中國被毛孢人工侵染蝙蝠蛾幼蟲的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種中國被毛孢人工侵染蝙蝠蛾幼蟲的方法。包括以下步驟：A、子囊孢子彈射至培養(yǎng)皿中，加入無菌水，稀釋成菌液，菌液與飼養(yǎng)基質(zhì)混合得到含菌飼養(yǎng)基質(zhì)，B、將蝙蝠蛾幼蟲放入到含菌飼養(yǎng)基質(zhì)的飼料盒中，C、用含菌飼料喂養(yǎng)蝙蝠蛾幼蟲。本發(fā)明提供的人工侵染方法，侵染率和僵蟲形成率都較高，為人工培育冬蟲夏草奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
中國被毛抱人工侵染騙幅蛾幼蟲的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種中國被毛抱人工侵染騙幅蛾幼蟲的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲夏草是我國獨有珍貴的特產(chǎn)，又稱作蟲草。因其醫(yī)療保健功效強大，故與鹿 茸、人參齊名，被列位于Ξ大補品。研究初期，有人曾把冬蟲夏草歸于肉座目 (Hypocreeales)，但是根據(jù)近期的系統(tǒng)分類，冬蟲夏草應歸屬于真菌界(Fungi)、子囊菌口 (Ascomycota)、子囊菌綱（Ascomycetes)、糞殼菌亞綱（Sordariomycetidae)、肉座菌目、麥 角菌科(Clavicipifaceae)、蟲草屬(Cordyceps)。所W，冬蟲夏草是麥角菌科真菌冬蟲夏草 菌寄生在騙幅科昆蟲騙幅蛾越冬幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復合體。
[0003] 冬蟲夏草是由于騙幅蛾幼蟲被中國被毛抱菌侵染，幼蟲體淪為營養(yǎng)寄主而形成 的。通常在初冬季節(jié)，騙幅蛾幼蟲接觸到中國被毛抱菌，便會被侵染。未僵死的幼蟲逐漸蠕 動到近地表處，直至蟲體營養(yǎng)消耗殆盡，幼蟲死亡，此時整個蟲體被中國被毛抱菌絲體充 滿，形成僵蟲。蟲體僵死后，便進入了冬蟲夏草的有性生長階段，首先蟲體頭部會逐漸長出 子座原基，等到春末夏初，子座原基便開始發(fā)育，長出形狀如草的子座，即蟲草的繁殖器官。
[0004] 冬蟲夏草對其生長環(huán)境條件的獨特需求，致使其分布區(qū)域有局限性，僅分布于我 國云南、貴州、西藏、青海、四川西部及甘肅南部地區(qū)，通常生長于海拔為3000-5000m的高山 草甸中。由于其生長環(huán)境特殊、生長周期長等原因，目前還沒有實現(xiàn)人工栽培。
[0005] 每年夏秋季，冬蟲夏草菌開始在侵染幼蟲的體內(nèi)生長，數(shù)月后菌絲充滿幼蟲體腔， 入冬時形成僵蟲，很快在±壤凍結(jié)前，從僵蟲蟻裂線長出子座芽。到來年春夏，子座芽繼續(xù) 生長，伸出地面。至化月中下旬，子座頭部漸漸膨大，子座和子囊發(fā)育成熟。當年入秋后冬蟲 夏草開始有性世代，在當年±壤凍結(jié)前從被侵染的寄主蟲體頭部長出短小的子座。在青海 玉樹，9月下旬就已經(jīng)可W挖到被寄生的蟲體，頭部的子座高約1cm且不露出±面，次年5月 化凍后，±壤溫濕度適合子囊菌生長，子座W每天3-4mm的速度長出地面，形似小草，子座出 上初為淡綠色，后變?yōu)樽霞t色，一般在露出地面部分達20-50mm時不再繼續(xù)生長。到6月中 旬，子座頭部漸漸肥大，7月下旬子囊抱子長成。8-9月逐漸成熟并從子囊殼散發(fā)出來，繼續(xù) 對寄主幼蟲進行寄生。
[0006] 1980年W來，科研人員不斷地對冬蟲夏草菌的分離培養(yǎng)和冬蟲夏草的人工栽培進 行深入研究。研究人員先后分離、報道的與冬蟲夏草有關(guān)的無性型菌種多達20多個學名， 2005年的中國菌物學會對冬蟲夏草及其無性型進行了研討。中國菌物學會理事長李玉教授 主持，中國科學院院±魏江春研究員作了冬蟲夏草菌及其相關(guān)類群分子系統(tǒng)學分析的專題 報告。會議確認冬蟲夏草菌的拉下學名是Cordyc巧S sinensis,其無性型是中國被毛抱。國 際承認的無性型拉下學名為Hirs;rtella sinensis Liu,Guo,化et Zeng。
[0007] 雖然大量科學研究證明冬蟲夏草的無性型是中國被毛抱，然而仍存在只要分離自 冬蟲夏草的菌種即其無性型的認識。最常見的如騙幅蛾擬青霉化ecilomyces hepiali 化en et Dai,sp.Nov,目前已被廣泛用于保健食品的生產(chǎn)。研究證明，它雖然分離自冬蟲夏 草，但不是冬蟲夏草的無性型。
[0008] 人工培養(yǎng)冬蟲夏草過程中，中國被毛抱侵染騙幅蛾幼蟲的是關(guān)鍵步驟。較長一段 時間W來，人工接種幼蟲的感染率一直比較低。如王忠，馬啟龍，喬正強等發(fā)表的"冬蟲夏草 全人工培養(yǎng)感染試驗結(jié)果"，甘肅農(nóng)業(yè)科技，2001，7:40-41，報道W子囊抱子、分生抱子、菌 絲混合懸浮液涂抹接種幼蟲，感染率最高可達15%，，為人工培育奠定了堅實的基礎(chǔ)，也為 侵染相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供了有價值的素材。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的提供一種中國被毛抱人工侵染騙幅蛾幼蟲的方法。
[0010] 為達到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案:一種中國被毛抱人工侵染騙幅蛾 幼蟲的方法，其特征在于，包括W下步驟：
[0011] A、子囊抱子彈射至培養(yǎng)皿中，加入無菌水，稀釋成菌液，菌液與飼養(yǎng)基質(zhì)混合得到 含菌飼養(yǎng)基質(zhì)，
[0012] B、將騙幅蛾幼蟲放入到含菌飼養(yǎng)基質(zhì)的飼料盒中，
[0013] C、用含菌飼料喂養(yǎng)騙幅蛾幼蟲。
[0014] 在上述的中國被毛抱人工侵染騙幅蛾幼蟲的方法中，在步驟A中，所述的菌液每毫 升含105個抱子，所述的飼養(yǎng)基質(zhì)為清水沙、木屑和高原腐殖±的混合物，在步驟B中，飼料 盒中含菌飼養(yǎng)基質(zhì)的厚度為20mm。
[0015] 在上述的中國被毛抱人工侵染騙幅蛾幼蟲的方法中，所述的飼養(yǎng)基質(zhì)為重量比為 5:2:6的清水沙、木屑和高原腐殖±的混合物，飼養(yǎng)基質(zhì)的含水量為55-65%。
[0016] 在上述的中國被毛抱人工侵染騙幅蛾幼蟲的方法中，在混合前，高原腐殖±60°C 烘烤4h W上，清水沙180°C烘烤化W上，木屑經(jīng)12 rC高壓蒸汽滅菌30min W上，
[0017] 在上述的中國被毛抱人工侵染騙幅蛾幼蟲的方法中，所述的飼養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)接入金針 茹固體母種并與飼養(yǎng)基質(zhì)攬拌均勻，在相對濕度為65-75%，溫度為20-23°C的培養(yǎng)室內(nèi)培 養(yǎng)10-14d。
[0018] 在上述的中國被毛抱人工侵染騙幅蛾幼蟲的方法中，所述的含菌飼料為l-2mm厚 的環(huán)形胡蘿l·片，飼養(yǎng)時間為60天，飼養(yǎng)期間不更換飼料。
[0019] 在上述的中國被毛抱人工侵染騙幅蛾幼蟲的方法中，所述的含菌飼料的制作方法 為:在無菌潔凈區(qū)內(nèi)，將冬蟲夏草子座部分伸入到預先培養(yǎng)合格的平板中，蓋上皿蓋，使子 囊抱子自然彈射至平板的培養(yǎng)基表面上，含有菌種的平板在程控霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)形成菌 落，培養(yǎng)溫度為15Γ，培養(yǎng)時間為50天，所述的菌落經(jīng)過2-3次純化培養(yǎng)，純化后的菌落放入 到液體培養(yǎng)基中，將液體培養(yǎng)基噴灑到飼料上形成含菌飼料。
[0020] 在上述的中國被毛抱人工侵染騙幅蛾幼蟲的方法中，彈射時間不小于7天，每天光 照12h，光照強度為3(K)Lx。
[0021] 在上述的中國被毛抱人工侵染騙幅蛾幼蟲的方法中，冬蟲夏草子座的蟲體部分露 在平板外部，蟲體部分用含有無菌水的無菌紗布覆蓋包扎、保濕。
[0022] 在上述的中國被毛抱人工侵染騙幅蛾幼蟲的方法中，所述的平板的制備方法是： 馬鈴馨去皮洗凈，稱取300g馬鈴馨，切成小塊狀，加水煮爛，過濾，加入瓊脂和葡萄糖，繼續(xù) 加熱，并攬拌混勻，冷卻，加入蠶蛹粉提取液、酵母粉提取液和玉米粉提取液，再補加水定容 至lOOOmL，即為PDA培養(yǎng)基，分裝后滅菌，將滅過菌的PDA培養(yǎng)基在無菌環(huán)境下倒入培養(yǎng)皿 中，凝固后形成平板。
[0023] 與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0024] 1、子囊抱子分離法較容易獲得中國被毛抱純菌種，適用于冬蟲夏草菌種的分離， 子囊抱子分離純化或得菌種的方法方便快捷，且成功率高，改良的PDA培養(yǎng)基對中國被毛抱 的生長有顯著的促進作用。
[0025] 2、提供了一種人工培育冬蟲夏草菌寄主騙幅蛾幼蟲的方法，存活率高，且用于人 工侵染時也能提高幼蟲的存活率，從而提高侵染率；
[0026] 3、本發(fā)明提供的人工侵染方法，侵染率和僵蟲形成率都較高，為人工培育冬蟲夏 草奠定了基礎(chǔ)。
【具體實施方式】
[0027] 下述實施例中所用的試劑，如無特殊說明，可W從常規(guī)生化試劑商店購買得到。W 下實施例中的定量數(shù)據(jù)，均設(shè)置Ξ次重復實驗，結(jié)果取平均值。
[0028] 實施例1
[0029] 在本實施例中，平板的制備方法是：馬鈴馨去皮洗凈，稱取300g馬鈴馨，切成小塊 狀，加水煮爛，過濾，加入瓊脂15-20g和葡萄糖20g，繼續(xù)加熱，并攬拌混勻，冷卻，加入蠶蛹 粉提取液、酵母粉提取液和玉米粉提取液，再補加水定容至1000mL，PDA培養(yǎng)基，分裝后滅 菌，將滅過菌的PDA培養(yǎng)基在無菌環(huán)境下倒入培養(yǎng)皿中，凝固后形成平板。培養(yǎng)基在37Γ培 養(yǎng)箱培養(yǎng)2地，確定無菌生長后倒入到培養(yǎng)皿中。蠶蛹粉提取液、酵母粉提取液選用市售的 蠶蛹粉提取物、酵母粉提取物、玉米粉提取物加水形成，市售產(chǎn)品的質(zhì)量標準符合中國藥 典，其中蠶蛹粉提取液、酵母粉提取液和玉米粉提取液中的固形物與馬鈴馨的重量比為 0.1-1:0.1-1:0.1-1:100，優(yōu)選為 0.5-0.7:0.6-0.8:0.3-0.5。
[0030] 冬蟲夏草無性型中國被毛抱純菌種的培養(yǎng)方法，包括W下步驟：
[0031] A、采樣，采集子囊抱子未彈射的野生冬蟲夏草子座，保存，優(yōu)選地，在4Γ冷藏保 存，在本實施例中，野生冬蟲夏草子座來自四川省阿巧藏族弟族自治州黑水縣，海拔3000- 4000米，高寒草甸，
[0032] B、分離，取冬蟲夏草子座中的菌種于無菌條件下接種于平板中，平板是指裝有培 養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，
[0033] C、培養(yǎng)，將含有菌種的平板在培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，得到中國被毛抱菌落，
[0034] D、純化，將步驟C中的菌落轉(zhuǎn)移至新的平板中進行培養(yǎng)，獲得中國被毛抱純菌種。
[0035] 在步驟B中，接種方法為:將超凈工作臺用0.1 %新潔爾滅擦拭，保持lOmin后打開 超凈工作臺風機和紫外燈自凈30minW上，得到無菌潔凈區(qū)，在無菌潔凈區(qū)內(nèi)，按照潔凈區(qū) 要求進行更衣和物料傳遞。將冬蟲夏草子座部分伸入到預先培養(yǎng)合格的平板中，蓋上皿蓋， 使子囊抱子自然彈射至平板的培養(yǎng)基表面上。優(yōu)選地，彈射時間不小于7天，每天光照12h， 光照強度為3(K)Lx。冬蟲夏草子座的蟲體部分露在平板外部，蟲體部分用含有無菌水的無菌 紗布覆蓋包扎、保濕。
[0036] 在步驟C中，含有菌種的平板在程控霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為15Γ，培養(yǎng)時間 為50天。
[0037]在步驟D中，所述的菌落經(jīng)過2-3次純化培養(yǎng)。需要說明的是，如果經(jīng)過2次純化，是 指將前一個新的平板中培養(yǎng)的菌種移到另一個新的平板中繼續(xù)培養(yǎng)，依次類推。
[003引實施例2
[0039] 本實施例與實施例1基本相同，不同之處在于，在步驟B中，接種方法為:子囊抱子 彈射7d后將剩余子座內(nèi)核用酒精消毒后，從子座和蟲體連接處剪去蟲體，在無菌條件下用 消毒后的綴子剝?nèi)プ幼鈱雍稚z組織，至露出類白色內(nèi)部菌絲，用綴子撕下少許白色 菌絲，用消毒后的剪刀剪成小段，放入平板中培養(yǎng)進行步驟C和D。
[0040] 實施例3
[0041] 本實施例與實施例1基本相同，不同之處在于，在步驟B中，接種方法為:子囊抱子 彈射7d后將剩余子座內(nèi)核用酒精消毒后，從子座和蟲體連接處剪去蟲體，將蟲體外部消毒 后，用刀切開，取少量蟲體內(nèi)部組織放入平板中培養(yǎng)進行步驟C和D。
[0042] 實施例4
[0043] 本實施例與實施例1基本相同，不同之處在于，在步驟C中，含有菌種的平板在程控 霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為15 °C，培養(yǎng)時間為30天。
[0044] 對比例1
[0045] 本實施例與實施例1基本相同，不同之處在于，平板的制備方法是：馬鈴馨去皮洗 凈，稱取300g馬鈴馨，切成小塊狀，加水煮爛，過濾，加入瓊脂15-20g和葡萄糖20g，繼續(xù)加 熱，并攬拌混勻，冷卻，分裝后滅菌，將滅過菌的PDA培養(yǎng)基在無菌環(huán)境下倒入培養(yǎng)皿中，凝 固后形成平板。培養(yǎng)基在37Γ培養(yǎng)箱培養(yǎng)2地，確定無菌生長后倒入到培養(yǎng)皿中。
[0046] 其余步驟同實施例1。
[0047] 對比例2
[004引將實施例1獲得的中國被毛抱純菌種接種到對比例1的平板中，溫度15Γ培養(yǎng)20 天。
[0049] 對比例3
[0050] 將實施例1獲得的中國被毛抱純菌種接種到實施例1的平板中，溫度15Γ培養(yǎng)20 天。
[0化1 ] 分析
[0052] 1、實施例1、實施例4與對比例1在分別按步驟D培養(yǎng)，得到不同固體培養(yǎng)基對中華 被毛抱生長的影響表
[0化3]
[0054]中國被毛抱在普通PDA固體培養(yǎng)基中15°C培養(yǎng)30d，肉眼幾乎不可見或僅可見針尖 大小菌落，培養(yǎng)50dW上，菌落直徑可達0.2-0.3cm左右，而在實施例1和實施例4的PDA固體 培養(yǎng)基中15 °C培養(yǎng)30d，菌落直徑可達0.8-1.0cm左右，培養(yǎng)50d W上，菌落直徑可達2.0- 3.0cm左右。在實施例1和4的固體培養(yǎng)基上的中國被毛抱菌落，菌絲潔白、粗壯，富有光澤， 呈現(xiàn)疏松的棉花糖狀。實驗表明，在PDA基礎(chǔ)上，加入一定比例的蠶蛹粉提取液、酵母粉提取 液、玉米粉提取液，制成改良PDA培養(yǎng)基，可顯著促進中國被毛抱的生長。
[0化日]2、實施例1、2和3的分析
[0056]實施例1-3均能獲得中華被毛抱純菌種。但實施例2和3組織分離操作費時費力，需 要多次純化(至少5次），得到純菌種的成功率不高，實施例1子囊抱子分離純化或得菌種的 方法方便快捷，且成功率高。因此用實施例1的方法獲得中華被毛抱純菌種的效果最好。 [0化7] 3、對比例2和3的分析
[0化引
[0059] 對比例2在顯微鏡下僅可見極少數(shù)菌絲，對比例3肉眼可見大量菌絲球。
[0060] 菌絲觀察方法:a，制備染色液:乳酸石炭酸棉藍染色液(用于真菌固定和染色）：石 炭酸（結(jié)晶酪)20g，乳酸20mL，甘油40mL，棉藍0.05g，蒸饋水20mL。將棉藍溶于蒸饋水中，再 加入其他成分，微加熱使其溶解，冷卻后用;b，裝片鏡檢:在載玻片上滴ImL乳酸石炭酸棉藍 染色液，從被侵染的騙幅蛾幼蟲體內(nèi)挑取適量帶抱子的蟲體液，混合入載玻片的液滴中，并 將菌絲分散開。用低倍鏡觀察，必要時轉(zhuǎn)換高倍鏡鏡檢并記錄觀察結(jié)果。
[0061] 將實施例1-3分離純化獲得純培養(yǎng)物冷藏保存，取其中3個平板培養(yǎng)物進行菌種鑒 定。經(jīng)過DNA提取、擴增和測序，與DNA分子鑒定數(shù)據(jù)庫進行序列比較分析，同時進行了宏觀 和微觀形態(tài)觀察，結(jié)果表明實施例1-3的人工培養(yǎng)物為冬蟲夏草菌其無性型為中國被毛抱。
[0062] 實施例5
[0063] -種冬蟲夏草菌寄主騙幅蛾幼蟲的人工培養(yǎng)方法，包括W下步驟：
[0064] A、采蛹，采集高寒草甸地帶的野生騙幅蛾的蛹，保存，
[0065] B、采集飼養(yǎng)基質(zhì)，收集適量蟲蛹采挖區(qū)域周邊的高原腐殖±，
[0066] C、羽化、交配，將蛹放置在裝有高原腐殖±的容器內(nèi)，且蛹位于在±下2-3畑1，并在 容器四周圍W紗網(wǎng)，在9-12Γ下羽化，羽化成寄主騙幅蛾后，2-5d完成交配并產(chǎn)卵，寄主騙 幅蛾產(chǎn)卵后蟲卵立即在相對濕度為80%的環(huán)境下保存。
[0067] D、解化，取蟲卵放置于腐殖±表層，放進恒溫培養(yǎng)箱進行避光解化，恒溫培養(yǎng)箱溫 度為15°C，相對濕度為80-90%，解化成幼蟲，
[006引 E、飼養(yǎng)，取飼養(yǎng)盒，放入飼養(yǎng)基質(zhì)，將幼蟲轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)盒內(nèi)，放入飼料，在10-15°C 進行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)基質(zhì)為按重量比6:4混合后的高原腐殖±和沙子，飼養(yǎng)基質(zhì)厚度為10cm，飼 料為珠芽寥和/或胡蘿l·。
[0069] 實施例6
[0070] 本實施例與實施例5基本相同，不同之處在于，在步驟B中，收集蟲蛹時還采挖蟲蛹 附近的野生珠芽寥。
[0071] 在步驟E中，所述的飼養(yǎng)基質(zhì)按沙子:木屑：高原腐殖±^重量比1:2:2均勻混合， 邊混邊添加無菌水，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的水分含量為55%-65%。接入金針茹固體母種，充分攬拌 均勻?？刂婆囵B(yǎng)室相對濕度在70 %左右，溫度控制在20-23 °C左右，培養(yǎng)10-14d。在混合前， 高原腐殖±60°C烘烤地W上，清水沙180°C烘烤化W上，木屑經(jīng)12 rC高壓蒸汽滅菌30min W 上。
[0072] 實施例7
[0073] 本實施例與實施例5基本相同，不同之處在于，在步驟E中，所述的飼養(yǎng)基質(zhì)為重量 比為5: 2: 6的清水沙、木屑和高原腐殖±的混合物，飼養(yǎng)基質(zhì)的含水量為55-65%。在混合 前，高原腐殖±60°C烘烤4hW上，清水沙180°C烘烤化W上，木屑經(jīng)12TC高壓蒸汽滅菌 SOminW 上。
[0074] 實施例8
[0075] 本實施例與實施例7基本相同，不同之處在于，飼養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)接入金針茹固體母種并 與飼養(yǎng)基質(zhì)攬拌均勻，在相對濕度為70%，溫度為20-23°C的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)10-14d。飼養(yǎng)基 質(zhì)中加入l-2mm厚的環(huán)形胡蘿h片作為飼料，飼養(yǎng)時間為60天，飼養(yǎng)期間不更換飼料。
[0076] 實施例9
[0077] 本實施例與實施例8基本相同，不同之處在于，在步驟E中，飼養(yǎng)基質(zhì)中加入切成δ? ι?? 長的珠芽廖根莖，飼養(yǎng)時間為 60 天，飼養(yǎng)期間不更換飼料。
[007引對比例10
[0079] 本實施例與實施例8基本相同，不同之處在于，飼養(yǎng)時間為60天，每過20d更換一次 飼料。
[0080] 對比例11
[0081] 本實施例與實施例9基本相同，不同之處在于，飼養(yǎng)時間為60天，每過20d更換一次 飼料。
[0082] 對比例12
[0083] 本實施例在實施例6的基礎(chǔ)上，將金針茹固體母種在12TC高壓蒸汽滅菌30min后 與飼養(yǎng)基質(zhì)攬拌均勻。
[0084] 從同一批解化的騙幅蛾幼蟲收集400條4齡W上幼蟲，逐條稱重，計算平均體重。將 幼蟲平均放入實施例1-8的8個飼養(yǎng)盒內(nèi)。保持環(huán)境濕度65%-85%。初期保持房間溫度18 °C，5d后，溫度調(diào)為1(TC，飼養(yǎng)1個月后統(tǒng)計分析幼蟲存活率和體重變化率有無顯著差異。結(jié) 果見下表：
[0085] 幼蟲存活率和體重變化率 Γ00861
[0087] 實施例5、7和12的飼養(yǎng)基質(zhì)中均不含具有活性的金針茹菌種。實施例6、8、9、10和 11中含有具有活性的金針茹菌種。實施例7和8的飼養(yǎng)基質(zhì)相同，但實施例7中不含具有活性 的金針茹菌種。實施例5的飼養(yǎng)基質(zhì)中不含木屑。
[0088] 由上表可知，含有木屑的飼養(yǎng)基質(zhì)及含有活性金針茹菌種的實施例8和9的幼蟲成 活率最高，體重標化率最快。實施例12由于經(jīng)過高溫滅菌，飼養(yǎng)基質(zhì)中的活性微生物含量極 低，故而騙幅蛾幼蟲在其條件下的平均存活率遠低于其他實施例。是實施例8和9含有沙子 和木屑，沙子增加了基質(zhì)的透氣性和疏松度，既促進了金針茹菌種的生長，抑制了基質(zhì)中的 有害微生物的繁殖，又能滿足騙幅蛾幼蟲喜歡打隧道活動的特性，所W提高了幼蟲的成活 率。比較試驗結(jié)果可知，實施例8和9對于騙幅蛾生長的輔助優(yōu)勢更勝于其他實施例，即含活 性金針茹菌種的人工制備的基質(zhì)在人工飼養(yǎng)幼蟲過程中更符合幼蟲的要求，在為幼蟲生長 提供所需營養(yǎng)的同時，又有防治病害的作用。
[0089] 實施例8和9,實施例10和11的體重變化比較一致，分析原因，由于只是飼料不同， 其他條件基本一致，實施例8和10使用人工種植的胡蘿h為飼料，實施例9和11使用蟲冬蟲夏 草產(chǎn)區(qū)采挖的野生珠芽廖。由此可見，在人工飼養(yǎng)條件下，完全可W用低海拔地區(qū)的飼料替 代野生飼料，替代飼料資源豐富，成本低，且能滿足幼蟲的生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)。實施 例8和10,實施例9和11的死亡率不一致，是因為中間兩次更換飼料時造成了幼蟲驚擾，導致 實施例10和11的幼蟲死亡率增加。
[0090] 本發(fā)明得出的騙幅蛾幼蟲最佳飼養(yǎng)基質(zhì)條件為:①沙子:木屑：高原腐殖± = 5:2: 6;②水分含量為55 %-65 % ;③接入金針茹固體母種;④控制培養(yǎng)室相對濕度在70 %左右； ⑤溫度控制在20-23°C左右，培養(yǎng)10-14d備用。
[0091] 金針茹是一種常見的低溫型食用菌，屬于腐生菌，無光合作用能力，其生命活動所 需的營養(yǎng)物質(zhì)就只能由菌絲體從腐生基質(zhì)中獲得。菌絲生長時不需要光照，并且在完全黑 暗的條件下，菌絲仍能正常生長。金針茹為喜濕的茹類，耐旱能力強，菌絲體在含水量55- 65%的培養(yǎng)基中生長良好。金針茹菌絲在5-30°C的范圍內(nèi)均可生長，6°CW上時生長速度隨 溫度的升高而逐漸加快，菌絲生長最適溫度為20-25°C。金針茹菌絲在PH值為3-8的范圍內(nèi) 均可生長，菌絲生長的適宜PH值為4-7,且PH值為即寸菌絲生長速度最快。運些條件與騙幅蛾 幼蟲所需生長條件基本一致。騙幅蛾幼蟲的食物殘渣和糞便可W為金針茹菌絲生長提供所 需營養(yǎng)，因此本發(fā)明選擇金針茹作為微生物括抗劑。
[0092] 實施例13
[0093] -種中國被毛抱人工侵染騙幅蛾幼蟲的方法，包括W下步驟：
[0094] 1、子囊抱子彈射至培養(yǎng)皿中，加入無菌水，稀釋成菌液，菌液與飼養(yǎng)基質(zhì)混合得到 含菌飼養(yǎng)基質(zhì)，所述的菌液每毫升含1〇5個抱子，所述的飼養(yǎng)基質(zhì)為清水沙、木屑和高原腐 殖±的混合物，
[0095] 2、將騙幅蛾幼蟲放入到含菌飼養(yǎng)基質(zhì)的飼料盒中，飼料盒中含菌飼養(yǎng)基質(zhì)的厚度 為20mm，本實施例的飼養(yǎng)盒的長、寬、高為30cm*20cm*25cm，每盒投放50頭3-4齡幼蟲。
[0096] 3、用含菌飼料喂養(yǎng)騙幅蛾幼蟲，含菌飼料為含有中國被毛抱菌絲的飼料，如胡蘿 K上豆、野生珠芽廖等。
[0097] 本實施例僵蟲形成率為30%，僵蟲能萌發(fā)長出子座原基，僵蟲形成率50%。
[009引實施例14
[0099] 本實施例與實施例13基本相同，不同之處在于，在步驟1中，飼養(yǎng)基質(zhì)為重量比為 5: 2:6的清水沙、木屑和高原腐殖±的混合物，飼養(yǎng)基質(zhì)的含水量為55-65%。在混合前，高 原腐殖±60°C烘烤4h W上，清水沙180°C烘烤化W上，木屑經(jīng)12 rC高壓蒸汽滅菌30min W 上，所述的飼養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)接入金針茹固體母種并與飼養(yǎng)基質(zhì)攬拌均勻，在相對濕度為65- 75%，溫度為20-23°C的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)10-14d。
[0100] 含菌飼料的制作方法為:在無菌潔凈區(qū)內(nèi)，將冬蟲夏草子座部分伸入到預先培養(yǎng) 合格的平板中，冬蟲夏草子座的蟲體部分露在平板外部，蟲體部分用含有無菌水的無菌紗 布覆蓋包扎、保濕，蓋上皿蓋，使子囊抱子自然彈射至平板的培養(yǎng)基表面上，彈射時間不小 于7天，每天光照12h，光照強度為3(K)Lx，含有菌種的平板在程控霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)形成菌落， 培養(yǎng)溫度為15Γ，培養(yǎng)時間為50天，所述的菌落經(jīng)過2-3次純化培養(yǎng)，純化后的菌落放入到 液體培養(yǎng)基中，將液體培養(yǎng)基噴灑到飼料上形成含菌飼料。在本實施例中，含菌飼料為1- 2mm厚的環(huán)形胡蘿h片，飼養(yǎng)時間為60天，飼養(yǎng)期間不更換飼料。
[0101] 本實施例的平板采用實施例1的方法制備，本實施例的騙幅蛾幼蟲采用實施例8的 方法培養(yǎng)，本實施例所述的液體培養(yǎng)基可選用市售產(chǎn)品，也可選用實施例1的PDA培養(yǎng)基加 水稀釋10-30倍制成。
[0102] 本實施例采用子囊抱子混入±壤基質(zhì)與菌種混入飼料結(jié)合的侵染方式進行侵染， 3個月侵染率達到60%，12個月僵蟲形成率達到20%，實現(xiàn)了少量僵蟲子座原基的萌發(fā)。
[0103] 本文中所描述的具體實施例僅僅是對本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng) 域的技術(shù)人員可W對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替 代，但并不會偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種中國被毛孢人工侵染蝙蝠蛾幼蟲的方法，其特征在于，包括以下步驟： A、 子囊孢子彈射至培養(yǎng)皿中，加入無菌水，稀釋成菌液，菌液與飼養(yǎng)基質(zhì)混合得到含菌 飼養(yǎng)基質(zhì)， B、 將蝙蝠蛾幼蟲放入到含菌飼養(yǎng)基質(zhì)的飼料盒中， C、 用含菌飼料喂養(yǎng)蝙蝠蛾幼蟲。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國被毛孢人工侵染蝙蝠蛾幼蟲的方法，其特征在于，在步驟 A中，所述的菌液每毫升含105個孢子，所述的飼養(yǎng)基質(zhì)為清水沙、木肩和高原腐殖土的混合 物，在步驟B中，飼料盒中含菌飼養(yǎng)基質(zhì)的厚度為20mm。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的中國被毛孢人工侵染蝙蝠蛾幼蟲的方法，其特征在于，所述的 飼養(yǎng)基質(zhì)為重量比為5:2:6的清水沙、木肩和高原腐殖土的混合物，飼養(yǎng)基質(zhì)的含水量為 55-65% 〇4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的中國被毛孢人工侵染蝙蝠蛾幼蟲的方法，其特征在于，在混合 前，高原腐殖土60 °C烘烤4h以上，清水沙180 °C烘烤2h以上，木肩經(jīng)121 °C高壓蒸汽滅菌 30min以上。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的中國被毛孢人工侵染蝙蝠蛾幼蟲的方法，其特征在于，所述的 飼養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)接入金針菇固體母種并與飼養(yǎng)基質(zhì)攪拌均勻，在相對濕度為65-75%，溫度為 20-23°C的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)10-14d。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國被毛孢人工侵染蝙蝠蛾幼蟲的方法，其特征在于，所述的 含菌飼料為l_2mm厚的環(huán)形胡蘿卜片，飼養(yǎng)時間為60天，飼養(yǎng)期間不更換飼料。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的中國被毛孢人工侵染蝙蝠蛾幼蟲的方法，其特征在于，所 述的含菌飼料的制作方法為:在無菌潔凈區(qū)內(nèi)，將冬蟲夏草子座部分伸入到預先培養(yǎng)合格 的平板中，蓋上皿蓋，使子囊孢子自然彈射至平板的培養(yǎng)基表面上，含有菌種的平板在程 控霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)形成菌落，培養(yǎng)溫度為15°C，培養(yǎng)時間為50天，所述的菌落經(jīng)過2-3次純 化培養(yǎng)，純化后的菌落放入到液體培養(yǎng)基中，將液體培養(yǎng)基噴灑到飼料上形成含菌飼料。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的中國被毛孢人工侵染蝙蝠蛾幼蟲的方法，其特征在于，彈射時 間不小于7天，每天光照12 h，光照強度為300L X。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的中國被毛孢人工侵染蝙蝠蛾幼蟲的方法，其特征在于，冬蟲夏 草子座的蟲體部分露在平板外部，蟲體部分用含有無菌水的無菌紗布覆蓋包扎、保濕。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的中國被毛孢人工侵染蝙蝠蛾幼蟲的方法，其特征在于，所述 的平板的制備方法是：馬鈴薯去皮洗凈，稱取300g馬鈴薯，切成小塊狀，加水煮爛，過濾，加 入瓊脂和葡萄糖，繼續(xù)加熱，并攪拌混勻，冷卻，加入蠶蛹粉提取液、酵母粉提取液和玉米粉 提取液，再補加水定容至l〇〇〇mL，即為TOA培養(yǎng)基，分裝后滅菌，將滅過菌的PDA培養(yǎng)基在無 菌環(huán)境下倒入培養(yǎng)皿中，凝固后形成平板。
【文檔編號】C12R1/645GK106010977SQ201610353510
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月25日
【發(fā)明人】林海萍, 朱旭偉, 李南弈, 張昕, 李伶俐, 朱齊超
【申請人】浙江農(nóng)林大學