一種黃蜀葵莖葉多糖及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黃蜀葵莖葉多糖及其制備方法與應(yīng)用。該制備方法包括：提取、乙醇沉淀、大孔吸附樹脂柱色譜純化、中空纖維素膜分離、DEAE纖維素樹脂柱色譜分離，收集目標(biāo)餾分，經(jīng)脫鹽處理，冷凍干燥，得黃蜀葵莖葉多糖。該黃蜀葵莖葉多糖重均分子量為13821Da，由鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖及阿拉伯糖組成，其摩爾比為阿拉伯糖:半乳糖:葡萄糖:半乳糖醛酸:鼠李糖:甘露糖＝1:0.53:0.12:0.05:0.16:0.03，具有良好的免疫增強活性，可作為免疫增強藥物及保健食品開發(fā)。本發(fā)明以黃蜀葵花藥材生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的莖葉廢棄資源為原料，分離制備具有免疫活性的多糖類物質(zhì)，為實現(xiàn)中藥資源的循環(huán)利用奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種黃蜀葵莖葉多糖及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及到一種中藥提取物，具體涉及到一種具有免疫活性的黃蜀葵莖葉多糖 的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃蜀葵（Abelmoschus manihot (L · )Medic ·)為錦葵科（Mai vaceae)秋葵屬 (Abelmoschus) -年至多年生草本植物，始載于宋代掌禹錫所著《嘉佑本草》，其后歷代本草 均有記載，并收載于歷版《中華人民共和國藥典》。歷代本草多用其花入藥，其次為種子，根、 莖和葉少用。黃蜀葵花目前為治療腎病常用中藥的主要原料之一，市場需求量巨大，但采收 花朵后的莖葉資源因缺少有效利用途徑而大量廢棄，造成資源浪費。因此，開展黃蜀葵莖葉 的資源化利用研究與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，實現(xiàn)變廢為寶，不僅可促進黃蜀葵資源產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展， 也符合國家倡導(dǎo)的綠色發(fā)展要求。
[0003] 研究顯示，黃蜀葵莖葉中含有豐富的多糖類物質(zhì)，已有專利報道以其為主要原料 可制備植物膠。也有研究表明，天然多糖類物質(zhì)具有較好的免疫活性，因此非常有必要在現(xiàn) 有研究基礎(chǔ)上，系統(tǒng)開展黃蜀葵莖葉多糖純化制備方法及應(yīng)用開發(fā)研究，篩選其可用于免 疫增增強藥物或保健食品開發(fā)的活性組分或分子，以拓展黃蜀葵莖葉資源的利用途徑，促 進黃蜀葵藥用生物資源的循環(huán)利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：本發(fā)明的目的在于提供一種具有免疫增強活性的黃蜀葵莖葉多糖，實 現(xiàn)黃蜀葵莖葉的資源化利用與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，變廢為寶;本發(fā)明的另一目的在于提供以上黃 蜀葵莖葉多糖的制備方法及其應(yīng)用。
[0005] 技術(shù)方案:為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0006] -種黃蜀葵莖葉多糖，是從黃蜀葵莖葉中分離得到，其重均分子量為13821道爾頓 (Da)，該多糖由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、鼠李糖和甘露糖組成，其摩爾比為 阿拉伯糖:半乳糖:葡萄糖:半乳糖醛酸：鼠李糖:甘露糖=1:〇. 53:0.12:0.05:0.16:0.03。
[0007] 本發(fā)明所述的一種黃蜀葵莖葉多糖的制備方法，依次包括提取、乙醇沉淀、大孔吸 附樹脂柱色譜純化、超濾、DEAE纖維素樹脂柱色譜分離純化，具體分離步驟包括：
[0008] (1)取黃蜀葵莖葉，經(jīng)粉碎后，按固液重量比為1:8~1:30加入水，80~100 °C條件 下加熱提取2~3次，每次1~3小時，過濾，得濾液。
[0009] (2)取步驟（1)所得濾液，濃縮到適當(dāng)體積，加入乙醇至含醇量50%~80%，靜置沉 淀24h后，固液分離，得醇沉沉淀。
[0010] (3)取步驟(2)所得醇沉沉淀，加水溶解后，經(jīng)大孔吸附樹脂柱色譜分離，以純水， 1 %~20 %乙醇水溶液洗脫，得洗脫液。
[0011] (4)取步驟(3)所得洗脫液，適當(dāng)濃縮后，經(jīng)超濾膜超濾，取分子量范圍為1萬~3萬 部分樣品，適當(dāng)濃縮后，得精制多糖樣品溶液。
[0012] (5)取步驟(4)所得精制多糖樣品溶液，經(jīng)DEAE纖維素柱色譜分離，分別以水、0.01 ~0 · 05 %NaCl溶液洗脫后，以0 · 1~0 · 5 %NaCl溶液洗脫，收集0 · 1~0 · 5 %NaCl洗脫溶液，經(jīng) 透析脫鹽后，濃縮，凍干，得黃蜀葵莖葉多糖。
[0013]本發(fā)明所述的黃蜀葵莖葉，是指采收黃蜀葵花后殘留的地上莖葉。
[0014]作為優(yōu)選方案，步驟(1)中所述的固液比為1:20,提取溫度為100°C，提取2次，提取 時間為2小時。
[0015]作為優(yōu)選方案，步驟(2)中所述加入乙醇至含醇量為80%，固液分離方法采用離心 分咼法。
[0016] 作為優(yōu)選方案，步驟(3)中所述大孔吸附樹脂柱色譜采用AB-8型或D101型樹脂，收 集10%乙醇洗脫液。
[0017] 作為優(yōu)選方案，步驟(5)中所述DEAE纖維素為DEAE-52。
[0018] 作為優(yōu)選方案，步驟(5)中，取步驟(4)所得精制多糖樣品溶液，經(jīng)DEAE纖維素柱色 譜分離，分別以水、0.05%NaCl溶液洗脫后，以0.1 %NaCl溶液洗脫，收集0.1 %NaCl洗脫溶 液，經(jīng)透析脫鹽后，濃縮，凍干，得黃蜀葵莖葉多糖。
[0019] 本發(fā)明經(jīng)過大量實驗研究表明，本發(fā)明提供的黃蜀葵莖葉多糖可顯著促進小鼠脾 淋巴細胞增殖，且其高劑量組與陽性藥脂多糖(LPS)組無顯著性差異。表明本發(fā)明提供的黃 蜀葵莖葉多糖可對小鼠具有免疫增強活性，可應(yīng)用于制備具有免疫增強作用的藥品或保健 品。
[0020] 本發(fā)明以中藥材生產(chǎn)過程中采收黃蜀葵花后廢棄的莖葉資源為原料，開展其活性 多糖提取純化與產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，旨在變廢為寶，有效提高黃蜀葵藥用生物資源的利用效率，實 現(xiàn)中藥廢棄物的高附加值和高社會價值的綜合利用。
[0021] 本發(fā)明在黃蜀葵莖葉多糖的提取制備工藝中，采用正交試驗設(shè)計，以料液比、提取 時間、提取溫度、提取次數(shù)為考察因素，優(yōu)化其提取工藝參數(shù)，使得所建立的提取工藝可可 有效提高多糖的提取效率，降低雜質(zhì)溶出率，建立最優(yōu)的提取純化工藝。
[0022] 本發(fā)明提供的黃蜀葵莖葉多糖制備純化工藝中，采用活性跟蹤的方法，經(jīng)大孔吸 附樹脂柱色譜純化可有效去除中低極性雜質(zhì)，可有效防止超濾處理時的膜組件污染，提高 生產(chǎn)效率。通過超濾處理，可有效控制目標(biāo)黃蜀葵莖葉多糖的相對分子量范圍，便于活性多 糖的富集。通過DEAE纖維素樹脂柱色譜分離純化，可制得結(jié)構(gòu)組成相對固定、分子量均一的 多糖組分，為其活性評價及產(chǎn)品質(zhì)量控制提供有利條件。
[0023] 有益效果:本發(fā)明提供的以采收黃蜀葵花后廢棄的黃蜀葵莖葉資源為原料，通過 提取、乙醇沉淀、大孔吸附樹脂柱色譜耦合超濾、DEAE纖維素樹脂柱色譜分離純化等多種現(xiàn) 代工藝制備的黃蜀葵莖葉多糖，具有化學(xué)結(jié)構(gòu)組成相對固定、分子量均一等特點，且具有較 強的免疫增強活性，特別是淋巴B細胞增殖的活性，可用于制備具有免疫增強作用的藥品或 保健品。
[0024] 此外，本發(fā)明以目前嚴重制約黃蜀葵藥用生物資源產(chǎn)業(yè)發(fā)展、對環(huán)境潛在危害較 大的廢棄莖葉為利用對象，一方面原料成本低廉，生產(chǎn)成本優(yōu)勢明顯，另一方面也可有效消 耗黃蜀葵莖葉資源，降低環(huán)境承載壓力，實現(xiàn)資源循環(huán)利用，為黃蜀葵藥用生物資源的可持 續(xù)發(fā)展提供支撐，具有較高的社會經(jīng)濟效益。
【附圖說明】
[0025] 圖1是本發(fā)明提供的黃蜀葵莖葉多糖分子量測定色譜圖；
[0026] 圖2是本發(fā)明提供的黃蜀葵莖葉多糖分子量測定色譜圖；
[0027] 圖3是本發(fā)明提供的黃蜀葵莖葉多糖單糖組成測定色譜圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實施例進一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形 式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0029] 實施例1黃蜀葵莖葉多糖提取工藝優(yōu)選
[0030] (1)黃蜀葵莖葉多糖提取單因素的優(yōu)選
[0031] 取黃蜀葵莖葉樣品分為若干份，適當(dāng)粉碎后，稱重，加入原料重量比為（1:10、1: 15、1:20、1:30、1:40)的水，以（60°(：、70°(：、80°(：、90°(：、100°(：)的提取溫度，提取(0.511、111、 21 1、311、411)，提?。?次、2次、3次）。過濾，取上清液，以苯酚-硫酸法測定多糖提取率，優(yōu)選因 素指標(biāo)結(jié)果見表1。
[0032]表1單因素分析
[0033]
[0034]
[0035] (2)黃蜀葵莖葉多糖提取正交優(yōu)選試驗
[0036]以料液比、提取時間、提取溫度為考察因素，選取單因素優(yōu)選的因素水平，通過正 交試驗確定最優(yōu)提取方案，結(jié)果見表2。
[0037]表2多糖提取工藝正交試驗設(shè)計及結(jié)果
[0038]
[0039] 表3黃蜀葵莖葉多糖提取方差分析結(jié)果
[0040]
[0041] 極差結(jié)果表明，影響黃蜀葵莖葉多糖的提取工藝程度依次為:提取溫度〉提取時間 >料液比，提取溫度、提取時間(P〈〇.05)兩個因素對黃蜀葵莖葉多糖的提取工藝有明顯的影 響，料液比未見顯著差異，為了節(jié)約資源，經(jīng)綜合考慮，得出最佳的提取工藝為A 3B3C2,即料 液比1:20，提取溫度為100 °C，提取時間為2h，提取兩次。
[0042] 實施例2-種黃蜀葵莖葉多糖的分離純化工藝，它包括如下步驟：
[0043] (1)取黃蜀葵莖葉1.0kg，經(jīng)粉碎后，按實施例1優(yōu)化后的提取方法按加入水20kg， l〇〇°C條件下加熱回流提取2次，每次2小時，過濾，得濾液。
[0044] (2)取步驟（1)所得濾液，濃縮至1L，加入乙醇至含醇量80%，靜置沉淀24h后，離心 固液分離，得醇沉沉淀。
[0045] (3)取步驟（2)所得醇沉沉淀，加水溶解后，經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂柱色譜分離，以 10 %乙醇水溶液洗脫，得洗脫液。
[0046] (4)取步驟(3)所得洗脫液，適當(dāng)濃縮后，經(jīng)中空纖維素超濾膜超濾，取分子量范圍 為1萬~3萬部分樣品，適當(dāng)濃縮后，得精制多糖樣品溶液。
[0047] (5)取步驟(4)所得精制多糖樣品溶液，經(jīng)DEAE-52纖維素柱色譜分離，分別以水、 0.05 %NaCl溶液洗脫后，以0.1 %NaCl溶液洗脫，收集0.1 %NaCl洗脫溶液，經(jīng)透析脫鹽后， 濃縮，凍干，得黃蜀葵莖葉多糖8.7g。
[0048]實施例3-種黃蜀葵莖葉多糖的分離純化工藝，它包括如下步驟：
[0049] (1)取黃蜀葵莖葉2.0kg，經(jīng)粉碎后，按實施例1優(yōu)化后的提取方法按加入水40kg， 100°c條件下加熱回流提取3次，每次1小時，過濾，得濾液。
[0050] (2)取步驟（1)所得濾液，濃縮至1L，加入乙醇至含醇量70%，靜置沉淀24h后，過 濾，得醇沉沉淀。
[0051] (3)取步驟(2)所得醇沉沉淀，加水溶解后，經(jīng)D101大孔吸附樹脂柱色譜分離，以水 洗脫，得洗脫液。
[0052] (4)取步驟(3)所得洗脫液，適當(dāng)濃縮后，經(jīng)超濾膜超濾，取分子量范圍為1萬~3萬 部分樣品，適當(dāng)濃縮后，得精制多糖樣品溶液。
[0053] (5)取步驟(4)所得精制多糖樣品溶液，經(jīng)DEAE-52纖維素柱色譜分離，分別以水、 0.05 %NaCl溶液洗脫后，以0.1 %NaCl溶液洗脫，收集0.1 %NaCl洗脫溶液，經(jīng)透析脫鹽后， 濃縮，凍干，得黃蜀葵莖葉多糖13.6g。
[0054]實施例4黃蜀葵莖葉多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)研究 [0055] (1)重均分子量測定
[0056] 色譜條件:Tsk-gel G4000PWXL0色譜柱(7.8X300mm)，柱溫30°C，超純水作為流動 相，等度洗脫，體積流量〇. 5mL/min;進樣量20yL;ELSD漂移管溫度:60°C ;氣體壓力:40psi。
[0057] 供試品溶液:精密稱定實施例2制備得到的黃蜀葵莖葉多糖10mg樣品，溶于2ml超 純水中，充分溶解，離心，取上清，進樣。
[0058]測定結(jié)果:經(jīng)與葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對，采用GPC分子量分布軟件計算其數(shù)均 分子量、重均分子量及分布系數(shù)，結(jié)果見表4。由表4可知，其重均分子量為1382IDa，分布系 數(shù)為 1.9654。
[0059] 表4黃蜀葵莖葉多糖分子量測定結(jié)果
[0060]
[0061]
[0062] (2)單糖組成及比例測定
[0063]取實施例2所得黃蜀葵莖葉多糖，經(jīng)PMP衍生化后，采用HPLC法測定其單糖組成，如 圖1至3所示。結(jié)果表明黃蜀葵莖葉多糖是由鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖及 阿拉伯糖組成，其摩爾比為阿拉伯糖：半乳糖：葡萄糖：半乳糖醛酸：鼠李糖：甘露糖=1: 0.53:0.12:0.05:0.16:0.03〇
[0064]實施例5黃蜀葵莖葉多糖免疫活性試驗
[0065]實驗方法:按照小鼠脾淋巴細胞懸液的制備方法，取純化后的脾淋巴細胞懸液，調(diào) 整細胞濃度為1 X 1〇6個· ml/1，于96孔細胞培養(yǎng)板中對照孔和試驗孔中均加入100yL單細胞 懸液，置5%C02、37°C培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24h后，于空白對照孔、陽性對照孔和試驗孔中分別 加入RPMI 1640培養(yǎng)基、LPS(終濃度5yg · ml/1)和不同濃度的實施例2所得黃蜀葵莖葉多糖 (終濃度分別為40，120，370，lllOyg · mL-^OyL，每組設(shè)3個復(fù)孔。連續(xù)培養(yǎng)48h后，結(jié)束培養(yǎng) 前4h各孔加入10yL MTT(5mg/ml)試劑，再繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲 基亞砜(DMSO)lOOyL，振蕩溶解20min后，酶聯(lián)免疫檢測儀于570nm下測OD 57〇值(吸光度值）， 并計算免疫刺激指數(shù)SI。其中，SI =ODi5m/〇D*fM。
[0066] 統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以mean土SD表示，t檢驗采用 SPSS 19統(tǒng)計軟件完成。以P〈0.05表示差異顯著;P〈0.01表示差異極顯著。
[0067] 測定結(jié)果:研究結(jié)果顯示(表5)，濃度在40~120yg ?ml/1范圍內(nèi)，黃蜀葵莖葉多糖 可顯著促進小鼠脾淋巴細胞增殖(P<〇.05或P<0.01)，隨著濃度的增加，促進作用增強。且 黃蜀葵莖葉多糖濃度120yg · ml/1時，其增強作用接近于B淋巴細胞分裂原LPS(脂多糖），但 隨后濃度再增加，促進作用降低，表現(xiàn)為雙向劑量效應(yīng)關(guān)系。
[0068] 表5不同濃度多糖對小鼠脾臟細胞增殖的影響
[0069]
[0070] 注："*"表示與空白對照組比較差異顯著（P<0.05);"**"表示與空白對照組比較 差異極顯著(Ρ<〇.〇1)。
[0071] 以上實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的黃蜀葵莖葉多糖能夠顯著增強脾淋巴細胞增殖 活性，表現(xiàn)出較強的免疫增強活性，可用于制備具有免疫增強功能的藥品及保健食品。且與 現(xiàn)有藥物相比，該黃蜀葵莖葉多糖來源于天然傳統(tǒng)藥食兩用植物，更加安全，無不良反應(yīng)。
[0072] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種黃蜀葵莖葉多糖，其特征在于：是從黃蜀葵莖葉中分離得到，其重均分子量為 13821道爾頓，由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、鼠李糖和甘露糖組成，其摩爾比為 阿拉伯糖:半乳糖:葡萄糖:半乳糖醛酸：鼠李糖:甘露糖=1:〇. 53:0.12:0.05:0.16:0.03。2. 權(quán)利要求1所述的一種黃蜀葵莖葉多糖的制備方法，其特征在于，依次包括提取、乙 醇沉淀、大孔吸附樹脂柱色譜純化、中空纖維素膜分離、DEAE纖維素樹脂柱色譜分離純化， 具體步驟包括： (1) 取黃蜀葵莖葉，經(jīng)粉碎后，按固液重量比為1:8~1:30加入水，80~100°C條件下加 熱提取2~3次，每次1~3小時，過濾，得濾液； (2) 取步驟（1)所得濾液，濃縮，加入乙醇至乙醇體積濃度為50%~80%，靜置沉淀，固 液分離，得醇沉沉淀； (3) 取步驟(2)所得醇沉沉淀，加水溶解后，經(jīng)大孔吸附樹脂柱色譜分離，依次用純水、 1 %~20 %乙醇水溶液洗脫，得洗脫液； (4) 取步驟(3)所得洗脫液，濃縮后，經(jīng)超濾膜超濾，取分子量范圍為1萬~3萬部分樣 品，濃縮后，得精制多糖樣品溶液； (5) 取步驟(4)所得精制多糖樣品溶液，經(jīng)DEAE纖維素柱色譜分離，分別以水、0.01~ 0 · 05 % NaCl溶液洗脫后，以0 · 1~0 · 5 % NaCl溶液洗脫，收集0 · 1~0 · 5 % NaCl洗脫溶液，經(jīng)透 析脫鹽后，濃縮，凍干，得黃蜀葵莖葉多糖。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃蜀葵莖葉多糖的制備方法，其特征在于，黃蜀葵莖葉是采收 黃蜀葵花后殘留的地上莖葉。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃蜀葵莖葉多糖的制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述固 液比為1:20,提取溫度為100°C，提取次數(shù)2次，提取時間為2小時。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃蜀葵莖葉多糖的制備方法，其特征在于，步驟(2)中加入乙 醇至乙醇體積濃度為80%，固液分離方法采用離心分離法。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃蜀葵莖葉多糖的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述大 孔吸附樹脂柱色譜采用AB-8型或D101型樹脂，收集體積濃度為10%乙醇洗脫液。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃蜀葵莖葉多糖的制備方法，其特征在于，步驟（5)中所述 DEAE纖維素為DEAE-52。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃蜀葵莖葉多糖的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，取步驟 (4)所得精制多糖樣品溶液，經(jīng)DEAE纖維素柱色譜分離，分別以水、0.05%NaCl溶液洗脫后， 以0.1 % NaCl溶液洗脫，收集0.1 % NaCl洗脫溶液，經(jīng)透析脫鹽后，濃縮，凍干，得黃蜀葵莖葉 多糖。9. 權(quán)利要求1所述的黃蜀葵莖葉多糖在制備免疫增強藥物或保健食品中的應(yīng)用。
【文檔編號】C08B37/00GK106008729SQ201610232324
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年4月14日
【發(fā)明人】郭盛, 段金廒, 錢大瑋, 嚴輝
【申請人】南京中醫(yī)藥大學(xué)