一種巨大芽孢桿菌制劑發(fā)酵的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種巨大芽孢桿菌制劑發(fā)酵的方法。其主要步驟為：先在水中加入玉米淀粉、豆粕粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉和氯化鈣，調(diào)整pH值后滅菌處理，在121～123℃溫度條件下滅菌處理，冷卻到35℃左右接入巨大芽孢桿菌種，發(fā)酵20小時(shí)，制得對(duì)數(shù)期巨大芽孢桿菌發(fā)酵液，然后將發(fā)酵液接入固體培養(yǎng)載體中，固體培養(yǎng)載體為玉米粉、豆粕粉、疏松劑、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鋅，混合均勻，調(diào)整含水量，置于固體發(fā)酵罐罐內(nèi)，通入無菌空氣，無菌保濕培養(yǎng)48～60小時(shí)，待顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有80％以上的芽孢脫落，終止發(fā)酵，然后向發(fā)酵罐通入60℃的蒸汽進(jìn)行低溫干燥，直至固體載體的含水量在5％以下，粉碎固體載體，粉碎粒度200目，制成芽孢桿菌產(chǎn)品，調(diào)配，達(dá)到每克產(chǎn)品含孢子≥100億。CGMCC No 125920041206
【專利說明】
一種巨大芽孢桿菌制劑發(fā)酵的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種巨大芽孢桿菌制劑發(fā)酵的方法，屬于微生物添加劑發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，微生物發(fā)酵制劑已廣泛應(yīng)用于飼料、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥保健和食品等各領(lǐng)域中。美國食品藥品管理局公布的飼用微生物菌種包括芽孢桿菌屬的有凝結(jié)芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌等五種。由于芽孢桿菌屬于細(xì)菌類，具有豐富、多功能酶活性，抗病、促長、抗逆性強(qiáng)，適宜加工與儲(chǔ)藏等優(yōu)點(diǎn)，是目前國內(nèi)外研究開發(fā)的重點(diǎn)，具有十分重要的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值和廣闊的市場前景。
[0003]目前芽孢桿菌多采用液體深層發(fā)酵技術(shù)。(郝林華等，2016，上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)24
[4]:380-394)，再經(jīng)噴霧干燥進(jìn)行生產(chǎn)，對(duì)設(shè)備要求高，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，能耗較大，產(chǎn)生污染物。而固體發(fā)酵采用的原料一般是廉價(jià)的草粉、麩皮等農(nóng)副產(chǎn)品，采用的設(shè)備也較液體發(fā)酵簡單，生產(chǎn)成本低于液體發(fā)酵。單純固體發(fā)酵存在發(fā)酵效率比較低。所以近年來各生產(chǎn)廠家都在積極探索芽孢桿菌的固體發(fā)酵技術(shù)，并有少數(shù)生產(chǎn)廠家開始試探性生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的:提供一種巨大芽孢桿菌制劑發(fā)酵的方法，具體為一種固液兩相深層發(fā)酵新工藝生產(chǎn)巨大芽孢桿菌制劑的方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0006]采用液固結(jié)合的工藝發(fā)酵生產(chǎn)巨大芽孢桿菌，本發(fā)明所培養(yǎng)菌種已在微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏(保藏登記號(hào)= CGMCC No 1259)，保藏日期:2004年12月6日，地址:北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，分類命名:巨大芽抱桿菌BaciIIus megaterium。
[0007]該技術(shù)方案主要包括以下步驟:
[0008](I)制備對(duì)數(shù)期巨大芽孢桿菌發(fā)酵液
[0009]先在水中加入玉米淀粉、豆柏粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉和氯化鈣，水與玉米淀粉、豆柏粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉和氯化鈣質(zhì)量比為100:4?6: 2?3:0.1?0.3:
0.2:0.3?0.5:0.2。調(diào)整pH值后滅菌處理，使用食堿調(diào)整pH為7.3?7.5滅菌處理在121?123°C溫度條件下滅菌處理30分鐘，冷卻到35°C左右接入巨大芽孢桿菌種，發(fā)酵20小時(shí)，制得對(duì)數(shù)期巨大芽孢桿菌發(fā)酵液。
[0010](2)制備固體固體培養(yǎng)基
[0011]稱取玉米粉、豆柏粉、疏松劑、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鋅，玉米粉、豆柏粉、疏松劑、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鋅的質(zhì)量比為100:2?3:50、0.1?0.3:0.2:0.2，混合均勻，調(diào)整含水量為80?85%，置于固體發(fā)酵罐罐內(nèi)，裝約40?80厘米高度。其中疏松劑由稻殼粉和玉米秸桿粉組成，稻殼粉:玉米秸桿粉質(zhì)量比1:1。
[0012](3)固體發(fā)酵及產(chǎn)品生產(chǎn)
[0013]將步驟(I)制備的對(duì)數(shù)期發(fā)酵液轉(zhuǎn)入步驟(2)制備的固體培養(yǎng)載體中，對(duì)數(shù)期發(fā)酵液加入量為10%，通入無菌空氣，無菌保濕培養(yǎng)48-60小時(shí)，待顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有80%以上的芽孢脫落，終止發(fā)酵。后發(fā)酵罐通入60 V的蒸汽進(jìn)行低溫干燥，直至固體載體的含水量在5%以下，粉碎固體載體，粉碎粒度200目，制成芽孢桿菌產(chǎn)品，調(diào)配，達(dá)到每克產(chǎn)品含孢子多100 億。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0015]本發(fā)明所述巨大芽孢桿菌制劑發(fā)酵的方法，不僅結(jié)合液體發(fā)酵和固體發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)，采用液、固兩相工藝，克服兩者主要缺點(diǎn)，而且并通過固體發(fā)酵配方優(yōu)化，提高芽孢桿菌生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)，本發(fā)明利于巨大芽孢桿菌實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，滿足市場需求。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。
[0017]實(shí)施例1
[0018](I)制備對(duì)數(shù)期巨大芽孢桿菌發(fā)酵液，在10kg純凈水中加入4?6kg玉米淀粉、2?3kg豆柏粉、0.1?0.3kg磷酸二氫鉀、0.2kg硫酸鎂、0.3?0.5kg氯化鈉和0.2kg氯化鈣，以食堿調(diào)整混合體的PH值為7.3?7.5，在121°C?123°C溫度環(huán)境下滅菌處理30分鐘，冷卻至35±1°C，接入中國微生物菌種保藏登記號(hào)為GMCC No 1259的巨大芽孢桿菌菌種，在32°C?34°(:溫度條件下發(fā)酵20小時(shí)，制得對(duì)數(shù)期的巨大芽孢桿菌發(fā)酵液。
[0019](2)制備固體培養(yǎng)基，稱取玉米粉、豆柏粉、疏松劑、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鋅，玉米粉、豆柏粉、疏松劑、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鋅的質(zhì)量比為100: 2?3: 50:0.1-0.3:
0.2:0.2，混合均勾，將10kg玉米粉與2?3kg豆柏粉、5?6kg稻殼粉、0.1?0.3kg磷酸氫二鉀、0.2kg硫酸鎂和0.2kg硫酸鋅，混合均勻，加入純凈水，調(diào)整含水量為80 %，置于固體發(fā)酵罐罐內(nèi)，裝約40?80厘米高度。其中疏松劑由稻殼粉和玉米秸桿粉組成，稻殼粉:玉米秸桿粉質(zhì)量比1:1。
[0020](3)將步驟(I)制備的對(duì)數(shù)期發(fā)酵液轉(zhuǎn)入步驟(2)制備的固體培養(yǎng)基中，每10kg固體培養(yǎng)基加入1kg對(duì)數(shù)期發(fā)酵液，通入無菌空氣，無菌保濕培養(yǎng)48-60小時(shí)，待顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有80%以上的芽孢脫落，終止發(fā)酵。后發(fā)酵罐通入60°C的蒸汽進(jìn)行低溫干燥，直至固體載體的含水量在5%以下，粉碎固體載體，粉碎粒度200目，制成芽孢桿菌產(chǎn)品，調(diào)配，達(dá)到每克產(chǎn)品含孢子多100億。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種巨大芽孢桿菌制劑發(fā)酵的方法，其特征在于，采用液固結(jié)合工藝發(fā)酵生產(chǎn)巨大芽孢桿菌，該方法包括以下步驟: (1)制備對(duì)數(shù)期巨大芽孢桿菌發(fā)酵液:先在水中加入玉米淀粉、豆柏粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉和氯化鈣，調(diào)整PH值為7.3?7.5后滅菌處理，冷卻到35°C左右接入巨大芽孢桿菌種，發(fā)酵，制得對(duì)數(shù)期巨大芽孢桿菌發(fā)酵液； (2)制備固體固體培養(yǎng)基:稱取玉米粉、豆柏粉、疏松劑(稻殼粉與玉米秸桿分按照質(zhì)量I: I混合)、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鋅，混合均勻，調(diào)整含水量為80?85 %，置于固體發(fā)酵罐罐內(nèi)，裝約40?80厘米高度； (3)固體發(fā)酵及產(chǎn)品生產(chǎn):將步驟(I)制備的對(duì)數(shù)期發(fā)酵液轉(zhuǎn)入步驟(2)制備的固體培養(yǎng)載體中，對(duì)數(shù)期發(fā)酵液加入量10 %，通入無菌空氣，無菌保濕培養(yǎng)48-60小時(shí)，待顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有80%以上的芽孢脫落時(shí)，終止發(fā)酵，通入60°C蒸汽低溫干燥，直至固體載體含水量5%以下，粉碎固體載體，制成芽孢桿菌產(chǎn)品，調(diào)配，達(dá)到每克產(chǎn)品含孢子多100億。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中水與玉米淀粉、豆柏粉、疏松劑、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉和氯化鈣質(zhì)量比為100:4?6:50:2?3:0.1?0.3:0.2:0.3?0.5:0.2o3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)中用食堿調(diào)整pH，滅菌處理在121?123°C溫度條件下滅菌處理30分鐘，發(fā)酵20小時(shí)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中玉米粉、豆柏粉、疏松劑、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鋅，玉米粉、豆柏粉、疏松劑、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鋅的質(zhì)量比為100: 2?3:50、0.1?0.3:0.2:0.2。且疏松劑由稻殼粉與玉米秸桿分按照質(zhì)量1:1混合而成。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中粉碎固體載體，粉碎粒度200目。
【文檔編號(hào)】C12R1/11GK106010995SQ201610013009
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年1月7日
【發(fā)明人】趙國琦, 戴怡, 張艷云, 霍永久, 余同水, 貢笑笑, 詹康
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué), 揚(yáng)州市瑞怡生物科技有限公司