一種酮古龍酸桿菌工程菌株及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種酮古龍酸桿菌工程菌株及其制備方法和應(yīng)用。該酮古龍酸桿菌工程菌株包括氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵基因；氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵基因?yàn)樘K氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因、脯氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因或組氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因。本發(fā)明通過在菌種體內(nèi)構(gòu)建氨基酸合成路徑中缺失基因，促使酮古龍酸桿菌工程菌株單獨(dú)發(fā)酵時更好的將山梨糖轉(zhuǎn)化為酮古龍酸；將酮古龍酸桿菌工程菌株和內(nèi)生芽孢桿菌混菌發(fā)酵時，減少發(fā)酵周期，相比原始菌株，周期縮短10h左右，節(jié)約時間成本；在產(chǎn)率方面，相比原始菌提高20％左右；同時混菌發(fā)酵時可以更少的依賴伴生菌的作用，從而減少伴生菌即芽孢桿菌的用量，減少成本和污染。
【專利說明】
-種酬古龍酸桿菌工程菌株及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種酬古龍酸桿菌工程菌株及其制備方 法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素 C(英語:Vitamin C，又稱心抗壞血酸)為酸性己糖衍生物，是稀醇式己糖酸 內(nèi)醋，主要來源新鮮水果和蔬菜，是維持機(jī)體生長和代謝所必須的一種水溶性維生素。維生 素 C有レ型和D-型兩種異構(gòu)體，只有レ型的才具有生理功能，還原型和氧化型都有生理活 性。在生物體內(nèi)，維生素 C為抗體及膠原形成，組織修補(bǔ)(包括某些氧化還原作用），苯丙氨 酸、酪氨酸、葉酸的代謝，鐵、碳水化合物的利用，脂肪、蛋白質(zhì)的合成，維持免疫功能，徑化 與徑色胺，保持血管的完整，促進(jìn)非血紅素鐵吸收等所必需。同時維生素 C還具備有抗氧化， 抗自由基，抑制酪氨酸酶的形成，從而達(dá)到美白，淡斑的功效。目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、 飼料和化妝品領(lǐng)域，市場穩(wěn)定。
[0003] 酬古龍酸菌化etogulonigenium vulgare，K.vulgare)是中國維生素 C二步發(fā)酵工 業(yè)中的關(guān)鍵菌株。維生素 C的二步發(fā)酵法，主要指從D-山梨醇開始，經(jīng)過兩步發(fā)酵轉(zhuǎn)化為維 生素 C前體一一2-酬-k古龍酸的過程。第一步，利用氧化葡萄糖酸桿菌將D-山梨醇轉(zhuǎn)化為 心山梨糖;第二步利用酬古龍酸桿菌及其伴生菌(主要為芽抱桿菌）的混菌體系將k山梨糖 轉(zhuǎn)化為2-酬-k古龍酸(2-ketoA-gulonic acid,簡稱2-KGA)。但酬古龍酸桿菌單獨(dú)培養(yǎng)生 長緩慢且易染菌，發(fā)酵周期長，產(chǎn)酸量較低，影響其在擴(kuò)增培養(yǎng)、菌種活化的工業(yè)應(yīng)用。
[0004] 目前常采用添加外源物質(zhì)的方法提高菌種生物量及產(chǎn)酸量。添加外源物質(zhì)，包括 添加硫辛酸（申請?zhí)枺篊N 2011 10235170)、谷脫甘膚（申請?zhí)枺篊N200910069697、CN 201 1 10419275)、Ξ簇酸循環(huán)中的四碳酸或其鹽（申請?zhí)枺篊N 20 1010160 154、CN 201010160178)、輔因子（申請?zhí)?CN 201410546538)、添加更利于小菌利用的碳源(包括2碳 單位如乙醇、乙醒及乙酸（鹽）及6碳單位如D-山梨醇、D-甘露醇及D-甘露糖）（申請?zhí)枺篊N 201410545705)、加入琉基化合物（申請?zhí)?CN 200910069697)、外源添加氨基酸(Zhang et al.2011)(Fan et al.2014)。運(yùn)些外源添加物均對酬古龍酸桿菌生長有促進(jìn)作用。但由于 外源添加物質(zhì)需要耗費(fèi)時間和人力成本，同時添加物質(zhì)的濃度直接關(guān)系到企業(yè)成本，具有 企業(yè)應(yīng)用局限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種酬古龍酸桿菌工程菌株及其制備方法和應(yīng)用。該酬 古龍酸桿菌工程菌株通過在菌種體內(nèi)構(gòu)建氨基酸合成路徑中缺失基因，促使其單獨(dú)發(fā)酵時 更好的將山梨糖轉(zhuǎn)化為酬古龍酸，無需添加外源物質(zhì)。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供W下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種酬古龍酸桿菌工程菌株，該酬古龍酸桿菌工程菌株包括氨基酸 合成途徑中的關(guān)鍵基因；氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵基因?yàn)樘K氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因、 脯氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因或組氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因中的一種或幾種。
[0008] 作為優(yōu)選，蘇氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因?yàn)楦呓z氨酸激酶基因，脯氨酸合成途徑 中的關(guān)鍵基因?yàn)榛┼?5-簇酸還原酶基因，組氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因?yàn)榻M胺醇憐酸 酶基因。
[0009] 本發(fā)明經(jīng)過基因組測序，發(fā)現(xiàn)酬古龍酸桿菌氨基酸合成路徑中很多基因缺失，如 圖1所示，酬古龍酸桿菌氨基酸合成路徑中缺失的基因包括高絲氨酸激酶基因、化咯嘟-5- 簇酸還原酶基因或組胺醇憐酸酶基因。
[0010] 其中，高絲氨酸激酶化C編號為2.7.1.39)為蘇氨酸(Threonine)路徑缺失關(guān)鍵基 因，化咯嘟-5-簇酸還原酶化C編號為1.5.1.2)是脯氨酸(Proline)路徑缺失的酶，組胺醇憐 酸酶化C編號為3.1.3.15)是組氨酸化istidine)合成路徑中缺失的酶。
[0011] 同時有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)添加不同氨基酸對小菌生長和產(chǎn)酸有不同的促進(jìn)作用。本發(fā)明通 過在菌種體內(nèi)構(gòu)建氨基酸合成路徑中缺失基因，促使菌種單獨(dú)發(fā)酵時更好的將山梨糖轉(zhuǎn)化 為酬古龍酸，混菌發(fā)酵時減少發(fā)酵周期，節(jié)約時間成本，同時可W更少的依賴伴生菌的作 用，從而減少伴生菌即芽抱桿菌的用量，減少成本和污染。因而在酬古龍酸桿菌體內(nèi)構(gòu)建缺 失的氨基酸模塊促進(jìn)其生長和產(chǎn)酸更具有生物學(xué)意義。
[0012] 作為優(yōu)選，在本發(fā)明中高絲氨酸激酶基因、化咯嘟-5-簇酸還原酶基因或組胺醇憐 酸酶基因中包括啟動子和終止子序列。
[0013] 作為優(yōu)選，高絲氨酸激酶基因的序列如SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示。
[0014] 在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，序列如SEQ ID NO: 1的高絲氨酸激酶基因來源于氧化 葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)。
[0015] 在本發(fā)明提供的另一實(shí)施例中，序列如SEQ ID NO: 2的高絲氨酸激酶基因來源于 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。
[0016] 作為優(yōu)選，化咯嘟-5-簇酸還原酶基因的序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示。
[0017] 在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，序列如SEQ ID N0:3的化咯嘟-5-簇酸還原酶基因來源 于氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter 0巧dans)。
[001引在本發(fā)明提供的另一實(shí)施例中，序列如SEQ ID N0:4的化咯嘟-5-簇酸還原酶基因 來源于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。
[0019] 作為優(yōu)選，組胺醇憐酸酶基因的序列如SEQ ID N0:5所示。
[0020] 在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，序列如SEQ ID N0:5的組胺醇憐酸酶基因來源于蠟狀 芽抱桿菌（Bacillus cereus)。
[0021] 本發(fā)明提供了該酬古龍酸桿菌工程菌株的制備方法，包括:將氨基酸合成途徑中 的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)入酬古龍酸桿菌，獲得酬古龍酸桿菌工程菌株;氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵基 因?yàn)樘K氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因、脯氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因或組氨酸合成途徑中的 關(guān)鍵基因中的一種或幾種。
[0022] 在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，該酬古龍酸桿菌工程菌株的制備方法具體為：
[0023] 將氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵基因與載體連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中克隆擴(kuò)增，得到重 組子；
[0024] 從重組子中提取目標(biāo)質(zhì)粒，將目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酬古龍酸桿菌，獲得酬古龍酸桿菌工 程菌株。
[0025] 在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞采用熱激法。
[0026] 在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，將目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酬古龍酸桿菌的方法采用電轉(zhuǎn)化法。
[0027] 作為優(yōu)選，電轉(zhuǎn)化法的電壓為2000V。
[0028] 在本發(fā)明中，電轉(zhuǎn)化采用町培養(yǎng)基進(jìn)行操作。
[0029] 在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，載體為PBBR1MCS2。
[0030] 在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，受體細(xì)胞為大腸桿菌。
[0031] 本發(fā)明還提供了一種2-酬-k古龍酸的制備方法，將本發(fā)明提供的酬古龍酸桿菌 工程菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到2-酬-心古龍酸。
[0032] 作為優(yōu)選，將本發(fā)明提供的酬古龍酸桿菌工程菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)具體為:將酬古 龍酸桿菌工程菌株接種于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，然后接種于種子培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵 培養(yǎng)。
[0033] 作為優(yōu)選，種子培養(yǎng)的溫度為30°C，時間為2地。
[0034] 作為優(yōu)選，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為25化/min,時間為0~62h。
[0035] 在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，W1L培養(yǎng)基計(jì)，種子培養(yǎng)基的配方及制備方法為:稱取 牛肉膏3. Og，玉米漿6. Og，酵母浸粉3. Og，蛋白腺10.0 g，無水硫酸儀0.2g，尿素1. Og，憐酸氨 二鐘1. Og，定容至0.化，迅速加入碳酸巧2. Og，調(diào)節(jié)抑至7.0，另取20g山梨糖定容至0.1L，均 在12rC條件下滅菌20min;接菌前將100ml、20%糖溶液加入種子培養(yǎng)基中混合。
[0036] 本發(fā)明還提供了另一種2-酬-k古龍酸的制備方法，將本發(fā)明提供的酬古龍酸桿 菌工程菌株和芽抱桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到2-酬-心古龍酸。
[0037] 作為優(yōu)選，將本發(fā)明提供的酬古龍酸桿菌工程菌株和芽抱桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)具體 為:將酬古龍酸桿菌工程菌株接種于固體培養(yǎng)基中進(jìn)行第一培養(yǎng)，將芽抱桿菌接種于種子 培養(yǎng)基中進(jìn)行第二培養(yǎng)，然后將經(jīng)過第一培養(yǎng)后的酬古龍酸桿菌工程菌株和經(jīng)過第二培養(yǎng) 后的芽抱桿菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
[0038] 在該制備方法中，第一培養(yǎng)的溫度為30°C，時間為2地。
[0039] 在該制備方法中，第二培養(yǎng)的溫度為30°C，時間為12h。
[0040] 作為優(yōu)選，經(jīng)過第一培養(yǎng)后的酬古龍酸桿菌工程菌株的接種量為經(jīng)過第二培養(yǎng)后 的芽抱桿菌的接種量的2倍。
[0041 ]作為優(yōu)選，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為25化/min,時間為0~8地。
[0042] 在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)的時間為72h。
[0043] 在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，W1L培養(yǎng)基計(jì)，種子培養(yǎng)基的配方及制備方法為:稱取 牛肉膏3. Og，玉米漿6. Og，酵母浸粉3. Og，蛋白腺10.0 g，無水硫酸儀0.2g，尿素1. Og，憐酸氨 二鐘1. Og，定容至0.化，迅速加入碳酸巧2. Og，調(diào)節(jié)抑至7.0，另取20g山梨糖定容至0.1L，均 在12rC條件下滅菌20min;接菌前將100ml、20%糖溶液加入種子培養(yǎng)基中混合。
[0044] 在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，W1L培養(yǎng)基計(jì)，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方及制備方法為:稱取 玉米漿15. Og，無水硫酸儀0.5g，尿素12. Og，憐酸氨二鐘1. Og，定容至0.化，迅速加入碳酸巧 2 . Og，調(diào)節(jié)pH至7.0，另取80g山梨糖定容至0 .化，均在121°C條件下滅菌20min;接菌前將 200ml、40 %糖溶液加入發(fā)酵培養(yǎng)基中混合。
[0045] 在本發(fā)明提供的實(shí)施例中，芽抱桿菌為內(nèi)生芽抱桿菌。
[0046] 本發(fā)明還提供了一種維生素 C的制備方法，將本發(fā)明提供的酬古龍酸桿菌工程菌 株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到2-酬-心古龍酸;將2-酬-k古龍酸做為原料制備維生素 C。
[0047] 本發(fā)明還提供了一種維生素 C的制備方法，將本發(fā)明提供的酬古龍酸桿菌工程菌 株和芽抱桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到2-酬-心古龍酸;將2-酬-k古龍酸做為原料制備維生素 C。
[0048] 本發(fā)明提供了一種酬古龍酸桿菌工程菌株及其制備方法和應(yīng)用。該酬古龍酸桿菌 工程菌株包括氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵基因；氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵基因?yàn)樘K氨酸合成 途徑中的關(guān)鍵基因、脯氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因或組氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因中的一 種或幾種。本發(fā)明具有的有益效果為：
[0049] 本發(fā)明通過在菌種體內(nèi)構(gòu)建氨基酸合成路徑中缺失基因，促使酬古龍酸桿菌工程 菌株單獨(dú)發(fā)酵時更好的將山梨糖轉(zhuǎn)化為酬古龍酸：單菌發(fā)酵62h，插入Gluconobacter oxydans來源的蘇氨酸合成路徑相關(guān)基因（高絲氨酸激酶基因）的酬古龍酸桿菌工程菌株 (pMCS2-Th;r.g)0D600提高了21.4%，插入Saccharomyces cerevisiae來源的蘇氨酸合成路 徑相關(guān)基因（高絲氨酸激酶基因）的酬古龍酸桿菌工程菌株(pMCS2-Thr.s)提高了 1.92%， 插入Saccharomyces cerevisiae來源的脯氨酸合成路徑相關(guān)基因（化咯嘟-5-簇酸還原酶 基因）的酬古龍酸桿菌工程菌株pMCS2-Pro. S提高了6.4% ;單菌發(fā)酵62h，pMCSS-T'虹.g酬古 龍酸產(chǎn)量提高了 25.15 %，PMCS2-T虹.S提高了 6.85 %，pMCS2-Pro. S提高了 4.17 % ;
[0050] 本發(fā)明將酬古龍酸桿菌工程菌株和芽抱桿菌混菌發(fā)酵時，減少發(fā)酵周期，PMCS2- ?'虹.g、pMCS2-T'虹.s、pMCS2-Pro.s相比原始菌株，周期縮短lOh左右，節(jié)約時間成本;在產(chǎn)率 方面，PMCS2-T虹.g、pMCS2-T虹.S相比原始菌提高20 %左右，pMCS2-Pro. S提高了 10 %左右；
[0051] 本發(fā)明將酬古龍酸桿菌工程菌株和芽抱桿菌混菌發(fā)酵時，可W更少的依賴伴生菌 的作用，從而減少伴生菌即芽抱桿菌的用量，減少成本和污染。
【附圖說明】
[0052] 圖1示酬古龍酸桿菌氨基酸合成路徑中缺失的關(guān)鍵基因；其中，黑色實(shí)屯、圓表示缺 少的物質(zhì)。
[0053] 圖2示本發(fā)明酬古龍酸桿菌工程菌株表達(dá)缺失氨基酸路徑菌株構(gòu)建思路圖；
[0054] 圖3示本發(fā)明中不同酬古龍酸桿菌工程菌株發(fā)酵0~62h的0D600;
[0055] 圖4示不同酬古龍酸桿菌工程菌株的發(fā)酵產(chǎn)酸曲線;其中，Κν為原始菌株酬古龍酸 桿菌化.化Igare)的產(chǎn)酸曲線，Mcs為導(dǎo)入空質(zhì)粒的酬古龍酸桿菌(PBBR1MCS2)的產(chǎn)酸曲線； Thr-g為pMCS2-Thr. g發(fā)酵曲線；Thr-s為pMCSS-T'虹.S發(fā)酵曲線；Pro-g為pMCS2-Pro. g發(fā)酵 曲線；Pro-s為pMCS2-Pro. S發(fā)酵曲線；His-b為pMCS2-His. b發(fā)酵曲線；
[0056] 圖5示本發(fā)明中酬古龍酸桿菌與內(nèi)生芽抱桿菌（Hbe)混菌發(fā)酵產(chǎn)量圖；其中， Kv.Hbe為原始菌株和內(nèi)生芽抱桿菌的混菌發(fā)酵曲線;Mcs.化e為導(dǎo)入空質(zhì)粒的酬古龍酸桿 菌和內(nèi)生芽抱桿菌的混菌發(fā)酵曲線;Pro-s.化e為pMCS2-Pro. S菌株和內(nèi)生芽抱桿菌混菌發(fā) 酵曲線；Thr-s .冊e為pMCS2-Thr. S和內(nèi)生芽抱桿菌混菌發(fā)酵曲線；Thr-g.冊e為PMCS2- T虹.g和內(nèi)生芽抱桿菌混菌發(fā)酵曲線；
[0057] 圖6示本發(fā)明中酬古龍酸桿菌與內(nèi)生芽抱桿菌混菌發(fā)酵產(chǎn)率圖。
【具體實(shí)施方式】
[0058] 本發(fā)明公開了一種酬古龍酸桿菌工程菌株及其制備方法和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可W借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對 本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已 經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本 文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0059] 本發(fā)明提供的酬古龍酸桿菌工程菌株及其制備方法和應(yīng)用中所用菌種、培養(yǎng)基原 料、儀器等均可由市場購得。
[0060] 本發(fā)明實(shí)施例中所用培養(yǎng)基配方如下：
[0061 ] 1、LB培養(yǎng)基：10 . Og/L氯化鋼，10.0 g/L膜蛋白腺，5. Og/L酵母提取物。相應(yīng)固體培 養(yǎng)基中加入2%瓊脂粉。滅菌條件：12rC，20min。該LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的重組大腸 桿困。
[0062] 2、1L町培養(yǎng)基化.vulgare分子操作用）：稱量酵母浸粉5.0g，蛋白腺15.0g，尿素 5.0g，無水硫酸儀2.5g，定容至0.化，另稱取15.0g山梨糖定容至0.化，均115°C滅菌15min。 接菌前將200ml ,7.5%糖溶液加入町培養(yǎng)基中混合。該HJ培養(yǎng)基用于酬古龍酸桿菌的電轉(zhuǎn) 化過程。
[0063] 3、1L種子培養(yǎng)基化.vulgare發(fā)酵用）：稱取牛肉膏3.0g，玉米漿6.0g，酵母浸粉 3. Og，蛋白腺10.0 g，無水硫酸儀0.2g，尿素1. Og，憐酸氨二鐘1. Og，定容至0.化，迅速加入碳 酸巧2.0g，調(diào)節(jié)抑至7.0,另取20g山梨糖定容至0.1L，均在121°C條件下滅菌20min。接菌前 將100ml ,20%糖溶液加入種子培養(yǎng)基中混合。該種子培養(yǎng)基用于酬古龍酸桿菌的單菌發(fā) 酵，W及芽抱桿菌的種子培養(yǎng)。
[0064] 4、1L固體培養(yǎng)基:稱取牛肉膏3.0g，玉米漿6.0g，酵母浸粉3.0g，蛋白腺lO.Og，無 水硫酸儀0.2g，尿素1. Og，憐酸氨二鐘1. Og，定容至0.化，迅速加入碳酸巧2. Og，調(diào)節(jié)pH至 7.0,最后加入15.0g瓊脂糖，另取40g山梨糖定容至0.化，均在12rC條件下滅菌20min。接菌 前將200ml ,20%糖溶液加入種子培養(yǎng)基中混合。該固體培養(yǎng)基用于酬古龍酸桿菌的一級種 子培養(yǎng)。
[0065] 5、化發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取玉米漿15.0肖，無水硫酸儀0.5肖，尿素12.0肖，憐酸氨二鐘 1. Og，定容至0.化，迅速加入碳酸巧2. Og，調(diào)節(jié)pH至7.0，另取80g山梨糖定容至0.化，均在 12rC條件下滅菌20min。接菌前將200ml ,40%糖溶液加入發(fā)酵培養(yǎng)基中混合。該發(fā)酵培養(yǎng) 基用于混菌發(fā)酵。
[0066] 本發(fā)明實(shí)施例中產(chǎn)物檢測方法如下：
[0067] 1、菌濃度測定:使用75-6型紫外分光光度計(jì)測定培養(yǎng)過程中菌株的生長曲線，波 長采用600nm，即0D600;
[0068] 2、酬古龍酸產(chǎn)量測定:高效液相色譜檢測，采用Aminex HPX-87H色譜柱，示差檢測 器。0.5mM硫酸作流動相，柱溫65°C，檢測器溫度50°C。
[0069] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0070] 實(shí)施例1菌種的構(gòu)建
[0071] 經(jīng)過基因組測序，發(fā)現(xiàn)酬古龍酸桿菌氨基酸合成路徑中很多基因缺失，包括高絲 氨酸激酶、化咯嘟-5-簇酸還原酶、組胺醇憐酸酶，K.化Igare氨基酸合成路徑基因缺失圖見 圖1。本實(shí)施例中將高絲氨酸激酶基因、化咯嘟-5-簇酸還原酶、組胺醇憐酸酶導(dǎo)入酬古龍酸 桿菌中。表達(dá)缺失氨基酸路徑菌株構(gòu)建思路見圖2。
[0072] l、pMCS2-Tlir.g 菌種的構(gòu)建
[0073] 高絲氨酸激酶化C編號為2.7.1.39)為蘇氨酸(Threonine)路徑缺失關(guān)鍵基因，合 成改造基因時選擇Gluconobacter 0巧dans來源，然后再將序列如SEQ ID N0:1所示的目的 基因經(jīng)過ΚρηΙ和化ndlll連接到質(zhì)粒PBBR1MCS2上，轉(zhuǎn)入大腸體內(nèi)克隆擴(kuò)增，得到大腸桿菌 重組子。從大腸桿菌中提取克隆擴(kuò)增的目標(biāo)質(zhì)粒，再將質(zhì)粒在2000V條件下電轉(zhuǎn)入酬古龍酸 桿菌，獲得編碼高絲氨酸激酶基因載體的重組酬古龍酸桿菌，命名簡寫為PMCS2-T虹.邑。
[0074] 2、pMCS2-Tlir.s 菌種的構(gòu)建
[00巧]合成改造基因時選擇Saccharomyces cerevisiae來源，然后再將序列如SEQ ID ^):2所示的目的基因經(jīng)過牡111和化11(1111連接到質(zhì)粒口881?謹(jǐn)〔52上，轉(zhuǎn)入大腸體內(nèi)克隆擴(kuò) 增，得到大腸桿菌重組子。從大腸桿菌中提取克隆擴(kuò)增的目標(biāo)質(zhì)粒，再將質(zhì)粒在2000V條件 下電轉(zhuǎn)入酬古龍酸桿菌，獲得編碼高絲氨酸激酶基因載體的重組酬古龍酸桿菌，命名簡寫 為PMCS2-T虹.S。
[0076] 3、pMCS2-Pro.g 菌種的構(gòu)建
[0077] 化咯嘟-5-簇酸還原酶化C編號為1.5.1.2)是脯氨酸(Proline)路徑缺失的酶，合 成改基因時選擇Gluconobacter oxydans來源，然后再將序列如SEQ ID N0:3所示的目的基 因經(jīng)過ΚρηΙ和Hindlll連接到質(zhì)粒地BR1MCS2上，轉(zhuǎn)入大腸體內(nèi)克隆擴(kuò)增，得到大腸桿菌重 組子。從大腸桿菌中提取克隆擴(kuò)增的目標(biāo)質(zhì)粒，再將質(zhì)粒在2000V條件下電轉(zhuǎn)入酬古龍酸桿 菌，獲得編碼化咯嘟-5-簇酸還原酶基因載體的重組酬古龍酸桿菌，命名簡寫為PMCS2- Pro.go
[0078] 4、pMCS2-Pro.s 菌種的構(gòu)建
[00巧]合成改基因時選擇Saccharomyces cerevisiae來源，然后再將序列如沈Q ID NO: 4所示的目的基因經(jīng)過ΚρηΙ和Hindlll連接到質(zhì)粒地BR1MCS2上，轉(zhuǎn)入大腸體內(nèi)克隆擴(kuò)增，得 到大腸桿菌重組子。從大腸桿菌中提取克隆擴(kuò)增的目標(biāo)質(zhì)粒，再將質(zhì)粒在2000V條件下電轉(zhuǎn) 入酬古龍酸桿菌，獲得編碼化咯嘟-5-簇酸還原酶基因載體的重組酬古龍酸桿菌，命名簡寫 為 pMCS2-P;ro. S。
[0080] 5、pMCS2-His.b 菌種的構(gòu)建
[0081] 組胺醇憐酸酶化C編號為3.1.3.15)是組氨酸化istidine)合成路徑中缺失的酶， 合成改基因時選擇Bacillus cereus來源，然后再將序列如SEQ ID N0:5所示的目的基因經(jīng) 過ΚρηΙ和化ndlll連接到質(zhì)粒地BR1MCS2上，轉(zhuǎn)入大腸體內(nèi)克隆擴(kuò)增，得到大腸桿菌重組子。 從大腸桿菌中提取克隆擴(kuò)增的目標(biāo)質(zhì)粒，再將質(zhì)粒在2000V條件下電轉(zhuǎn)入酬古龍酸桿菌，獲 得編碼組胺醇憐酸酶基因載體的重組酬古龍酸桿菌，命名簡寫為pMCS2-His.b。
[0082] 在上述5種工程菌構(gòu)建過程中，目的片段或質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)入K.vulgare 細(xì)胞內(nèi)。電轉(zhuǎn)化的基本步驟分為感受態(tài)細(xì)胞的制備、電轉(zhuǎn)及篩選。
[0083] 1 .K.vulgare感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0084] K.vulgare甘油菌經(jīng)過固體平板活化，轉(zhuǎn)接于50mL町培養(yǎng)基中，培養(yǎng)13h至菌體到 達(dá)指數(shù)期后期；取40mL菌體于50mL預(yù)冷的離屯、管中，冰浴15min;在4°C冷凍離屯、機(jī)內(nèi) 450化pm離屯、15min，倒掉上清液；用預(yù)冷的10 %的甘油進(jìn)行洗涂，重懸細(xì)胞，450化pm離屯、 15min，同樣去除上清液;重復(fù)上一步驟;加入30mL的滅菌預(yù)冷的超純水重懸細(xì)胞，450化pm 離屯、15min，倒掉上清;加入90化L提前預(yù)冷的10 %甘油，重懸細(xì)胞，用預(yù)冷的槍頭分裝感受 態(tài)細(xì)胞于1.5mL EP管內(nèi)，每管內(nèi)有感受態(tài)細(xì)胞90化。制備好的感受態(tài)細(xì)胞放置于-80°C冰箱 內(nèi)保存，需要時取出使用。
[0085] 2.電轉(zhuǎn)
[0086] 從-80°C冰箱中取出已制備好的K.vulgare感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上融化；用冷凍槍 頭加入10化質(zhì)粒(濃度最好在lOOngW上），注意質(zhì)粒需緩慢加入，且不可反復(fù)吹吸感受態(tài)細(xì) 胞，小屯、輕彈EP管外壁混勻細(xì)胞和質(zhì)粒，然后靜置5min;將EP管內(nèi)的混合物用冷凍槍頭轉(zhuǎn)移 到事先預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，電轉(zhuǎn)杯始終進(jìn)行冰浴;設(shè)置電擊電壓2. OkV，控制電擊時間4~6ms， 電擊后迅速加入預(yù)冷的無抗町培養(yǎng)基;在30°C，150rpm搖床中進(jìn)行復(fù)蘇化，離屯、菌體涂布于 與質(zhì)?？剐曰?qū)?yīng)的抗性平板上。
[0087] 3.篩選
[0088] 通過提質(zhì)粒酶切驗(yàn)證獲得正確的轉(zhuǎn)化子。
[0089] 實(shí)施例2單菌搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)
[0090] 將實(shí)施例1中獲得的含有編碼氨基酸載體的酬古龍酸桿菌(91〔52-化'.旨、91〔52- T虹.S、pMCS2-Pro. g、pMCS2-Pro. S、pMCS2-His. b)進(jìn)行種子培養(yǎng)，然后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中 進(jìn)行發(fā)酵，具體操作如下：
[0091 ] 1)酬古龍酸桿菌種子培養(yǎng)方法：
[0092] 取保存的甘油菌20化L于抗性固體平板上，平板所含抗性為卡那霉素，濃度為50μ g/mL。小幅度傾斜搖晃使菌液均勻地、完整地覆蓋于固體平板上，在30°C時培養(yǎng)2地。原始菌 株在不加抗性的固體平板上培養(yǎng)24小時。
[0093] 2)單菌搖瓶發(fā)酵
[0094] 將原始的酬古龍酸桿菌和導(dǎo)入不同氨基酸模塊的不同重組菌分別加20化L在固體 種子培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)24h，之后從平板上洗下，W相同的初始0D接入種子培養(yǎng)基中，30 °(：、250'/111111進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，0}1、12}1、2地、36}1、4她、62}1等不同時間點(diǎn)取樣分析檢測00600 (菌種濃度），測定發(fā)酵62h后的酬古龍酸產(chǎn)量。菌種濃度檢測結(jié)果見圖3、圖4,發(fā)酵62h后的 酬古龍酸產(chǎn)量結(jié)果見表1。
[00M]表1單菌搖瓶發(fā)酵結(jié)果
[0096]
[0097] 由圖4試驗(yàn)結(jié)果可知，單菌發(fā)酵62h，pMCS2-Thr.g 0D600提高了 21.4%，pMCS2- Thr. S提高了 1.92 %，pMCS2-Pro. S提高了 6.4 %，其他改造菌（pMCS2-Pro. g、pMCS2-Hi S. b) 生長促進(jìn)作用不明顯。
[009引由表1試驗(yàn)結(jié)果可知，單菌發(fā)酵62h，PMCS2-化r. g酬古龍酸產(chǎn)量提高了 25.15 %， PMCS2-T虹.S提高了6.85%，pMCS2-Pro. S提高了4.17%，其他改造菌（pMCS2-Pro. g、pMCS2- His.b)酬古龍酸產(chǎn)量與原始菌酬古龍酸產(chǎn)量差異不明顯。
[0099] 實(shí)施例3混菌(不同氨基酸改造菌與內(nèi)生芽抱桿菌)發(fā)酵試驗(yàn)
[0100] 將原始的酬古龍酸桿菌和實(shí)施例1獲得的導(dǎo)入不同氨基酸模塊的不同重組菌分別 加 200化在固體種子培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)24h，之后從平板上洗下，內(nèi)生芽抱桿菌甘油菌接 450化于種子培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)12h，不同氨基酸改造菌W相同的初始OD接入發(fā)酵培養(yǎng)基 中，芽抱桿菌初始接種〇〇600為酬古龍酸桿菌的l/^2接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C、250r/min進(jìn)行 搖瓶發(fā)酵，Oh、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h等不同時間點(diǎn)取樣分析，檢測酬古龍酸（2- 酬-k古龍酸)產(chǎn)量和產(chǎn)率。結(jié)果見表2、表3、圖5、6。
[0101] 表2不同菌株發(fā)酵培養(yǎng)后的酬古龍酸(2-KGA)的產(chǎn)量(g^)
[0102]
[0106] 由試驗(yàn)結(jié)果可知，挑選效果好的Ξ株菌（pMCS2-Thr . g、pMCS2-Thr . S、pMCS2- Pro . s)混菌發(fā)酵時，相比原始菌株，周期縮短lOh左右；在產(chǎn)率方面，pMCS2-Thr. g、pMCS2- Τ虹.s相比原始菌提高20 %左右，pMCS2-Pro. s提高了 10 %左右。
[0107] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W做出若干改進(jìn)和潤飾，運(yùn)些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種酮古龍酸桿菌工程菌株，其特征在于，所述酮古龍酸桿菌工程菌株包括氨基酸 合成途徑中的關(guān)鍵基因；所述氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵基因?yàn)樘K氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基 因、脯氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因或組氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因中的一種或幾種。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酮古龍酸桿菌工程菌株，其特征在于，所述蘇氨酸合成途徑中 的關(guān)鍵基因?yàn)楦呓z氨酸激酶基因，所述脯氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因?yàn)檫量┻?5-羧酸還 原酶基因，所述組氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因?yàn)榻M胺醇磷酸酶基因。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的酮古龍酸桿菌工程菌株，其特征在于，所述高絲氨酸激酶基因 的序列如SEQIDN0:1或SEQIDN0 :2所示； 所述吡咯啉-5-羧酸還原酶基因的序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示； 所述組胺醇磷酸酶基因的序列如SEQ ID N0:5所示。4. 如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述酮古龍酸桿菌工程菌株的制備方法，其特征在于，包 括:將氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)入酮古龍酸桿菌，獲得酮古龍酸桿菌工程菌株;所述 氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵基因?yàn)樘K氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因、脯氨酸合成途徑中的關(guān)鍵 基因或組氨酸合成途徑中的關(guān)鍵基因中的一種或幾種。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法具體為： 將氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵基因與載體連接，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中克隆擴(kuò)增，得到重組子； 從所述重組子中提取目標(biāo)質(zhì)粒，將所述目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酮古龍酸桿菌，獲得酮古龍酸桿 菌工程菌株。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于，所述將目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酮古龍酸桿 菌的方法采用電轉(zhuǎn)化法，所述電轉(zhuǎn)化法的電壓為2000V;所述載體為TOBR1MCS2;所述受體細(xì) 胞為大腸桿菌。7. -種2-酮-L-古龍酸的制備方法，其特征在于，將如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述酮古 龍酸桿菌工程菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到2-酮-L-古龍酸。8. -種2-酮-L-古龍酸的制備方法，其特征在于，將如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述酮古 龍酸桿菌工程菌株和芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到2-酮-L-古龍酸。9. 一種維生素 C的制備方法，其特征在于，將如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述酮古龍酸桿 菌工程菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到2-酮-L-古龍酸;將所述2-酮-L-古龍酸做為原料制備維生 素 C。10. -種維生素 C的制備方法，其特征在于，將如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述酮古龍酸 桿菌工程菌株和芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到2-酮-L-古龍酸;將所述2-酮-L-古龍酸做為 原料制備維生素 C。
【文檔編號】C12R1/01GK106011043SQ201610652365
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月10日
【發(fā)明人】潘才惠, 丁明珠, 王瑞釗, 元英進(jìn)
【申請人】天津大學(xué)