一種基于聚多糖的可注射自修復(fù)水凝膠、制備方法及其在生物組織工程方面的應(yīng)用
【專利摘要】一種基于聚多糖的可注射自修復(fù)水凝膠、制備方法及其在生物組織工程方面的應(yīng)用，屬于高分子材料技術(shù)領(lǐng)域。該方法首先對天然高分子殼聚糖進行修飾，克服了其只能在酸性溶液中溶解的缺點，提高其在水中溶解性質(zhì)；然后將其與修飾后的透明質(zhì)酸鈉衍生物溶液混合反應(yīng)，延遲反應(yīng)時間或升高溫度，則產(chǎn)生從溶膠到凝膠相轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，賦予該水凝膠可注射和自修復(fù)特點。細(xì)胞共培養(yǎng)實驗表明該智能水凝膠具有良好的生物相容性、可降解性等優(yōu)點。該種可注射、自修復(fù)的聚多糖水凝膠作為一種新型醫(yī)用高分子載體材料，無論在與細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA、抗體等活性物質(zhì)進行共培養(yǎng)，還是藥物等體外物質(zhì)的傳遞和釋放等方面都具有潛在的生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。
【專利說明】
一種基于聚多糖的可注射自修復(fù)水凝膠、制備方法及其在生物組織工程方面的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于聚多糖的可注射自修復(fù)水凝膠、制備方法及其在生物組織工程方面的應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]近年來，智能材料的研究工作空前活躍，其中具有智能相態(tài)變化行為的新型軟物質(zhì)材料的發(fā)展最為迅速。這類材料能感知周圍環(huán)境條件，如溫度、酸堿、壓力、聲波、電場、磁場和光波的變化，同時產(chǎn)生相應(yīng)的相態(tài)變化。水凝膠就是其中一種。它是一種由親、疏水兩類基團構(gòu)成的三維立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其中親水部分吸收大量的水分，賦予水凝膠類似于液體的流動性；同時疏水部分又使其具有一定的力學(xué)性能。由于水凝膠適度的柔軟和良好的生物相容性，可以與生物體建立密切的關(guān)系，近年來成為一種重要的智能型新型材料。雖然研究和開發(fā)的歷史不長，但是由于水凝膠獨特的性能，使其在化學(xué)傳感器、微型開關(guān)、人工肌肉、藥物緩釋、固定化酶、藥物傳輸、人造軟骨、以及人體器官的3D打印等方面都有潛在的應(yīng)用前景。尤其在生物組織工程方面，這是因為水凝膠不僅具有高度可調(diào)的化學(xué)、物理性質(zhì)， 作為結(jié)構(gòu)支撐的同時，還具有保持細(xì)胞、促進血管生成、傳遞小分子等功能。
[0003]隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們對高端醫(yī)用材料的需求也日益增加，具有可注射性質(zhì)的水凝膠能夠最大程度地減小傷口面積，減緩患者患處疼痛，在此方面，可注射智能水凝膠在具有實際應(yīng)用價值。除此之外，自修復(fù)功能是生物體最顯著的特征之一，但是在合成材料中， 由于外界環(huán)境中微生物的降解，或者外界應(yīng)變和應(yīng)力受到損傷時，材料的使用壽命大多會降低。為了克服老化和損壞造成材料使用壽命受到的局限，構(gòu)建具有自修復(fù)功能可以抵御外界損傷的水凝膠具有重要意義。將可注射和自修復(fù)整合到同一個材料體系，用于生物組織工程等方面具有非常重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種基于聚多糖的可注射自修復(fù)水凝膠、制備方法及其在生物組織工程方面的應(yīng)用。
[0005]該方法首先對天然高分子殼聚糖進行修飾，克服了其只能在酸性溶液中溶解的缺點，提高其在水中溶解性質(zhì);然后將其與修飾后的透明質(zhì)酸鈉衍生物溶液混合反應(yīng)，延遲反應(yīng)時間或升高溫度，則產(chǎn)生從溶膠到凝膠相轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，賦予該水凝膠可注射和自修復(fù)特點。除此之外，構(gòu)建該智能水凝膠的這兩種聚多糖材料具有生物相容性好、無毒、價格低廉、 來源廣等特點，已經(jīng)在許多商業(yè)化的生物醫(yī)藥產(chǎn)品中得到應(yīng)用。細(xì)胞共培養(yǎng)實驗表明了該智能水凝膠具有良好的生物相容性、可降解性等優(yōu)點。綜合以上優(yōu)異的性質(zhì)，該種可注射、 自修復(fù)的聚多糖水凝膠作為一種新型醫(yī)用高分子載體材料，無論在與細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA、抗體等活性物質(zhì)進行共培養(yǎng)，還是藥物等體外物質(zhì)的傳遞和釋放等方面都具有潛在的生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用價值。
[0006]本發(fā)明所述的具有可注射自修復(fù)特性的智能聚多糖水凝膠的制備方法，其具體步驟如下:
[0007](1) 1.0?4.0g多糖聚合物1室溫下攪拌溶解在100?200mL的蒸餾水中，緩慢滴加 0.5?1.5mL反應(yīng)物2，升溫到40?50°C磁力攪拌反應(yīng)1?3天，獲得淡黃色澄清粘稠狀液體； 將得到的粘稠狀液體冷卻到室溫，加入1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)體系pH=10?12,然后利用分子量為8000?14000的滲析袋滲析2?3天，并不斷換水，滲析后的聚合物溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去大部分水，得到澄清并具有一定粘度的液體，于-50?_30°C冷凍干燥2?3天，得到固體粉末 A；
[0008](2)取1 ? 0?2 ? 0g多糖聚合物3，室溫下攪拌溶解在100?200mL蒸餾水中，加入0 ? 5 ?1.0g高碘酸鈉(NaI〇4)，避光下攪拌反應(yīng)3?4小時;然后加入乙二醇1?2mL繼續(xù)攪拌1? 2h終止反應(yīng);利用分子量為1000?3500的滲析袋滲析2?3天，并不斷換水，滲析后的聚合物溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去大部分水，得到澄清粘稠液體，于-50?_30°C冷凍干燥2?3天，得到固體粉末B;
[0009](3)取PEG聚合物4?40g，加入用4A型分子篩干燥的二氯化碳100?150mL，并于室溫下攪拌均勻，得到無色澄清液體;然后加入用4A型分子篩干燥的三乙胺500?600此，再用滴液漏斗逐滴加入丙烯酰氯600?700iiL，強烈攪拌，室溫下通氮氣除氧30?60分鐘，然后控溫至20?30°C，在攪拌下反應(yīng)20?24小時，降至室溫停止反應(yīng)，并用6?10wt%的碳酸鉀水溶液中和大部分酸，溶液逐漸分層，然后用分液漏斗收集下層乳狀液體;下層乳狀液體用50 ?l〇〇g無水硫酸鎂干燥30?60min，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去大部分溶劑，將所得聚合物乳液用乙醚反沉淀，將沉淀用蒸餾水洗滌和離心3?5次，即得到修飾有雙鍵的PEG聚合物C;
[0010](4)將固體粉末A、固體粉末B、修飾有雙鍵的PEG聚合物C分別配成1?2wt %的水溶液，分別取三種溶液各1?2mL混合均勻后，加入10?200此的光引發(fā)劑，震蕩均勻形成均一穩(wěn)定的透明粘稠溶液;經(jīng)過20?60s得到可注射具有自修復(fù)性能的水凝膠;再利用紫外燈照射1?10min后，得到具有自修復(fù)性能的高強度水凝膠材料;隨著聚合物C中PEG分子量的增加，可注射自修復(fù)水凝膠的力學(xué)性能不斷增強，儲能模量可以達(dá)到100?l〇〇〇〇Pa，極大拓展了該水凝膠材料在組織工程上的應(yīng)用。
[0011]上述方法中，多糖聚合物1可以是殼聚糖或者乙二醇?xì)ぞ厶堑取?br>[0012]上述方法中，反應(yīng)物2可以是丙烯酸、甲基丙烯酸、巰基乙酸、巰基丙酸或2-乙基丙稀酸等。
[0013]上述方法中，多糖聚合物3可以是透明質(zhì)酸鈉，海藻酸鈉，硫酸葡聚糖等天然聚多糖高分子。
[0014]上述方法中，PEG聚合物的分子量可以是600?20000(進一步地為2000?6000)。 [〇〇15] 上述方法中，光引發(fā)劑可以是1173或1-2959。
[0016]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:1.所合成的水凝膠以聚多糖為主要原料，來源廣、價廉、生物相容性好、無毒，有利于該產(chǎn)品商業(yè)化;2.組份混合后從溶膠到凝聚有一定時間，可以實現(xiàn)可注射塑形功能。該種合成方法簡單可控，環(huán)境友好;3.將具有修飾雙鍵的PEG高分子結(jié)構(gòu)摻雜在水凝膠體系中，可以通過光交聯(lián)方法形成具有雙重網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠材料。這樣能很容易地調(diào)整該水凝膠的力學(xué)性能，從柔軟到具有一定強度，增加了水凝膠在環(huán)境變化過程中的穩(wěn)定性，進而提高了水凝膠材料在組織工程等方面的應(yīng)用前景;4.合成的水凝膠含水量可以達(dá)到85%以上，凍干后的電鏡圖說明該水凝膠為疏松多孔狀，這樣既有利用氣體進出也有利于營養(yǎng)物質(zhì)交換，在生物體應(yīng)用時利于進行新陳代謝;5.水凝膠的構(gòu)建主要基于動態(tài)化學(xué)鍵，其在適當(dāng)?shù)臈l件下可逆地斷裂和成鍵，這類相互作用不同于傳統(tǒng)的共價鍵，從而使水凝膠具有自修復(fù)功能;6.具有可注射和自修復(fù)性質(zhì)的水凝膠材料可以摻雜藥物、細(xì)胞等，可以根據(jù)傷口面積和表明形狀進行注射塑形，減緩患者患處疼痛，還能直接把目標(biāo)藥物等物質(zhì)直接作用于患處，簡單可靠?！靖綀D說明】
[0017]圖1:為實施例1制備的聚多糖水凝膠相態(tài)變化圖。通過試劑瓶傾斜實驗可以看出， 聚合物A溶液(圖A)和聚合物B溶液(圖B)均為無色澄清液體，混合后為具有一定粘度的溶膠 (圖C);室溫下靜置30s后，從溶膠可以變成凝膠(圖D)。
[0018]圖2:為實施例1制備的聚多糖水凝膠的可注射性質(zhì)照片。由圖可知，該聚多糖水凝膠可以由內(nèi)徑為〇.33_針頭注射，表現(xiàn)出良好的可注射性質(zhì)。
[0019]圖3:為實施例1制備的聚多糖水凝膠自修復(fù)照片；可以看到水凝膠中部受到機械損傷破壞后，隨著時間的推移中間的空隙逐漸變小，最后完全消失。表現(xiàn)出明顯的自修復(fù)性質(zhì)。
[0020]圖4:為實施例1制備的聚多糖水凝膠與細(xì)胞共培養(yǎng)成活率柱狀圖。與細(xì)胞培養(yǎng)液組(control)進行對照比較，海拉細(xì)胞(實驗用增殖表皮癌細(xì)胞，由吉大二院提供)與本發(fā)明制備的聚多糖水凝膠共培養(yǎng)4天之后仍然具有大于90%成活率，表明該水凝膠無毒、生物相容性非常好。值得注意的是，該水凝膠在與海拉細(xì)胞共培養(yǎng)10天之后，細(xì)胞成活率大于 100%。這是因為水凝膠微環(huán)境有利于細(xì)胞生長，進而促進了該細(xì)胞的增值。【具體實施方式】
[0021]實施例1:
[0022] 1)2.05g殼聚糖，室溫下攪拌溶解在100mL蒸餾水中。緩慢滴加丙烯酸1.5mL，升高溫度到50°C，磁力攪拌反應(yīng)3天，獲得淡黃色澄清粘稠狀液體。將得到的聚合物溶液冷卻到室溫，加入1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)體系pH到12。用分子量為14000的滲析袋滲析3天，并不斷換水。 滲析后的聚合物溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去大部分水，得到澄清并具有一定粘度的液體。于-50 °C冷凍干燥3天，得到蓬松多孔狀N-羧甲基殼聚糖(N-carboxyethy 1 chi tosan)固體粉末A， 產(chǎn)率約為75%。[〇〇23] 2)取透明質(zhì)酸鈉l.0Og，室溫下攪拌溶解在100mL蒸餾水中，加入高碘酸鈉(Na104) 0.5528g，避光攪拌反應(yīng)4小時。加入乙二醇1.5mL繼續(xù)攪拌2h終止反應(yīng)。用分子量為1000的滲析袋滲析3天。滲析后的聚合物溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去大部分水，得到澄清粘稠液體。于_ 50°C冷凍干燥3天，得到蓬松多孔狀透明質(zhì)酸醛(Hyaluronic acid aldehyde)固體粉末B， 產(chǎn)率約為70 %。[〇〇24] 3)取分子量為2000的PEG 4.00g加入三頸燒瓶中，加入用4A型分子篩干燥的二氯化碳100mL，并于室溫下攪拌均勻，得到無色澄清液體。加入用4A型分子篩干燥的三乙胺550 此，然后用滴液漏斗逐滴加入丙烯酰氯650此，強烈攪拌，室溫下通氮氣除氧50min，然后控溫到25°C，攪拌下反應(yīng)24小時，降至室溫停止反應(yīng)，用6wt%的碳酸鉀水溶液lOOmL中和大部分酸，溶液分層，然后用分液漏斗收集下層乳狀液體。下層乳狀液體接下來用無水硫酸鎂干燥半小時，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去大部分二氯化碳溶劑。將處理后產(chǎn)物用乙醚反沉淀，并反復(fù)離心和洗滌產(chǎn)物3次，除去剩余的二氯化碳溶劑，并得到聚乙二醇丙烯酸酯PEGDAmo聚合物 C，為白色粉末，產(chǎn)率約為65 %。
[0025]4)在反應(yīng)器中加入0.llg N-羧甲基殼聚糖固體粉末A，加入llmL蒸餾水，配成lwt %的水溶液;取0.1 lg的透明質(zhì)酸鈉修飾后的透明質(zhì)酸醛固體粉末B加入1 lmL蒸餾水，配成lwt %的水溶液；取0 ? 15g PEGDA2000固體粉本C，溶于9 ? 85mL蒸餾水，配置成1 ? 5wt %的 PEGDA2QQ()溶液。分別取lwt%的N-羧甲基殼聚糖溶液、lwt%的透明質(zhì)酸醛溶液各lmL， 1.5wt %的PEGDA2Q(X)溶液2mL以及光引發(fā)劑1173 10yL震蕩混合均勻后，經(jīng)過30s得到具有自修復(fù)性能的水凝膠。水凝膠的可注射性和自修復(fù)性質(zhì)見圖1和圖2。利用紫外燈(365nm)照射 lmin，獲得高強度水凝膠。[〇〇26] 實施例2:[〇〇27]l)2.05g乙二醇?xì)ぞ厶牵覝叵聰嚢枞芙庠?00mL蒸餾水中。緩慢滴加丙烯酸1.5mL，升高溫度到50°C，磁力攪拌反應(yīng)3天，獲得淡黃色澄清粘稠狀液體。將得到的聚合物溶液冷卻到室溫，加入1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)體系pH到12。用分子量為8000的滲析袋滲析3天，并不斷換水。滲析后的聚合物溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去大部分水，得到澄清并具有一定粘度的液體。于-50°C冷凍干燥3天，得到蓬松多孔狀N-羧甲基乙二醇?xì)ぞ厶枪腆w粉末A，產(chǎn)率約為 75%。[〇〇28]2)取硫酸葡聚糖l.0Og，室溫下攪拌溶解在100mL蒸餾水中，加入高碘酸鈉(Na104)0.30g，避光攪拌4小時。加入乙二醇1.0mL繼續(xù)攪拌2h終止反應(yīng)。用分子量為3500的滲析袋滲析3天，滲析后聚合物溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去大部分水，得到澄清粘稠液體，于_50°C冷凍干燥3天，得到蓬松多孔狀硫酸葡聚糖醛(Dextran sulphate aldehyde)固體粉末B。[〇〇29]3)取分子量為6000的PEG 12.00g加入三頸燒瓶中，加入用4A型分子篩干燥的二氯化碳100mL，并于室溫下攪拌均勻，得到無色澄清液體。加入用4A型分子篩干燥的三乙胺550 此，然后用滴液漏斗逐滴加入丙烯酰氯650此，強烈攪拌，室溫下通氮氣除氧50min。然后控溫到25°C，攪拌下反應(yīng)24小時。降至室溫停止反應(yīng)，用6wt %的碳酸鉀水溶液100mL中和大部分酸，用分液漏斗收集下層乳狀液體。然后用50g無水硫酸鎂干燥半小時，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去大部分二氯化碳溶劑。將處理后產(chǎn)物用乙醚反沉淀，并用蒸餾水反復(fù)洗滌和離心產(chǎn)物3 次，得到聚乙二醇丙烯酸酯PEGDA6Q(K)聚合物C，為白色粉末，產(chǎn)率約為65 %。
[0030]4)在反應(yīng)器中加入0.10g N-羧甲基乙二醇?xì)ぞ厶莾龈煞勰〢，加入10mL蒸餾水，配成lwt %的水溶液;取0.10g的硫酸葡聚糖修飾后的硫酸葡聚糖醛固體粉末B加入10mL蒸餾水，配成lwt %的水溶液;取0.15g分子量為6000的PE⑶AfMoo固體聚合物C，溶于9.85mL蒸餾水，配置成1.5wt %的PE⑶A.0溶液。分別取lwt %的N-羧甲基乙二醇?xì)ぞ厶侨芤骸wt %的硫酸葡聚糖酯醛溶液各lmL，1.5wt%的PE⑶A6Q(X)溶液2mL以及光引發(fā)劑1-2959 200yL均勻混合，經(jīng)過40s得到具有自修復(fù)性能的水凝膠。再利用紫外燈(365nm)照射2min，獲得高強度水凝膠。與實施例1制備的水凝膠過程相比，硫酸葡聚糖為該水凝膠主要成分之一。當(dāng)硫酸葡聚糖分子量比透明質(zhì)酸鈉小時，力學(xué)性能將比實施例1中要差。
【主權(quán)項】
1.一種基于聚多糖的可注射自修復(fù)水凝膠的制備方法，其步驟如下:(1)1.0?4.0g多糖聚合物1室溫下攪拌溶解在100?200mL的蒸餾水中，緩慢滴加0.5? 1.5mL反應(yīng)物2，升溫到40?50°C磁力攪拌反應(yīng)1?3天，獲得淡黃色澄清粘稠狀液體;將得到 的粘稠狀液體冷卻到室溫，加入1M氫氧化鈉調(diào)節(jié)體系pH= 10?12,然后利用分子量為8000 ?14000的滲析袋滲析2?3天，并不斷換水，滲析后的聚合物溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去大部分 水，得到澄清并具有一定粘度的液體，于-50?_30°C冷凍干燥2?3天，得到固體粉末A;(2)取1 ? 0?2 ? Og多糖聚合物3，室溫下攪拌溶解在100mL?200mL蒸餾水中，加入0 ? 5? 1.0g高碘酸鈉(NaI〇4)，避光下攪拌反應(yīng)3?4小時；然后加入乙二醇1?2mL繼續(xù)攪拌1?2h 終止反應(yīng);利用分子量為1000?3500的滲析袋滲析2?3天，并不斷換水，滲析后的聚合物溶 液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去大部分水，得到澄清粘稠液體，于-50?_30°C冷凍干燥2?3天，得到固 體粉末B;(3)取PEG聚合物4?40g，加入用4A型分子篩干燥的二氯化碳100?150mL，并于室溫下 攪拌均勻，得到無色澄清液體;然后加入用4A型分子篩干燥的三乙胺500?600此，再用滴液 漏斗逐滴加入丙烯酰氯600?700此，強烈攪拌，室溫下通氮氣除氧30?60分鐘，然后控溫至 20?30°C，在攪拌下反應(yīng)20?24小時，降至室溫停止反應(yīng)，并用6?10wt%的碳酸鉀水溶液 中和大部分酸，溶液逐漸分層，然后用分液漏斗收集下層乳狀液體；下層乳狀液體用50? l〇〇g無水硫酸鎂干燥30?60min，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去大部分溶劑，將所得聚合物乳液用乙 醚反沉淀，將沉淀用蒸餾水洗滌和離心3?5次，即得到修飾有雙鍵的PEG聚合物C;(4)將固體粉末A、固體粉末B、修飾有雙鍵的PEG聚合物C分別配成1?2wt %的水溶液， 分別取三種溶液各1?2mL混合均勻后，加入10?200此的光引發(fā)劑，震蕩均勻形成均一穩(wěn)定 的透明粘稠溶液;經(jīng)過20?60s得到可注射具有自修復(fù)性能的水凝膠;再利用紫外燈照射1 ?10min后，得到具有自修復(fù)性能的高強度水凝膠材料；其中，多糖聚合物1是殼聚糖或乙二醇?xì)ぞ厶牵环磻?yīng)物2是丙烯酸、甲基丙烯酸、巰基乙酸、巰基丙酸或2-乙基丙烯酸；多糖聚合物3是透明質(zhì)酸鈉、海藻酸鈉或硫酸葡聚糖。2.如權(quán)利要求1所述的一種基于聚多糖的可注射自修復(fù)水凝膠的制備方法，其特征在 于:PEG聚合物的分子量為600?20000。3.如權(quán)利要求1所述的一種基于聚多糖的可注射自修復(fù)水凝膠的制備方法，其特征在 于:光引發(fā)劑是1173或1-2959。4.一種基于聚多糖的可注射自修復(fù)水凝膠，其特征在于:由權(quán)利要求1?3任何一項所 述的方法制備得到。5.權(quán)利要求1所述的一種基于聚多糖的可注射自修復(fù)水凝膠在生物組織工程方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C08L5/02GK106009003SQ201610538145
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月11日
【發(fā)明人】林權(quán), 趙月, 楊旭東, 王威, 姜英男, 張川, 楊柏
【申請人】吉林大學(xué)