一種植物乳桿菌及其培養(yǎng)分離方法、篩選方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物乳桿菌及其培養(yǎng)分離方法、篩選方法和應用，所述植物乳桿菌分類命名為：Lactobacillus plantarum，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC M 2016037，保藏日期為2016年1月14日。本發(fā)明提供的一種植物乳桿菌及其培養(yǎng)分離方法、篩選方法和應用，合理設計植物乳桿菌的培養(yǎng)分離方法和篩選方法，最終有效獲得在混合果蔬汁中產(chǎn)酸能力強、耐酸性高且生長速率快的優(yōu)質(zhì)植物乳桿菌，且本發(fā)明篩選得到的植物乳桿菌具有很寬的溫度適應性，在8℃至45℃范圍內(nèi)均能生長，本發(fā)明的植物乳桿菌能夠廣泛應用于酵素發(fā)酵和混合果蔬等乳酸菌發(fā)酵。CCTCC NO: M201603720160114
【專利說明】
-種植物乳桿菌及其培養(yǎng)分離方法、篩選方法和應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設及一種植物乳桿菌及其培養(yǎng)分離方法、篩選 方法和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物乳桿菌屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，，最適生長溫度為30~35°C，厭氧或兼性 厭氧，菌種為直或彎的桿狀，單個、有時成對或成鏈狀，最適抑為6.5左右，屬于同型發(fā)酵乳 酸菌。植物乳桿菌與人類的生活關(guān)系密切，是一種常見于奶油、肉類及許多蔬菜發(fā)酵制品中 的乳酸菌，能通過胃并定植于腸道發(fā)揮有益作用。它對腸道微生物有重要影響，無論在食品 發(fā)酵，還是在工業(yè)乳酸發(fā)酵W及醫(yī)療保健等領(lǐng)域，都有著廣泛的應用。
[0003] 目前我國擁有豐富的乳酸菌資源，可W篩選出發(fā)酵性能優(yōu)良的酸敏性菌株，繼而 生產(chǎn)出高質(zhì)量的酸敏性發(fā)酵劑，不但可W打破外國公司在該領(lǐng)域的壟斷，還可W發(fā)展具有 自主知識產(chǎn)權(quán)的商品發(fā)酵劑，降低生產(chǎn)成本，延長產(chǎn)品貨架期，具有良好的社會效益和經(jīng)濟 效益。例如申請?zhí)枮?00910033694.8的發(fā)明專利公開了一種酸敏性保加利亞乳桿菌菌株及 其用法，在對天然乳品發(fā)酵劑一西藏靈茹的研究中分離、篩選到1株酸敏性菌株L.B-FM-6， 經(jīng)鑒定為德±乳桿菌保加利亞亞種。對由該菌株與其它微生物菌株組合的發(fā)酵劑發(fā)酵的發(fā) 酵乳制品、發(fā)酵果汁、發(fā)酵蔬菜汁酸度的膽藏穩(wěn)定性研究，解決活性乳酸菌飲品保質(zhì)期短的 缺陷，顯示出由該菌株參與的發(fā)酵劑在發(fā)酵乳制品、活性乳酸菌果蔬汁方面的優(yōu)勢，開發(fā)成 商業(yè)化的食品發(fā)酵劑有較大的經(jīng)濟價值。
[0004] 由于乳桿菌在代謝過程中能分解糖類產(chǎn)生大量有機酸類，其中主要是乳酸，隨著 發(fā)酵進程繼續(xù)，乳酸含量逐漸增加，致使培養(yǎng)基的酸度升高，乳桿菌的繁殖便被抑制，所W 普通發(fā)酵的最高活菌數(shù)僅能達到107~108c化/ml。為了促進乳桿菌的生長繁殖，一般采用 化學中和法或緩沖鹽法調(diào)節(jié)和控制發(fā)酵液pH，保證乳桿菌生長繁殖必需的條件，可使活菌 數(shù)達109c化/ml左右。當需要較高產(chǎn)酸量時，往往較難實現(xiàn)，尤其是在批量生產(chǎn)中操作繁 雜，生產(chǎn)不便，工作量大，效率低下，針對性不強，難W在短時間內(nèi)獲得較高的酸量。
[0005] 由此可見，為了解決解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，迫切需要一種有效的植物乳桿菌篩 選方法和培育分離方法，W得到一種生長速率快、產(chǎn)酸量高并且耐酸性強的植物乳桿菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問題，提供一種植物乳桿菌及其培養(yǎng)分離方法、篩選方 法和應用，本發(fā)明針對植物乳桿菌的培養(yǎng)分離方法及篩選方法易操作且方法簡便，且使得 最終篩選的植物乳桿菌具有產(chǎn)酸量高且生長速率快的有點。
[0007] 為了達到上述技術(shù)效果，本發(fā)明包括W下技術(shù)方案：
[000引一種植物乳桿菌，所述植物乳桿菌分類命名為：Lactobacillus plantarum，保藏 于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、CCTCC，保藏編號為CCTCC Μ 2016037,保藏日期為2016年1月14 日。保藏地址，中國武漢，武漢大學。
[0009] 所述植物乳桿菌的16s DM序列見SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。
[0010] -種細菌素，所述細菌素由上述植物乳桿菌發(fā)酵制得。
[0011] -種上述植物乳桿菌的培養(yǎng)分離方法，包括W下步驟:取混合果蔬酵素自然發(fā)酵 中期和后期的發(fā)酵膠樣品，稀釋后吸取涂布至分離培養(yǎng)基平板，25~38Γ靜置培養(yǎng)，挑取菌 落大小為0.5~1.1mm，形態(tài)為圓形，顏色為乳白色的單菌落，轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基斜面，25~38°C 靜置培養(yǎng)得到植物乳桿菌。
[0012] 進一步的，所述的靜止培養(yǎng)的時間為2天。
[0013] 進一步的，所述的分離培養(yǎng)基平板上的分離培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基、寡營養(yǎng)培養(yǎng)基 和模擬環(huán)境培養(yǎng)基中的一種或兩種W上，
[0014] 所述常規(guī)培養(yǎng)基為西紅柿瓊脂培養(yǎng)基、西紅柿汁瓊脂培養(yǎng)基III、BCP培養(yǎng)基、牛肉 膏蛋白腺培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中的一種或兩種W上；
[0015] 所述寡營養(yǎng)培養(yǎng)基的制備方法包括W下步驟:分別稱取重量分數(shù)為1~5份的酵 母膏、2~10份的蛋白腺和20份瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)抑至7,定容1L，分裝后12rC滅 菌20分鐘；
[0016] 所述模擬環(huán)境培養(yǎng)基包括pH值為3~7的LB培養(yǎng)基，其制備方法包括W下步驟:分 別取酵母膏、蛋白腺和瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)pH至3~7,定容1L，分裝后12rC滅菌20 分鐘。
[0017] 進一步的，所述常規(guī)培養(yǎng)基的配制方法見中國科學院微生物研究所《菌種保藏手 冊》編著組Barnett J A所撰寫的文章內(nèi)容。
[0018] 所述寡營養(yǎng)培養(yǎng)基:將LB培養(yǎng)基的兩種營養(yǎng)成分(葡萄糖、蛋白腺)依次遞減20%， W提供寡營養(yǎng)的生長環(huán)境，分別包括LB培養(yǎng)基II至LB培養(yǎng)基V，具體制備方法和成分如下： [0019] LB培養(yǎng)基II(LB II):酵母膏4.Og，蛋白腺8.Og，瓊脂20.Og，加熱溶于適量水中，調(diào) 節(jié)抑至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0020] LB培養(yǎng)基III(LB III):酵母膏3.Og，蛋白腺6.Og，瓊脂20.Og，加熱溶于適量水中， 調(diào)節(jié)pH至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0021] LB培養(yǎng)基IWLB IV):酵母膏2. Og，蛋白腺4. Og，瓊脂20.0 g，加熱溶于適量水中，調(diào) 節(jié)抑至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0022] LB培養(yǎng)基V(LB V):酵母膏l(xiāng).Og，蛋白腺2.0g，瓊脂20.0g，加熱溶于適量水中，調(diào)節(jié) 抑至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0023] 模擬環(huán)境培養(yǎng)基（用于模擬環(huán)境培養(yǎng)）：設計調(diào)整LB培養(yǎng)基的抑從7至3依次遞減， 來模擬細菌生長的原始酸性環(huán)境條件，W配合不同種類細菌對環(huán)境、營養(yǎng)條件不同程度的 需要。分別包括LB培養(yǎng)基VI至LB培養(yǎng)基VIII，具體制備方法和成分如下：
[0024] LB培養(yǎng)基VKLB VI):酵母膏5. Og，蛋白腺10.0 g，瓊脂20.0 g，加熱溶于適量水中， 調(diào)節(jié)抑至6,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[00巧]LB培養(yǎng)基VII(LBVII):酵母膏5.Og，蛋白腺10.Og，瓊脂20.Og，加熱溶于適量水中， 調(diào)節(jié)pH至5,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[00%] LB培養(yǎng)基VIII(LBVIII):酵母膏5.Og，蛋白腺10.Og，瓊脂20.Og，加熱溶于適量水 中，調(diào)節(jié)抑至4,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0027] -種上述植物乳桿菌的篩選方法，包括W下步驟：
[0028] 步驟一:植物乳桿菌菌株的培養(yǎng)分離:取混合果蔬酵素自然發(fā)酵中期和后期的發(fā) 酵膠樣品，稀釋后吸取涂布至分離培養(yǎng)基平板，25~38Γ靜置培養(yǎng)，挑取菌落大小為0.5~ 1.1mm，形態(tài)為圓形，顏色為乳白色的單菌落，轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基斜面，25~38°C靜置培養(yǎng)保存?zhèn)?用；
[0029] 步驟二:植物乳桿菌菌體的制備:取步驟一得到的植物乳桿菌菌株于35~40°C靜 置培養(yǎng)后，取出細菌斜面菌種，用無菌水洗下菌苔，加入至滅菌離屯、管中，離屯、得到菌體沉 淀物，將菌體沉淀物洗涂后得到植物乳桿菌菌體；
[0030] 步驟植物乳桿菌序列分析:取步驟二制備的植物乳桿菌菌體進行DNA提取，W 提取的DNA為模板進行PCR擴增得到擴增產(chǎn)物，對擴增產(chǎn)物進行測序，得到植物乳桿菌菌株 的leSrDNA序列，由SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列組成，進行分析鑒定，篩選出同類的植物 乳桿菌菌株；
[0031] 步驟四：植物乳桿菌的篩選:將步驟Ξ得到的同類的植物乳桿菌菌株的單菌落分 別接種到MRS液體中靜止培養(yǎng)，得到菌液，將菌液接種至果蔬汁液體中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中 巧憶培養(yǎng)液的0D值、pH值和耐酸性，根據(jù)測定結(jié)果篩選植物乳桿菌。
[0032] 進一步的，所述的步驟一中，分離培養(yǎng)基平板上的分離培養(yǎng)基包括常規(guī)培養(yǎng)基、寡 營養(yǎng)培養(yǎng)基和模擬環(huán)境培養(yǎng)基中的一種或兩種W上，
[0033] 所述常規(guī)培養(yǎng)基為西紅柿瓊脂培養(yǎng)基、西紅柿汁瓊脂培養(yǎng)基III、BCP培養(yǎng)基、牛肉 膏蛋白腺培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中的一種或兩種W上；
[0034] 所述寡營養(yǎng)培養(yǎng)基的制備方法包括W下步驟:分別稱取重量分數(shù)為1~5份的酵母 膏、2~10份的蛋白腺和20份瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)抑至7,定容1L，分裝后12rC滅菌 20分鐘；
[0035] 所述模擬環(huán)境培養(yǎng)基包括抑值為3~7的LB培養(yǎng)基，其制備方法包括W下步驟:分 別取酵母膏、蛋白腺和瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)pH至3~7,定容1L，分裝后12rC滅菌20 分鐘。
[0036] 采用規(guī)培養(yǎng)基、寡營養(yǎng)培養(yǎng)基和模擬環(huán)境培養(yǎng)基共同培養(yǎng)，可有效并全面篩選本 發(fā)明植物乳桿菌。
[0037] 進一步的，所述步驟二中靜置培養(yǎng)的時間為2地，離屯、條件為1000化pm的速度離屯、 15,洗涂方法為用無菌水洗涂2次。
[0038] 進一步的，所述步驟Ξ中，W上游引物：
[0039] 5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' 和下游引物
[0040] 5 ' -AAGGAGGTGAACCAGCCGCA-3 '為特異性引物對提取的DNA為模板進行PCR擴增，所 述上游引物和下游引物的核巧酸序列分別見SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，PCR擴增反應條 件為:94 °C預變性4min后，94 °C變性30 s，55 °C退火30s，72 °C延伸Imin，2~4步循環(huán)30次，再 72°C 延長 lOmin。
[0041] 進一步的，所述步驟四中，所述菌液W3%的接種量轉(zhuǎn)接裝有l(wèi)OOmL果蔬汁液體的 150mL搖瓶中，37°C培養(yǎng)2地。
[0042] -種植物乳桿菌的應用，所述的植物乳桿菌用于發(fā)酵制備果蔬醋、糧食醋和果蔬 酵素。
[0043] 采用上述技術(shù)方案，包括W下有益效果:本發(fā)明提供的一種植物乳桿菌及其培養(yǎng) 分離方法、篩選方法和應用，合理設計植物乳桿菌的培養(yǎng)分離方法和篩選方法，最終有效獲 得在混合果蔬汁中產(chǎn)酸能力強、耐酸性高且生長速率快的優(yōu)質(zhì)植物乳桿菌，且本發(fā)明篩選 得到的植物乳桿菌具有很寬的溫度適應性，在8Γ和45Γ下均能生長，本發(fā)明的植物乳桿菌 能夠廣泛應用于酵素發(fā)酵和混合果蔬等乳酸菌發(fā)酵。避免了采用化學中和法或緩沖鹽法調(diào) 節(jié)和控制發(fā)酵液pH，保證乳酸菌生長繁殖必需的條件，來控制乳桿菌持續(xù)產(chǎn)生乳酸。
【附圖說明】
[0044] 圖1為本發(fā)明植物乳桿菌菌落圖；
[0045] 圖2為本發(fā)明植物乳桿菌100倍放大顯微圖；
[0046] 圖3為本發(fā)明實施例Ξ中不同植物乳桿菌菌株生長曲線圖；
[0047] 圖4為本發(fā)明實施例Ξ中不同植物乳桿菌菌株產(chǎn)酸能力圖。
【具體實施方式】
[0048] 下面通過具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細描述。
[0049] 實施例一：一種植物乳桿菌，所述植物乳桿菌分類命名為：Lactobaci 1 lus 口1曰111曰圳111，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、0：了0：，保藏編號為0：了0：1 2016037，保藏日 期為2016年1月14日。
[0050] -種細菌素，所述細菌素由上述植物乳桿菌發(fā)酵制得。
[0051] -種上述植物乳桿菌的應用，所述的植物乳桿菌用于發(fā)酵制備果蔬醋、糧食醋和 果蔬酵素。
[0052] 實施例一的植物乳桿菌菌株的形態(tài)特征：
[0053] 菌落形態(tài)特征描述:如圖1所示，菌落呈圓形，菌落直徑0.6~1mm，菌落凸起成近球 形，表面光滑，乳白色。有酸、麻的氣味。
[0化4] 個體形態(tài)特征：如圖2所示，圓端短桿菌，為0.43~0.92μηιΧ 0.56~1.63μηι，單個、 成對或短鏈狀。革蘭氏陽性，不生芽抱。
[0055] 實施例二:一種上述植物乳桿菌的培養(yǎng)分離方法，包括W下步驟:取混合果蔬酵素 自然發(fā)酵中期和后期的發(fā)酵膠樣品，稀釋后吸取涂布至分離培養(yǎng)基平板，25Γ靜置培養(yǎng)2 天，挑取菌落大小為0.5~1.1mm，形態(tài)為圓形，顏色為乳白色的單菌落，轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基斜面， 38Γ靜置培養(yǎng)2天得到植物乳桿菌。
[0056] 優(yōu)選地，所述的分離培養(yǎng)基平板上的分離培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基、寡營養(yǎng)培養(yǎng)基和 模擬環(huán)境培養(yǎng)基，
[0057] 所述常規(guī)培養(yǎng)基為西紅柿瓊脂培養(yǎng)基、西紅柿汁瓊脂培養(yǎng)基III、BCP培養(yǎng)基、牛肉 膏蛋白腺培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基；
[0058] 所述寡營養(yǎng)培養(yǎng)基的制備方法包括W下步驟:分別稱取重量分數(shù)為1~5份的酵母 膏、2~10份的蛋白腺和20份瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)抑至7,定容1L，分裝后12rC滅菌 20分鐘；
[0059] 所述模擬環(huán)境培養(yǎng)基包括pH值為3~7的LB培養(yǎng)基，其制備方法包括W下步驟:分 別取酵母膏、蛋白腺和瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)抑至3~7,定容1L，分裝后12rC滅菌20 分鐘。
[0060] -種上述植物乳桿菌的篩選方法，包括W下步驟：
[0061 ]步驟一:植物乳桿菌菌株的培養(yǎng)分離:取混合果蔬酵素自然發(fā)酵中期和后期的發(fā) 酵膠樣品，稀釋后吸取涂布至分離培養(yǎng)基平板，25Γ靜置培養(yǎng)，挑取菌落大小為0.5~ 1.1mm，形態(tài)為圓形，顏色為乳白色的單菌落，轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基斜面，38Γ靜置培養(yǎng)保存?zhèn)溆茫?br>[0062] 步驟二:植物乳桿菌菌體的制備：取步驟一得到的植物乳桿菌菌株于35Γ靜置培 養(yǎng)的細菌斜面菌種，用無菌水洗下菌苔，加入至滅菌離屯、管中，離屯、得到菌體沉淀物，將菌 體沉淀物洗涂后得到植物乳桿菌菌體；
[0063] 步驟植物乳桿菌序列分析:取步驟二制備的植物乳桿菌菌體進行DNA提取，W 提取的DNA為模板進行PCR擴增得到擴增產(chǎn)物，對擴增產(chǎn)物進行測序，得到植物乳桿菌菌株 的leSrDNA序列，由SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列組成，進行分析鑒定，篩選出同類的植物 乳桿菌菌株；
[0064] 步驟四：植物乳桿菌的篩選:將步驟Ξ得到的同類的植物乳桿菌菌株的單菌落分 別接種到MRS液體中靜止培養(yǎng)，得到菌液，將菌液接種至果蔬汁液體中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中 巧憶培養(yǎng)液的0D值、pH值和耐酸性，根據(jù)測定結(jié)果篩選植物乳桿菌。
[0065] 優(yōu)選地，所述步驟二中靜置培養(yǎng)的時間為24h，離屯、條件為100(K)rpm的速度離屯、 15,洗涂方法為用無菌水洗涂2次。
[0066] 優(yōu)選地，所述步驟Ξ中，
[0067] W 上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和下游引物5'- AAGGAGGTGAACCAGCCGCA-3 '為特異性引物對提取的DNA為模板進行PCR擴增，所述上游引物 和下游引物的核巧酸序列分別見SEQ ID N02和SEQ ID N0.3，PCR擴增反應條件為:94°C預 變性4min后，94°C變性3〇8,55°(：退火3〇3,72°(：延伸1111111，2~4步循環(huán)30次，再72°(：延長 lOmin;所述步驟四中，所述菌液W3%的接種量轉(zhuǎn)接裝有l(wèi)OOmL果蔬汁液體的150mL搖瓶中， 37°C培養(yǎng)2地。
[0068] 優(yōu)選地，所述的分離培養(yǎng)基平板上的分離培養(yǎng)基包括常規(guī)培養(yǎng)基、寡營養(yǎng)培養(yǎng)基 和模擬環(huán)境培養(yǎng)基，
[0069] 所述常規(guī)培養(yǎng)基為西紅柿瓊脂培養(yǎng)基、西紅柿汁瓊脂培養(yǎng)基III、BCP培養(yǎng)基、牛肉 膏蛋白腺培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基；
[0070] 所述寡營養(yǎng)培養(yǎng)基的制備方法包括W下步驟:分別稱取重量分數(shù)為1~5份的酵母 膏、2~10份的蛋白腺和20份瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)抑至7,定容1L，分裝后12rc滅菌 20分鐘。
[0071] 所述模擬環(huán)境培養(yǎng)基包括pH值為3~7的LB培養(yǎng)基，其制備方法包括W下步驟:分 別取酵母膏、蛋白腺和瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)pH至3~7,定容1L，分裝后12rC滅菌20 分鐘。
[0072] 所述寡營養(yǎng)培養(yǎng)基分別包括LB培養(yǎng)基II至LB培養(yǎng)基V，具體制備方法和成分如下：
[0073] LB培養(yǎng)基IKLB II):酵母膏4.Og，蛋白腺8.Og，瓊脂20.Og，加熱溶于適量水中，調(diào) 節(jié)抑至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0074] LB培養(yǎng)基III(LB III):酵母膏3.Og，蛋白腺6.Og，瓊脂20.Og，加熱溶于適量水中， 調(diào)節(jié)pH至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0075] LB培養(yǎng)基IWLB IV):酵母膏2. Og，蛋白腺4. Og，瓊脂20.0 g，加熱溶于適量水中，調(diào) 節(jié)抑至7,定容至IL。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0076] LB培養(yǎng)基V(LB V):酵母膏l(xiāng).Og，蛋白腺2.0g，瓊脂20.0g，加熱溶于適量水中，調(diào)節(jié) 抑至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0077] 所述模擬環(huán)境培養(yǎng)基分別包括LB培養(yǎng)基VI至LB培養(yǎng)基VIII，具體制備方法和成分 如下：
[007引 LB培養(yǎng)基VKLB VI):酵母膏5. Og，蛋白腺10.0 g，瓊脂20.0 g，加熱溶于適量水中， 調(diào)節(jié)抑至6,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0079] LB培養(yǎng)基VII (LBVII):酵母膏5 . Og，蛋白腺10.0 g，瓊脂20 . Og，加熱溶于適量水 中，調(diào)節(jié)抑至5,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0080] LB培養(yǎng)基VIIKLBVIII):酵母膏5.Og，蛋白腺10.Og，瓊脂20.Og，加熱溶于適量水 中，調(diào)節(jié)抑至4,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0081] 實施例Ξ: -種上述植物乳桿菌的培養(yǎng)分離方法，包括W下步驟:取混合果蔬酵素 自然發(fā)酵中期和后期的發(fā)酵膠樣品，稀釋后吸取涂布至分離培養(yǎng)基平板，25Γ靜置培養(yǎng)2 天，挑取菌落大小為0.5~1.1mm，形態(tài)為圓形，顏色為乳白色的單菌落，轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基斜面， 38Γ靜置培養(yǎng)2天得到植物乳桿菌。
[0082] 優(yōu)選地，所述的分離培養(yǎng)基平板上的分離培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基、寡營養(yǎng)培養(yǎng)基和 模擬環(huán)境培養(yǎng)基中的一種，
[0083] 所述常規(guī)培養(yǎng)基為西紅柿瓊脂培養(yǎng)基、西紅柿汁瓊脂培養(yǎng)基III、BCP培養(yǎng)基和牛 肉膏蛋白腺培養(yǎng)基中的一種；
[0084] 所述寡營養(yǎng)培養(yǎng)基的制備方法包括W下步驟:分別稱取重量分數(shù)為1~5份的酵母 膏、2~10份的蛋白腺和20份瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)抑至7,定容1L，分裝后12rC滅菌 20分鐘；
[0085] 所述模擬環(huán)境培養(yǎng)基包括pH值為3~7的LB培養(yǎng)基，其制備方法包括W下步驟:分 別取酵母膏、蛋白腺和瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)pH至3~7,定容1L，分裝后12rC滅菌20 分鐘。
[0086] -種上述植物乳桿菌的篩選方法，包括W下步驟：
[0087] 步驟一:植物乳桿菌菌株的培養(yǎng)分離:取混合果蔬酵素自然發(fā)酵中期和后期的發(fā) 酵膠樣品，稀釋后吸取涂布至分離培養(yǎng)基平板，38Γ靜置培養(yǎng)，挑取菌落大小為0.5~ 1.1mm，形態(tài)為圓形，顏色為乳白色的單菌落，轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基斜面，25Γ靜置培養(yǎng)保存?zhèn)溆茫?br>[0088] 步驟二:植物乳桿菌菌體的制備：取步驟一得到的植物乳桿菌菌株于4(TC靜置培 養(yǎng)的細菌斜面菌種，用無菌水洗下菌苔，加入至滅菌離屯、管中，離屯、得到菌體沉淀物，將菌 體沉淀物洗涂后得到植物乳桿菌菌體；
[0089] 步驟植物乳桿菌序列分析:取步驟二制備的植物乳桿菌菌體進行DNA提取，W 提取的DNA為模板進行PCR擴增得到擴增產(chǎn)物，對擴增產(chǎn)物進行測序，得到植物乳桿菌菌株 的leSrDNA序列，由SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列組成，進行分析鑒定，篩選出同類的植物 乳桿菌菌株；
[0090] 步驟四：植物乳桿菌的篩選:將步驟Ξ得到的同類的植物乳桿菌菌株的單菌落分 別接種到MRS液體中靜止培養(yǎng)，得到菌液，將菌液接種至果蔬汁液體中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中 巧憶培養(yǎng)液的0D值、pH值和耐酸性，根據(jù)測定結(jié)果篩選植物乳桿菌。
[0091] 優(yōu)選地，所述步驟二中靜置培養(yǎng)的時間為24h，離屯、條件為100(K)rpm的速度離屯、 15,洗涂方法為用無菌水洗涂2次。
[0092] 優(yōu)選地，所述步驟Ξ中，
[0093] W 上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和下游引物5'- AAGGAGGTGAACCAGCCGCA-3 '為特異性引物對提取的DNA為模板進行PCR擴增，所述上游引物 和下游引物的核巧酸序列分別見SEQ ID N02和SEQ ID N0.3，PCR擴增反應條件為:94°C預 變性4min后，94°C變性3〇8,55°(：退火3〇3,72°(：延伸1111111，2~4步循環(huán)30次，再72°(：延長 lOmin;所述步驟四中，所述菌液W3%的接種量轉(zhuǎn)接裝有l(wèi)OOmL果蔬汁液體的150mL搖瓶中， 37°C培養(yǎng)2地。
[0094] 優(yōu)選地，所述的分離培養(yǎng)基平板上的分離培養(yǎng)基包括常規(guī)培養(yǎng)基、寡營養(yǎng)培養(yǎng)基 和模擬環(huán)境培養(yǎng)基中的一種，
[00M]所述常規(guī)培養(yǎng)基為西紅柿瓊脂培養(yǎng)基、西紅柿汁瓊脂培養(yǎng)基III、BCP培養(yǎng)基和牛 肉膏蛋白腺培養(yǎng)基中的一種；
[0096] 所述寡營養(yǎng)培養(yǎng)基的制備方法包括W下步驟:分別稱取重量分數(shù)為1~5份的酵母 膏、2~10份的蛋白腺和20份瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)抑至7,定容1L，分裝后12rC滅菌 20分鐘。
[0097] 所述模擬環(huán)境培養(yǎng)基包括pH值為3~7的LB培養(yǎng)基，其制備方法包括W下步驟:分 別取酵母膏、蛋白腺和瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)pH至3~7,定容1L，分裝后12rC滅菌20 分鐘。
[0098] 所述寡營養(yǎng)培養(yǎng)基分別包括LB培養(yǎng)基II至LB培養(yǎng)基V，具體制備方法和成分如下：
[0099] LB培養(yǎng)基IKLB II):酵母膏4.Og，蛋白腺8.Og，瓊脂20.Og，加熱溶于適量水中，調(diào) 節(jié)抑至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0100] LB培養(yǎng)基m(LB III):酵母膏3.0g，蛋白腺6.0g，瓊脂20.0g，加熱溶于適量水中， 調(diào)節(jié)pH至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0101] LB培養(yǎng)基IWLB IV):酵母膏2. Og，蛋白腺4. Og，瓊脂20.0 g，加熱溶于適量水中，調(diào) 節(jié)抑至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0102] LB培養(yǎng)基V(LB V):酵母膏l(xiāng).Og，蛋白腺2.0g，瓊脂20.0g，加熱溶于適量水中，調(diào)節(jié) 抑至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0103] 所述模擬環(huán)境培養(yǎng)基分別包括LB培養(yǎng)基VI至LB培養(yǎng)基VIII，具體制備方法和成分 如下：
[0104] LB培養(yǎng)基VKLB VI):酵母膏5. Og，蛋白腺10.0 g，瓊脂20.0 g，加熱溶于適量水中， 調(diào)節(jié)抑至6,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0105] LB培養(yǎng)基VII (LB VII):酵母膏5. Og，蛋白腺10 . Og，瓊脂20 . Og，加熱溶于適量水 中，調(diào)節(jié)抑至5,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0106] LB培養(yǎng)基VIII(LB VIII):酵母膏5.Og，蛋白腺10.Og，瓊脂20.Og，加熱溶于適量水 中，調(diào)節(jié)抑至4,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0107] 實施例四：一種植物乳桿菌的培養(yǎng)分離方法，包括W下步驟:取混合果蔬酵素自然 發(fā)酵中、后3個時期（即發(fā)酵第45、90天）的發(fā)酵膠樣品lOg，放入盛有90mL無菌水的Ξ角瓶 中，振蕩5分鐘，充分搖勻，稀釋至合適濃度，吸取10化1涂布分離培養(yǎng)基平板，28±rC靜置 培養(yǎng)2d，根據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色等表型特征挑取單菌落，轉(zhuǎn)接相應培養(yǎng)基斜面，28 ± rC 靜置培養(yǎng)2d，編號保存?zhèn)溆谩?br>[0108] 將涂布后的平板置于37±rC靜置培養(yǎng)2d，待培養(yǎng)基表面長出單個菌落，其中根據(jù) 菌落大小、形態(tài)和顏色、透明圈等表型特征挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到相應培養(yǎng)基斜面，37±rC 靜置培養(yǎng)2d。
[0109] -種植物乳桿菌的篩選方法，包括W下步驟：
[0110] 步驟一:植物乳桿菌菌株的培養(yǎng)分離:取混合果蔬酵素自然發(fā)酵中、后3個時期（即 發(fā)酵第45、90天）的發(fā)酵膠樣品lOg，放入盛有90mL無菌水的Ξ角瓶中，振蕩5分鐘，充分搖 勻，稀釋至合適濃度，吸取1〇化1涂布分離培養(yǎng)基平板，28 ± rC靜置培養(yǎng)2d，根據(jù)菌落大小、 形態(tài)和顏色等表型特征挑取單菌落，轉(zhuǎn)接相應培養(yǎng)基斜面，28 ± rC靜置培養(yǎng)2d，編號保存 備用。
[0111] 將涂布后的平板置于37±rC靜置培養(yǎng)2d，待培養(yǎng)基表面長出單個菌落，其中根據(jù) 菌落大小、形態(tài)和顏色、透明圈等表型特征挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到相應培養(yǎng)基斜面，37±rC靜 置培養(yǎng)2d。
[0112] 步驟二:植物乳桿菌菌體的制備:將于37±rC靜置培養(yǎng)24h左右的細菌斜面菌種， 用無菌水洗下菌苔，加入到滅菌離屯、管中，Wl〇〇(K)rpm的速度離屯、15s，將菌體沉淀物再用 無菌水洗涂2次后，備用。
[0113] 步驟植物乳桿菌序列分析:取步驟二制備的植物乳桿菌菌體進行DNA提取，DNA 提取按照試劑盒標準抽提步驟進行，W上游引物：5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '和下游引 物5 ' -AAGGAGGTGAACCAGCCGCA-3 '為特異性引物對提取的DNA為模板進行PCR擴增，在PCR反 應管中加入DNA模版化l，2XMix 1：3μ1，10μΜ BSF8/20 化Ι,ΙΟμΜ BSR1541/20 化l，d地20 9 μ1，混勻后進行PCR反應。PCR擴增反應條件為:94°C預變性4min后，94°C變性30s，55°C退火 30s，72°C延伸lmin，2-4步循環(huán)30次，再72°C延長lOmin，得到擴增產(chǎn)物，對擴增產(chǎn)物進行測 序，DNA測序采用雙脫氧終止法，采用ClustalW2.1對分離菌株的leSrDNA序列進行多序列比 對分析，將完全一致的序列所代表的菌株歸為一類。然后利用BLASTN2.2.29+程序捜索核算 數(shù)據(jù)庫，下載得分高、序列一致性達到95%W上的序列，采用ClustalW2.1進行多序列比對 分析，用MEGA6.06軟件采用N-J法重建系統(tǒng)發(fā)育樹。數(shù)據(jù)分析采用最大組合似然模型 (Maximum Composite Likelihood),采取 1000次bootstrap檢驗(Xarkin MA，2007;Tamura 1(，2013;2}16112}1日雌，2000;41643日11化]\1〇巧11113,2008)。采用常規(guī)培養(yǎng)基、寡營養(yǎng)培養(yǎng)基^ 及模擬環(huán)境培養(yǎng)基從自然發(fā)酵果蔬酵素中共分離到細菌9株乳酸菌菌株，編號為LP4、LP18、 1口16、1^^3、1^^3、1^^、1^^5、1^^2、1^^2。經(jīng)形態(tài)學、生理生化實驗^及分子生物學165抽魁序 列鑒定運9個菌株均為Lactobacillus plantar皿(植物乳桿菌）。
[0114] 步驟四：植物乳桿菌的篩選:將篩選得到的LP4、LP18、LP16、LP3、LP13、LP8、LP15、 LP12、LP2 9株植物乳桿菌單菌落分別接種到裝有l(wèi)OOmL MRS液體培養(yǎng)的150mL搖瓶中，37°C 靜止培養(yǎng)20h，分別制得菌液。
[0115] 所述常規(guī)培養(yǎng)基為西紅柿瓊脂培養(yǎng)基、西紅柿汁瓊脂培養(yǎng)基III、BCP培養(yǎng)基和牛 肉膏蛋白腺培養(yǎng)基；
[0116] 所述寡營養(yǎng)培養(yǎng)基的制備方法包括W下步驟:分別稱取重量分數(shù)為1~5份的酵母 膏、2~10份的蛋白腺和20份瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)抑至7,定容1L，分裝后12rC滅菌 20分鐘。
[0117] 所述模擬環(huán)境培養(yǎng)基包括pH值為3~7的LB培養(yǎng)基，其制備方法包括W下步驟:分 別取酵母膏、蛋白腺和瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)pH至3~7,定容1L，分裝后12rC滅菌20 分鐘。
[0118] 所述寡營養(yǎng)培養(yǎng)基分別包括LB培養(yǎng)基II至LB培養(yǎng)基V，具體制備方法和成分如下：
[0119] LB培養(yǎng)基IKLB II):酵母膏4.Og，蛋白腺8.Og，瓊脂20.Og，加熱溶于適量水中，調(diào) 節(jié)抑至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0120] LB培養(yǎng)基III(LB III):酵母膏3.Og，蛋白腺6.Og，瓊脂20.Og，加熱溶于適量水中， 調(diào)節(jié)pH至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0121] LB培養(yǎng)基IWLB IV):酵母膏2. Og，蛋白腺4. Og，瓊脂20.0 g，加熱溶于適量水中，調(diào) 節(jié)抑至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0122] LB培養(yǎng)基V(LB V):酵母膏l(xiāng).Og，蛋白腺2.0g，瓊脂20.0g，加熱溶于適量水中，調(diào)節(jié) 抑至7,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0123] 所述模擬環(huán)境培養(yǎng)基分別包括LB培養(yǎng)基VI至LB培養(yǎng)基VIII，具體制備方法和成分 如下：
[0124] LB培養(yǎng)基VKLB VI):酵母膏5. Og，蛋白腺10.0 g，瓊脂20.0 g，加熱溶于適量水中， 調(diào)節(jié)抑至6,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[01巧]LB培養(yǎng)基VII (LB VII):酵母膏5. Og，蛋白腺10 . Og，瓊脂20 . Og，加熱溶于適量水 中，調(diào)節(jié)抑至5,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[01 %] LB培養(yǎng)基VIII(LB VIII):酵母膏5.Og，蛋白腺10.Og，瓊脂20.Og，加熱溶于適量水 中，調(diào)節(jié)抑至4,定容至1L。分裝后121°C滅菌20分鐘。
[0127] 生長特性試驗:將制得的菌株 1^^、1^^8、1口16、1^^3、1^^3、1口8、1口15、1^^2、1口2菌液 按3 %的接種量轉(zhuǎn)接裝有l(wèi)OOmL混合果蔬汁液體培養(yǎng)的150mL搖瓶中，37 °C，培養(yǎng)時間為2地。 在培養(yǎng)的過程中每間隔化取1次培養(yǎng)液測定0D值。
[0128] 產(chǎn)酸試驗:將篩選得到的LP4、LP18、LP16、LP3、LP13、LP8、LP15、LP12、LP2 9株植物 乳桿菌單菌落分別接種到裝有l(wèi)OOmL混合果蔬汁液體培養(yǎng)的150mL搖瓶中，37Γ靜止培養(yǎng) 20h，分別制得菌液。將制得的菌株LP4、LP18、LP16、LP3、LP13、LP8、LP15、LP12、LP2菌液按 3%的接種量轉(zhuǎn)接裝有10〇1^135液體培養(yǎng)的15〇1^搖瓶中，37°(：，培養(yǎng)時間為48}1。在培養(yǎng)的 過程中每間隔化取1次培養(yǎng)液進行抑的測定，培養(yǎng)液pH采用P的十在20°C條件下測定。
[01 巧]耐酸試驗:將篩選得到的LP4、LP18、LP16、LP3、LP13、LP8、LP15、LP12、LP2 9株植物 乳桿菌單菌落分別接種到裝有l(wèi)OOmL MRS液體培養(yǎng)的150mL搖瓶中，37°C靜止培養(yǎng)20h，分別 制得菌液。
[0130] 在抑7.4的PBS緩沖液基礎(chǔ)上用鹽酸調(diào)整抑至2.5,每150mL搖瓶中裝140mL，12rC， 高壓滅菌 20min，冷卻。然后按 6%(V/V)的量將 LP4、LP18、LP16、LP3、LP13、LP8、LP15、LP12、 LP29株植物乳桿菌菌液轉(zhuǎn)入已滅菌的裝有pH2.5的PBS緩沖液中，37°C厭氧，分別作用化、 化、化、1化、1化、2化測定活菌數(shù)。
[0131] 實施例四步驟四植物乳桿菌篩選的實驗結(jié)果：
[0132] 按照實施例四所述的篩選方法，得到生長特性試驗結(jié)果見圖3,圖3中菌株LP15在 混合果蔬汁中能快速適應，并且迅速生長，生長速率顯著快于其它菌株。
[0133] 得到耐酸試驗結(jié)果見圖4,圖4中表明菌株LP15在混合果蔬汁中能快速合成乳酸， 并且產(chǎn)酸量顯著大于其它菌株。
[0134] 得到耐酸試驗結(jié)果見表1，表1中表明LP15的耐酸性最強，在抑=2.5的緩沖液中處 理20h仍還有82%的菌體存活見表1，而其它幾個菌株的存活率僅有一半。因此最終篩選出 LP15的植物乳桿菌。
[0135] 表1植物乳桿菌菌株在pH2.5不同時間處理的存活率
[0136]
[0137] 菌株號為LP15的植物乳桿菌為本專利所保護的植物乳桿菌，其16s DNA序列見SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列。
[0138] 篩選的LP15菌株發(fā)酵特性分析與種類的鑒定：
[0139] 將篩選到的LP15菌株進行糖發(fā)酵試驗，其結(jié)果見表2,能發(fā)酵葡萄糖但不產(chǎn)生氣 體，屬同型乳酸發(fā)酵類型，細胞壁中不含有二氨基庚二酸(meso-DAP)，產(chǎn)生化-乳酸。均分解 核糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、薦糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖等產(chǎn)酸，不利用纖維二 糖、松Ξ糖、菊粉、肌醇、屯葉巧、扁桃巧。根據(jù)伯杰氏手冊(第八版)將LP15菌株鑒定為植物 乳桿菌。溫度生長試驗發(fā)現(xiàn)，LP15菌株在8°C和45°C下均能生長，該菌株對溫度具有很好的 適應性。
[0140] 表2糖發(fā)酵試驗
[0141]

[0142] 篩選的LP15菌株16s rDNA分子鑒定：
[0143] 通過PCR擴征獲得LP15菌株16s rDNA分子序列，全長1417bp。通過Blast分析，與其 它植物乳桿菌化actobacillus planta;rum)16s rDNA分子序列的相似性達到100%和 99%。聯(lián)合形態(tài)學特征，生理生化特征W及16s rDNA分子特征將LP1 5菌株鑒定為 Lactobacillus plantarum。W上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā) 明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可W有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則 之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種植物乳桿菌，其特征在于，所述植物乳桿菌分類命名為：Lactobaci 1 lus ?1&1^&^1111，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心0^0：，保藏編號為0^0：1 2016037，保藏日 期為2016年1月14日。2. -種細菌素，其特征在于，所述細菌素由權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌發(fā)酵制得。3. -種權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌的培養(yǎng)分離方法，其特征在于，包括以下步驟:取 混合果蔬酵素自然發(fā)酵中期和后期的發(fā)酵醪樣品，稀釋后吸取涂布至分離培養(yǎng)基平板，25 ~38°C靜置培養(yǎng)，挑取菌落大小為0.5~1.1mm，形態(tài)為圓形，顏色為乳白色的單菌落，轉(zhuǎn)接 至培養(yǎng)基斜面，25~38 °C靜置培養(yǎng)得到植物乳桿菌。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的種植物乳桿菌的培養(yǎng)分離方法，其特征在于，所述的靜止培養(yǎng) 的時間為2天。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種植物乳桿菌的培養(yǎng)分離方法，其特征在于，所述的分離培 養(yǎng)基平板上的分離培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基、寡營養(yǎng)培養(yǎng)基和模擬環(huán)境培養(yǎng)基中的一種或兩種 以上； 所述常規(guī)培養(yǎng)基為西紅柿瓊脂培養(yǎng)基、西紅柿汁瓊脂培養(yǎng)基ΠI、BCP培養(yǎng)基、牛肉膏蛋 白胨培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中的一種或兩種以上； 所述寡營養(yǎng)培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟:分別稱取重量分數(shù)為1~5份的酵母膏、2 ~10份的蛋白胨和20份瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)pH至7，定容1L，分裝后121°C滅菌20分 鐘； 所述模擬環(huán)境培養(yǎng)基包括pH值為3~7的LB培養(yǎng)基，其制備方法包括以下步驟:分別取 酵母膏、蛋白胨和瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)pH至3~7,定容1L，分裝后121°C滅菌20分鐘。6. -種權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟一:植物乳桿菌菌株的培養(yǎng)分離:取混合果蔬酵素自然發(fā)酵中期和后期的發(fā)酵醪 樣品，稀釋后吸取涂布至分離培養(yǎng)基平板，25~38°C靜置培養(yǎng)，挑取菌落大小為0.5~ 1.1mm，形態(tài)為圓形，顏色為乳白色的單菌落，轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基斜面，25~38°C靜置培養(yǎng)保存?zhèn)?用； 步驟二:植物乳桿菌菌體的制備：取步驟一得到的植物乳桿菌菌株于35~40°C靜置培 養(yǎng)后，取出細菌斜面菌種，用無菌水洗下菌苔，加入至滅菌離心管中，離心得到菌體沉淀物， 將菌體沉淀物洗滌后得到植物乳桿菌菌體； 步驟三:植物乳桿菌序列分析:取步驟二制備的植物乳桿菌菌體進行DNA提取，以提取 的DNA為模板進行PCR擴增得到擴增產(chǎn)物，對擴增產(chǎn)物進行測序，得到植物乳桿菌菌株的 16SrDNA序列，進行分析鑒定，篩選出同類的植物乳桿菌菌株； 步驟四：植物乳桿菌的篩選:將步驟三得到的同類的植物乳桿菌菌株的單菌落分別接 種到MRS液體中靜止培養(yǎng)，得到菌液，將菌液接種至果蔬汁液體中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中測定 培養(yǎng)液的0D值、pH值和耐酸性，根據(jù)測定結(jié)果篩選植物乳桿菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種植物乳桿菌的篩選方法，其特征在于，所述步驟二中靜置 培養(yǎng)的時間為24h，離心條件為lOOOOrpm的速度離心15,洗滌方法為用無菌水洗滌2次。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種植物乳桿菌的篩選方法，其特征在于，所述步驟三中， 以上游引物：5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' 和下游引物5 ' -AAGGAGGTGAACCAGCCGCA-3 ' 為特異性引物對提取的DNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增反應條件為:94°C預變性4min后， 94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，2~4步循環(huán)30次，再72°C延長lOmin; 所述步驟四中，所述菌液以3%的接種量轉(zhuǎn)接裝有100mL果蔬汁液體的150mL搖瓶中，37 。(:培養(yǎng) 24h。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種植物乳桿菌的篩選方法，其特征在于，所述的分離培養(yǎng)基 平板上的分離培養(yǎng)基包括常規(guī)培養(yǎng)基、寡營養(yǎng)培養(yǎng)基和模擬環(huán)境培養(yǎng)基中的一種或兩種以 上， 所述常規(guī)培養(yǎng)基為西紅柿瓊脂培養(yǎng)基、西紅柿汁瓊脂培養(yǎng)基ΠI、BCP培養(yǎng)基、牛肉膏蛋 白胨培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中的一種或兩種以上； 所述寡營養(yǎng)培養(yǎng)基的制備方法包括以下步驟:分別稱取重量分數(shù)為1~5份的酵母膏、2 ~10份的蛋白胨和20份瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)pH至7，定容1L，分裝后121°C滅菌20分 鐘； 所述模擬環(huán)境培養(yǎng)基包括pH值為3~7的LB培養(yǎng)基，其制備方法包括以下步驟:分別取 酵母膏、蛋白胨和瓊脂，加熱溶解于水中，調(diào)節(jié)pH至3~7,定容1L，分裝后121°C滅菌20分鐘。10. -種權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌的應用，其特征在于，所述的植物乳桿菌用于發(fā) 酵制備果蔬醋、糧食醋和果蔬酵素。
【文檔編號】C12Q1/04GK106010997SQ201610278215
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】周禮紅, 潘肇儀
【申請人】周禮紅