人類羊膜間充質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞方法
【專利摘要】本發(fā)明提出一種將人類羊膜間充質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，其步驟包括：原代細(xì)胞的分離培養(yǎng)；原代細(xì)胞的純化；原代細(xì)胞流式細(xì)胞儀鑒定；2-巰基乙醇，B27，bFGF，煙酰胺誘導(dǎo)；誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)功能鑒定。本發(fā)明為體外將人類羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成胰島素分泌細(xì)胞的方法，誘導(dǎo)人類羊膜間充質(zhì)細(xì)胞分化為巢蛋白陽性細(xì)胞，誘導(dǎo)巢蛋白陽性細(xì)胞擴增并分化為前體細(xì)胞，誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞成熟證實羊膜間充質(zhì)細(xì)胞在特定環(huán)境下有向胰島素分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的可能性，由于羊膜間充質(zhì)細(xì)胞來源廣泛，且無倫理學(xué)方面的障礙，這為臨床干細(xì)胞移植提供了新的思路。
【專利說明】
人類羊膜間充質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及人類羊膜間充質(zhì)細(xì)胞體外定向分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]羊膜位于胎兒絨毛膜的表面，為光滑、無血管、無神經(jīng)、無淋巴的透明薄膜。羊膜組織主要由外胚層的羊膜上皮細(xì)胞(Amn1tic epithelial cells，AECs)和中胚層的羊膜間充質(zhì)細(xì)胞(Amn1tic mesenchyme cells，AMCs)兩類細(xì)胞組成。羊膜上皮細(xì)胞(AECs)具有向三胚層細(xì)胞分化的潛能，但AECS不表達(dá)端粒酶基因，不能稱之為嚴(yán)格定義上的干細(xì)胞，不具有長期自我更新和產(chǎn)生單個細(xì)胞克隆的能力，因而也就沒有致瘤性(Tosh1，et al, 2005) 0羊膜上皮細(xì)胞取材方便且來源豐富、其多能干細(xì)胞性、低免疫原性與胚胎干細(xì)胞不同，不涉及倫理道德問題，有望成為再生醫(yī)學(xué)一種可靠的細(xì)胞來源。同樣，羊膜間充質(zhì)細(xì)胞具有BMSCs特性，可以多向分化，并且擴增能力更強而免疫原性較低(Kubo，etal, 2001),也為MSCs的獲取提供了新的來源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明將取選用剖宮產(chǎn)后的人羊膜，大小約15*15cm，分離、去除殘留的絨毛膜，PBS (Gibco BRL公司)，洗盡血跡后用0.125%胰酶，37 °C消化1min,重復(fù)4次，100rpm,離心6min收集，接種在含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)皿中，然后通過免疫吸附法對細(xì)胞進行純化，流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型，最后對細(xì)胞進行轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)實驗，并對分化細(xì)胞進行組織化學(xué)細(xì)胞染色鑒定。
[0004]具體的方法步驟包括:
[0005]S1:原代細(xì)胞的分離培養(yǎng):無菌條件下取產(chǎn)后棄置的新鮮胎盤(經(jīng)家屬同意)，將羊膜與絨毛層鈍性分離，置于含有雙抗(100U/ML青霉素、100UG/ML鏈霉素)的D-HANKS液反復(fù)沖洗。將漂洗后的羊膜用眼科剪剪成約1*1_碎塊，加入2.5G/L胰蛋白酶37°C消化lOmin，加入含5%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，并輕柔吹打混勻后200目細(xì)胞篩過濾，過濾后的羊膜組織中加入1.0g/L II型膠原酶消化液，37°C消化0.5h，再次用5%小牛血清的RPMI1640終止消化，輕柔吹打混勻后200目細(xì)胞篩過濾，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1*106接種到25cm2培養(yǎng)瓶，加入含1%青鏈霉素，10ng/mlbFGF和10 % FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。置于37°C，飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)5%的C02培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下每天觀察原代和傳代細(xì)胞的生長情況和形態(tài)特征，隔天換液一次，并攝片記錄，待細(xì)胞長滿70%瓶底時，用2.5g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，消化過程中，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞消化情況，待大部分細(xì)胞胞體回縮、變圓，立刻終止消化，以1:2比例傳代培養(yǎng)，記為Pl代，傳代過程中，隔日換液一次，待細(xì)胞長滿70%瓶底重復(fù)以上步驟，傳代培養(yǎng)記為P2代，依次類推。
[0006]S2:原代細(xì)胞免疫吸附法純化:上述細(xì)胞培養(yǎng)5天后，用0.125%胰酶，37°C消化lOmin, 100rpm,離心6min收集，用PBS洗3次，接種在無血清RPMI1640培養(yǎng)基中，向細(xì)胞懸液內(nèi)加入鼠抗人Thyl.1單克隆抗體，作用濃度為20ng/ml，37°C下作用30min，該抗體將與間充質(zhì)來源的成纖維細(xì)胞特異性結(jié)合，細(xì)胞懸液離心除培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)基洗2次除去抗體，全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，移入山羊抗鼠IgG包被過的培養(yǎng)皿中，37°C下孵育1H，將細(xì)胞懸液再次吸出離心，培養(yǎng)基洗一次，加入全培養(yǎng)基后移入PLL包被的培養(yǎng)皿中，調(diào)節(jié)接種密度為106/ml，第三天加入新鮮培養(yǎng)基1ml，第五天觀察細(xì)胞生長情況，胰酶消化后重新接種在PLL包被過的培養(yǎng)皿中，于37°C含5% C02空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0007]S3:原代細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測:純化后的細(xì)胞取少量應(yīng)用流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞表型的鑒定，具體步驟為:細(xì)胞用胰酶消化后，用PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度為l*106/ml，分別加入下列鼠抗人單克隆抗體:CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE，置 4°C孵育 30min, PBS 洗 2 遍，直接進行流式細(xì)胞儀分析。
[0008]S4:體外誘導(dǎo)人類羊膜間充質(zhì)細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞，分為3個階段:誘導(dǎo)MSCs分化為巢蛋白陽性細(xì)胞(DMEM培養(yǎng)基+5mmol/L 2-巰基乙醇培養(yǎng)5h);誘導(dǎo)巢蛋白陽性細(xì)胞擴增并分化為前體細(xì)胞(細(xì)胞接種于涂有Matrigel的培養(yǎng)板，在DMEM培養(yǎng)基+B27+10 μ g/L bFGF+0.lmmol/L 2-巰基乙醇+ITS中培養(yǎng)7天)；誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞成熟(DMEM 培養(yǎng)基 +B27+10 μ g/L HGF+20mmol/L 煙酰胺 +0.lmmol/L 2-巰基乙醇 +LY294002 培養(yǎng)7?21天。
[0009]S5:誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)、功能鑒定RT-PCR方法=Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計對RNA樣品定量后通過RT-PCR進行產(chǎn)物擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測。誘導(dǎo)第28天，胰島素-1、Pdx-1、Pax-6mRNA表達(dá)顯著高于第7天和第14天。收集24h培養(yǎng)基，以放射免疫法測定胰島素累積分泌量。誘導(dǎo)7天后，胰島素分泌量急劇增加，而且隨著時間延長分泌量呈上升趨勢，各時間點相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意(P〈0.01)。胰島素刺激實驗:參照參考文獻，計算刺激指數(shù)(SI)。誘導(dǎo)第7天，細(xì)胞對葡萄糖的刺激可以產(chǎn)生反應(yīng)；誘導(dǎo)第14?28天細(xì)胞的基礎(chǔ)和刺激后分泌量均顯著增高，對葡萄糖的刺激更加敏感；第14天、第28天的SI較第7天顯著升高(P = 0.0008,0.003),但是第14天與第28天相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P = 0.051)。
[0010]本發(fā)明將人類羊膜間充質(zhì)細(xì)胞體外定向分化為胰島素分泌細(xì)胞的方法，先將原代培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)用免疫吸附法進行純化，純化后的細(xì)胞2-巰基乙醇，B27，bFGF，煙酰胺誘導(dǎo)；誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)功能鑒定。該方法較前所報道的各種其他誘導(dǎo)方法明顯提高了胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率。
【附圖說明】
[0011]通過下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。其中:
[0012]圖1所示為本發(fā)明的體外羊膜間充質(zhì)細(xì)胞定向分化為胰島素分泌細(xì)胞方法步驟流程圖。
【具體實施方式】
[0013]所述人類羊膜間充質(zhì)細(xì)胞體外定向分化為胰島素分泌細(xì)胞方法包括如下步驟:
[0014]S1:原代細(xì)胞的分離培養(yǎng):無菌條件下取產(chǎn)后棄置的新鮮胎盤(經(jīng)家屬同意)，將羊膜與絨毛層鈍性分離，置于含有雙抗(100U/ML青霉素、100UG/ML鏈霉素)的D-HANKS液反復(fù)沖洗。將漂洗后的羊膜用眼科剪剪成約1*1_碎塊，加入2.5G/L胰蛋白酶37°C消化lOmin，加入含5%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，并輕柔吹打混勻后200目細(xì)胞篩過濾，過濾后的羊膜組織中加入1.0g/L II型膠原酶消化液，37°C消化0.5h，再次用5%小牛血清的RPMI1640終止消化，輕柔吹打混勻后200目細(xì)胞篩過濾，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1*106接種到25cm2培養(yǎng)瓶，加入含1%青鏈霉素，10ng/mlbFGF和10 % FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。置于37°C，飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)5%的C02培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下每天觀察原代和傳代細(xì)胞的生長情況和形態(tài)特征，隔天換液一次，并攝片記錄，待細(xì)胞長滿70%瓶底時，用2.5g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，消化過程中，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞消化情況，待大部分細(xì)胞胞體回縮、變圓，立刻終止消化，以1:2比例傳代培養(yǎng)，記為Pl代，傳代過程中，隔日換液一次，待細(xì)胞長滿70%瓶底重復(fù)以上步驟，傳代培養(yǎng)記為P2代，依次類推。
[0015]S2:原代細(xì)胞免疫吸附法純化:上述細(xì)胞培養(yǎng)5天后，用0.125%胰酶，37°C消化lOmin, 100rpm,離心6min收集，用PBS洗3次，接種在無血清RPMI1640培養(yǎng)基中，向細(xì)胞懸液內(nèi)加入鼠抗人Thyl.1單克隆抗體，作用濃度為20ng/ml，37°C下作用30min，該抗體將與間充質(zhì)來源的成纖維細(xì)胞特異性結(jié)合，細(xì)胞懸液離心除培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)基洗2次除去抗體，全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，移入山羊抗鼠IgG包被過的培養(yǎng)皿中，37°C下孵育1H，將細(xì)胞懸液再次吸出離心，培養(yǎng)基洗一次，加入全培養(yǎng)基后移入PLL包被的培養(yǎng)皿中，調(diào)節(jié)接種密度為106/ml，第三天加入新鮮培養(yǎng)基1ml，第五天觀察細(xì)胞生長情況，胰酶消化后重新接種在PLL包被過的培養(yǎng)皿中，于37°C含5% C02空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0016]S3:原代細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測:純化后的細(xì)胞取少量應(yīng)用流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞表型的鑒定，具體步驟為:細(xì)胞用胰酶消化后，用PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度為l*106/ml，分別加入下列鼠抗人單克隆抗體:CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE，置 4°C孵育 30min, PBS 洗 2 遍，直接進行流式細(xì)胞儀分析。
[0017]S4:體外誘導(dǎo)人類羊膜間充質(zhì)細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞，分為3個階段:誘導(dǎo)MSCs分化為巢蛋白陽性細(xì)胞(DMEM培養(yǎng)基+5mmol/L 2-巰基乙醇培養(yǎng)5h);誘導(dǎo)巢蛋白陽性細(xì)胞擴增并分化為前體細(xì)胞(細(xì)胞接種于涂有Matrigel的培養(yǎng)板，在DMEM培養(yǎng)基+B27+10 μ g/L bFGF+0.lmmol/L 2-巰基乙醇+ITS中培養(yǎng)7天)；誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞成熟(DMEM 培養(yǎng)基 +B27+10 μ g/L HGF+20mmol/L 煙酰胺 +0.lmmol/L 2-巰基乙醇 +LY294002 培養(yǎng)7?21天。
[0018]S5:誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)、功能鑒定RT-PCR方法=Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計對RNA樣品定量后通過RT-PCR進行產(chǎn)物擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測。誘導(dǎo)第28天，胰島素-1、Pdx-1、Pax-6mRNA表達(dá)顯著高于第7天和第14天。收集24h培養(yǎng)基，以放射免疫法測定胰島素累積分泌量。誘導(dǎo)7天后，胰島素分泌量急劇增加，而且隨著時間延長分泌量呈上升趨勢，各時間點相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意(P〈0.01)。胰島素刺激實驗:參照參考文獻，計算刺激指數(shù)(SI)。誘導(dǎo)第7天，細(xì)胞對葡萄糖的刺激可以產(chǎn)生反應(yīng)；誘導(dǎo)第14?28天細(xì)胞的基礎(chǔ)和刺激后分泌量均顯著增高，對葡萄糖的刺激更加敏感；第14天、第28天的SI較第7天顯著升高(P = 0.0008,0.003),但是第14天與第28天相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P = 0.051)。
[0019]實驗結(jié)果及分析如下:
[0020]1.原代培養(yǎng)的羊膜間充質(zhì)細(xì)胞在接種12_24h內(nèi)部分細(xì)胞開始貼壁生長，剛貼壁的細(xì)胞呈圓形，折光性強，隨后細(xì)胞胞質(zhì)逐漸展開，折光性減弱，一周后逐漸形成扁平單層細(xì)胞，呈漩渦狀生長或成簇生長，隨著細(xì)胞密度增加，胞體變得細(xì)長，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，生長速度同樣較慢，長滿皿底需2-3w。傳代后細(xì)胞生長迅速，接種6h后細(xì)胞即貼壁，形態(tài)、大小均一，在小牛血清存在的條件下，傳代細(xì)胞3-5d可增殖一倍。培養(yǎng)的細(xì)胞可以穩(wěn)定生長傳代，而且體外培養(yǎng)10代以后，細(xì)胞的增殖速度無明顯減緩。
[0021]2.人AMSCS的體外生長曲線表明，人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞生長周期約30d，第15d為生長高峰期。細(xì)胞經(jīng)過傳一代后3-4d，細(xì)胞增殖迅速，6d后又緩慢而平穩(wěn)增長。
[0022]3.取原代培養(yǎng)10天左右的羊膜間充質(zhì)細(xì)胞進行流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果表明細(xì)胞高表達(dá) CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166，但不表達(dá) CD34、CD45、HLA-DR，高表達(dá)CD49d0
[0023]4.人AMSCS的體外克隆化培養(yǎng)結(jié)果表明，培養(yǎng)14天左右的AMSCS均呈克隆樣生長，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的生長特性。
[0024]5.該細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的結(jié)果表明，在誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后胰島素-1、Pdx-U Pax-6mRNA表達(dá)增高，胰島素分泌量急劇增加。結(jié)果證明羊膜間充質(zhì)細(xì)胞有向胰島素分泌細(xì)胞方向分化的潛能。
[0025]人羊膜為半透明薄膜，無血管、神經(jīng)及淋巴管，有一定的彈性，厚度為
0.02-0.50mm，光鏡下可分為5層，即上皮層、基底膜層、致密層、纖維母細(xì)胞層及海綿層，羊膜間充質(zhì)細(xì)胞位于羊膜基底膜層，此細(xì)胞團能發(fā)育成人體的各種組織器官。由于羊膜是胚胎發(fā)育的早期產(chǎn)物，所以有理由認(rèn)為羊膜間充質(zhì)細(xì)胞是多能性的或其中含有多能性的干細(xì)胞，目前大量相關(guān)研究也表明羊膜細(xì)胞是一個良好的細(xì)胞移植材料。
[0026]Elwan和Okawa等利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的人羊膜細(xì)胞可以合成釋放兒茶酚胺(CA)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE) ;SakUragaWa等發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的羊膜細(xì)胞可以合成釋放乙酰膽堿(Ach)等神經(jīng)遞質(zhì)；2000年Uchida等又進一步證實羊膜細(xì)胞可以合成腦源性神經(jīng)生長移植(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3 (NT-3)、神經(jīng)生長因子(NGF)、IL-U IL-4、IL-6等多種因子，提示羊膜組織具有合成釋放神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)生物學(xué)功能，還可以分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等生物活性物質(zhì)，對胚胎神經(jīng)發(fā)育的早期階段具有重要調(diào)節(jié)作用。
[0027]胰島是多細(xì)胞組成的集合體，從單一的人羊膜間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為細(xì)胞的組成、空間排列與胰島完全一致的難度較大。雖然本研究誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞形態(tài)上與真正的胰島有一定的差別，僅是能夠表達(dá)Pdxl、Pax6等參與胰島素分泌調(diào)節(jié)的基因，而且可釋放一定量的胰島素，對葡萄糖刺激有一定的反應(yīng)性，具備了替代胰島移植物的潛能。
[0028]本發(fā)明并不局限于所述的實施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護范圍以權(quán)利要求書限定的范圍為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1.一種人類羊膜間充質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞方法，其包括如下步驟: S1:原代細(xì)胞的分離培養(yǎng):無菌條件下取產(chǎn)后棄置的新鮮胎盤，將羊膜與絨毛層鈍性分離，置于含有雙抗的D-HANKS液反復(fù)沖洗；將漂洗后的羊膜用眼科剪剪成約l*lmm碎塊，加入2.5G/L胰蛋白酶37°C消化lOmin，加入含5%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基終止消化，并輕柔吹打混勻后200目細(xì)胞篩過濾，過濾后的羊膜組織中加入1.0g/L II型膠原酶消化液，37°C消化0.5h，再次用5%小牛血清的RPMI1640終止消化，輕柔吹打混勻后200目細(xì)胞篩過濾，收集細(xì)胞，1000r/min離心5min，臺盼藍(lán)染色計數(shù)活細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1*106接種到25cm2培養(yǎng)瓶，加入含I %青鏈霉素，10ng/mlbFGF和10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基；置于37° C，飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)5%的C02培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)；倒置相差顯微鏡下每天觀察原代和傳代細(xì)胞的生長情況和形態(tài)特征，隔天換液一次，并攝片記錄，待細(xì)胞長滿70%瓶底時，用2.5g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞，消化過程中，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞消化情況，待大部分細(xì)胞胞體回縮、變圓，立刻終止消化，以1:2比例傳代培養(yǎng)，記為Pl代，傳代過程中，隔日換液一次，待細(xì)胞長滿70%瓶底重復(fù)以上步驟，傳代培養(yǎng)記為P2代，依次類推； 52:原代細(xì)胞免疫吸附法純化:上述細(xì)胞培養(yǎng)5天后，用0.125%胰酶，37 °C消化lOmin, 100rpm,離心6min收集，用PBS洗3次，接種在無血清RPMI1640培養(yǎng)基中，向細(xì)胞懸液內(nèi)加入鼠抗人Thyl.1單克隆抗體，作用濃度為20ng/ml，37°C下作用30min，該抗體將與間充質(zhì)來源的成纖維細(xì)胞特異性結(jié)合，細(xì)胞懸液離心除培養(yǎng)基，新鮮培養(yǎng)基洗2次除去抗體，全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，移入山羊抗鼠IgG包被過的培養(yǎng)皿中，37°C下孵育1H，將細(xì)胞懸液再次吸出離心，培養(yǎng)基洗一次，加入全培養(yǎng)基后移入PLL包被的培養(yǎng)皿中，調(diào)節(jié)接種密度為106/ml，第三天加入新鮮培養(yǎng)基1ml，第五天觀察細(xì)胞生長情況，胰酶消化后重新接種在PLL包被過的培養(yǎng)皿中，于37°C含5% C02空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)； 53:原代細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測:純化后的細(xì)胞取少量應(yīng)用流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞表型的鑒定，具體步驟為:細(xì)胞用胰酶消化后，用PBS液調(diào)整細(xì)胞濃度為l*106/ml，分別加入下列鼠抗人單克隆抗體:CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE，置 4°C孵育 30min, PBS 洗 2 遍，直接進行流式細(xì)胞儀分析； S4:體外誘導(dǎo)人類羊膜間充質(zhì)細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞，分為3個階段:誘導(dǎo)MSCs分化為巢蛋白陽性細(xì)胞(DMEM培養(yǎng)基+5mmol/L 2-巰基乙醇培養(yǎng)5h);誘導(dǎo)巢蛋白陽性細(xì)胞擴增并分化為前體細(xì)胞(細(xì)胞接種于涂有Matrigel的培養(yǎng)板，在DMEM培養(yǎng)基+B27+10 μ g/L bFGF+0.lmmol/L 2-巰基乙醇+ITS中培養(yǎng)7天)；誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞成熟(DMEM 培養(yǎng)基 +B27+10 μ g/L HGF+20mmol/L 煙酰胺 +0.lmmol/L 2-巰基乙醇 +LY294002 培養(yǎng)7?21天； S5:誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)、功能鑒定RT-PCR方法=Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計對RNA樣品定量后通過RT-PCR進行產(chǎn)物擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測；誘導(dǎo)第28天，胰島素-l、Pdx-l、Pax-6mRNA表達(dá)顯著高于第7天和第14天；收集24h培養(yǎng)基，以放射免疫法測定胰島素累積分泌量；進行胰島素刺激實驗。
【文檔編號】C12N5/077GK106011048SQ201510134763
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年3月25日
【發(fā)明人】吳衛(wèi)江
【申請人】吳衛(wèi)江