮液。
[0039] 10)將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，_80°C長期保存。取其中一支進行 病毒生物學滴度測定。
[0040] 2.2重組慢病毒的表達 在實驗細胞(U87和U87EGFRvIII)中加入含有野生型和突變型核苷酸序列的重組病毒， 然后設置不同濃度(〇 .2、0.4、0.6、0.8、1.0ug/ml)的D0X試劑誘導病毒的表達，48h后倒出培 養(yǎng)液，用PBS洗兩次，加入lml Trizol，室溫裂解2分鐘，用移液器吹下細胞并置于EP管中，顛 倒10次，室溫靜置5分鐘。加入200微升的氯仿，室溫靜置5分鐘，4°C，12000rpm，離心20min。 轉(zhuǎn)上層水相于另一個EP管中，加等體積的異丙醇，顛倒混勻10次，溫靜置5分鐘，4°C， 12000rpm，離心20min。小心吸棄上清，加預冷的75%乙醇，4°C，12000rpm，離心10min。棄上 清，EP管倒扣，空氣干燥5min，溶于20微升的DEPC處理水中，完成RNA提取。
[0041 ] 反轉(zhuǎn)錄：1微升01 igo dT加5微克RNA，用DEPC處理水補齊到12微升，混勻后70°C保 溫5min，立即放在冰上冰浴5分鐘，然后加入4微升5 X反應緩沖液，1微升RNase抑制劑和2微 升1 Ommo 1 /L NTP，混勻后37 °C保溫5分鐘，加入1微升逆轉(zhuǎn)錄酶，42 °C反轉(zhuǎn)錄60分鐘，70 °C終 止酶活性lOmin，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物20微升置于-20°C保存。
[0042] Real-time PCR:按照定量PCR試劑盒（購自上海生工生物工程股份有限公司，型 號：SK2491-50次)進行，該試劑盒內(nèi)有熒光染料SYBR和共同參與的定量PCR反應體系，對上 述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行定量檢測。每個實驗組設置三個副孔，重復3次。25μ1實時定量PCR反應體 系的制備如表1:
Real-time PCR過程使用MJ-real time PCR儀(BioRad公司，美國）完成，使用GAPDH作 為內(nèi)參。Opticon 2軟件計算AC(t)值(2-Δ ACT的計算方法)表示。處理實驗結(jié)果，檢測不 同組胰島素的相對表達量。
[0043]實驗結(jié)果表明：不同組病毒中胰島素的表達量隨著D0X濃度的增加表達量增加，但 是當濃度超過1.0后細胞的形態(tài)會發(fā)生改變，所以D0X的最適誘導濃度為1.0ug/ml(圖2、3)。 [0044] 按照上述相同的方法加入病毒培養(yǎng)細胞，D0X誘導濃度為1.0ug/ml，設置48h、72h 兩個不同的誘導表達時間點，用Real-time PCR的方法檢測相同誘導濃度下不同時間點胰 島素的表達量變化，實驗具體步驟同上。
[0045]實驗結(jié)果表明：在相同濃度的D0X試劑誘導表達下，誘導48小時的胰島素表達量大 于72小時的表達量，在體外實驗選擇的誘導時間為48h(圖4,其中**P〈0.01)。
[0046] 3.體外實驗 以膠質(zhì)瘤中U87EGFRvII I細胞為例，實驗分為四組，空白對照組，病毒空載對照組，野生 型組，突變型組，實驗前培養(yǎng)皿中更換為無血清培養(yǎng)基，按照病毒的滴度以及培養(yǎng)皿中細胞 的密度加入相應的病毒量(病毒空載對照組，野生型組，突變型組，各加入相應的病毒15μ 1)，并且按照D0X誘導試劑的最適誘導濃度（l.Oμg/ml)加入誘導試劑來誘導病毒基因的表 達，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后收集相應的上清液，用ELISA的方法檢測上清液中細胞因子 (EGF、VEGF、MMP-9 )的濃度，實驗方法如下： 1.包被過程(設置空白對照，陰性對照）：將所用抗原(EGF、VEGF、MMP9)用包被稀釋液稀 釋到適當濃度，置于37°C保溫4h或4°C存放24h，棄去孔中液體（為避免蒸發(fā)，板上應加蓋或 將板平放在底部有濕紗布的金屬濕盒中）。
[0047] 2 .封閉酶標反應孔:5%小牛血清置37 °C封閉40min。封閉時將封閉液加滿各反應 孔，并去除各孔中的氣泡，封閉結(jié)束后用洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3min。洗滌方法:吸干孔 內(nèi)反應液，將洗滌液注滿板孔，放置2min略作搖動，吸干孔內(nèi)液，傾去液體后在吸水紙上拍 干，洗滌次數(shù)為3次。
[0048] 3.加入待檢測樣品：檢測時一般采用1: 50-1:400的稀釋度，應采用較大稀釋體積 進行，將稀釋好的樣品加入酶標反應孔中，每樣品至少加雙孔，每孔l〇〇yL，置于37°C反應 40_60min。用洗滌液滿孔洗滌3遍，每遍3min。
[0049] 4.加入酶標抗體(EGF、VEGF、MMP9):每孔加100μL，置于37°C反應30-60min，短于 30min往往結(jié)果不穩(wěn)定，洗滌步驟同步驟3。
[0050] 5.加入底物液(現(xiàn)用現(xiàn)配）：首選TMB-過氧化氫尿素溶液，oro-過氧化氫底物液系 統(tǒng)次之。底物加入量:每孔100yL，置37 °C避光放置3-5分鐘，加入終止液顯色。
[0051 ] 6.終止反應:每孔加入終止液50yL終止反應，于20min內(nèi)測定實驗結(jié)果。
[0052] 7.結(jié)果判斷：顯色后采用450nm波長。檢測時一定要首先進行空白孔系統(tǒng)調(diào)零。用 測定標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均值的比值(P/N)表示，當P/N大于2時作為 抗體的效價。
[0053] 實驗結(jié)果表明（圖5-7):空白對照組，空載對照組以及野生型胰島素組上清中的 EGF、VEGF、MMP-9濃度變化較小，而在加入突變型病毒的細胞上清中三種細胞因子濃度顯著 降低。
[0054] 4動物實驗 4.1小鼠顱內(nèi)原位模型的建立 (1) 實驗分為四組:野生型組(D0X誘導），野生型組(無 D0X誘導），突變型組(D0X誘導）， 突變型組(無 D0X誘導），按照體外實驗中所述的方法轉(zhuǎn)染U87EGFRvIII細胞，取轉(zhuǎn)染過相應 重組慢病毒的U87EGFRvIII膠質(zhì)母細胞瘤細胞經(jīng)0.125%胰酶消化，lOOOrpm常溫離心 10min，去上清，以PBS離心洗滌2次； (2) 計算細胞數(shù):調(diào)整細胞濃度至2X108/ml，將細胞懸浮于無血清DMEM培養(yǎng)液中， 制成細胞懸液； (3) 將待試驗小鼠稱重，用5%的水合氯醛腹腔注射麻醉(劑量:0.001ml/g); (4) 常規(guī)碘酊、消毒頭部皮膚，沿頭部正中線偏右3mm并與兩耳連線垂直切開頭部皮 膚，暴露顱骨，取對側(cè)眼、耳連線交點偏右2mm處，細針鉆透顱骨，將小鼠用立體定向儀(北 京吉安得爾科技有限公司、ALC-H)三角架固定； (5) 量程為5μ1的微樣進樣器吸取3μ1細胞懸液(約含5X105細胞)后置于立體定 向儀上，沿鉆孔處進針3mm，后退1mm，啟動立體定向儀緩慢注入細胞懸液； (6) 注射完畢后，將皮膚切口縫合，并消毒創(chuàng)面，小鼠放回籠中。
[0055] 4.2 ELISA方法檢測小鼠血清中細胞因子(EGF、VEGF、MMP-9)的濃度 顱內(nèi)原位模型建立后18天，每組取6只小鼠從內(nèi)眥靜脈取血，離心后取上清液，然后用 ELISA的方法檢測小鼠血中相應細胞因子的濃度，同時解剖相應組小鼠的腦組織，用HE染色 的方法觀察不同組別小鼠腦組織中腫瘤的大小及腫瘤轉(zhuǎn)移情況。
[0056]結(jié)果顯示表明：在四個組別中，加入野生型病毒的組內(nèi)，以及加入突變型病毒無 D0X誘導的組內(nèi)小鼠血液上清中EGF，VEGF，麗P-9基本沒有變化（圖8-10)，而在加入突變型 病毒組內(nèi)（D0X誘導）小鼠血液上清中三個細胞因子降低明顯，EGF的降低減弱了對周圍細胞 的生長刺激作用，VEGF的降低減弱了腫瘤內(nèi)部血管的生成，MMP-9的表達降低則減弱了細胞 外基質(zhì)對腫瘤生長的支持作用，同時也減弱并且抑制了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移效應。觀察小鼠顱 內(nèi)腫瘤發(fā)現(xiàn)（圖11 )，加入突變型病毒且D0X誘導的組內(nèi)小鼠顱內(nèi)的腫瘤大小明顯小于其他 組，無轉(zhuǎn)移灶的形成。EGF的表達降低能明顯減弱小鼠顱內(nèi)腫瘤的大小，VEGF表達的降低使 該組小鼠顱內(nèi)腫瘤中的血管生成明顯減少，同時血清中MMP-9的減少減弱了腫瘤細胞外基 質(zhì)的降解，不利于腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，使加入突變型病毒且D0X誘導的組內(nèi)沒有出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn) 移灶。綜上所述，加入突變型病毒且D0X誘導能通過減弱小鼠血液上清中EGF，VEGF，MMP-9的 表達來抑制顱內(nèi)腫瘤的生長，同時抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。 SEQUENCE LISTING 〈11〇>天津醫(yī)科大學總醫(yī)院 〈120>信號肽酶抑制劑F25P preproinsulin及其在制備治療腫瘤藥物中的應用 <130> 1 <160> 1 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 784 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 〈220〉 〈221> F25P preproinsulin 〈222〉 （1)..(784) 〈400〉 1 tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcaccggc gccaccatgg ccctgtggat gcgcctcctg 60 cccctgctgg cgctgctggc cctctgggga cctgacccag ccgcagcccc tgtgaaccaa 120 cacctgtgcg gctcacacct ggtggaagct ctctacctag tgtgcgggga acgaggcttc 180 ttctacacac ccaagacccg ccgggaggca gaggacctgc aggtggggca ggtggagctg 240 ggcgggggcc ctggtgcagg cagcctgcag cccttggccc tggaggggtc cctgcagaag 300 cgtggcattg tggaacaatg ctgtaccagc atctgctccc tctaccagct ggagaactac 360 tgcaacgaat tcatggacta caaggatgac gatgacaagg attacaaaga cgacgatgat 420 aaggactata aggatgatga cgacaaatga acgcgtggcc tccgcgccgg gttttggcgc 480 ctcccgcggg cgcccccctc ctcacggcga gcgctgccac gtcagacgaa gggcgcagcg 540 agcgtcctga tccttccgcc cggacgctca ggacagcggc ccgctgctca taagactcgg 600 ccttagaacc ccagtatcag cagaaggaca ttttaggacg ggacttgggt gactctaggg 660 cactggtttt ctttccagag agcggaacag gcgaggaaaa gtagtccctt ctcggcgatt 720 ctgcggaggg atctccgtgg ggcggtgaac gccgatgatt atataaggac gcgccgggtg 780 tggc 784 <130> 2 <160> 1 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 526 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 〈220〉 〈221>野生型胰島素 〈222〉 (1)..(526) <400> 1 cgtttagtga accgtcagat cgcaccggcg ccaccatggc cctgtggatg cgcctcctgc 60 ccctgctggc gctgctggcc ctctggggac ctgacccagc cgcagccttt gtgaaccaac 120 acctgtgcgg ctcacacctg gtggaagctc tctacctagt gtgcggggaa cgaggcttct 180 tctacacacc caagacccgc cgggaggcag aggacctgca ggtggggcag gtggagctgg 240 gcgggggccc tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct ggaggggtcc ctgcagaagc 300 gtggcattgt ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct ctaccagctg gagaactact 360 gcaacgaatt catggactac aaggatgacg atgacaagga ttacaaagac gacgatgata 420 aggactataa ggatgatgac gacaaatgaa cgcgtggcct ccgcgccggg ttttggcgcc 480 tcccgcgggc gcccccctcc tcacggcgag cgctgccacg tcagac 526
【主權(quán)項】
1. 一種信號肽酶抑制劑F25P preproinsulin，其特征在于:所述信號肽酶抑制劑F25P preproinsulin是胰島素原前體的突變體，突變位點為胰島素原前體核苷酸序列的第73、74 位堿基;所述F25P preproinsulin的核苷酸序列如序列表Sequence 1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種信號肽酶抑制劑F25P preproinsul in，其特征在于:所述 F25P preproinsulin的核苷酸序列是將胰島素原前體核苷酸序列第73、74位的胸腺嘧啶突 變成胞嘧啶。3. -種權(quán)利要求1所述的信號肽酶抑制劑F25P preproinsul in在制備治療腫瘤藥物中 的用途。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的信號肽酶抑制劑F25P preproinsul in在制備治療腫瘤藥物中 的用途，其特征在于:所述信號肽酶抑制劑F25P preproinsul in抑制腫瘤細胞信號肽酶活 性，抑制外分泌蛋白的合成。
【文檔編號】C07K14/62GK106008694SQ201610291581
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】康春生, 魏建偉, 劉銘, 崔景秋, 陳鷺躍, 楊超
【申請人】天津醫(yī)科大學總醫(yī)院