小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法
【專利摘要】本發(fā)明提出一種小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法，其步驟包括：原代神經(jīng)干細(xì)胞的分離和克隆培養(yǎng)；神經(jīng)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；單細(xì)胞克隆及鑒定；成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)；RT-PCR檢測誘導(dǎo)細(xì)胞Ⅱ型膠原和Aggrecan表達(dá)；Ⅱ型膠原組化檢測；番紅O染色及阿利新藍(lán)染色鑒定。本發(fā)明的體外誘導(dǎo)形成軟骨細(xì)胞的方法，可以獲得較高比例的分化細(xì)胞，作為一種正常組織充填物，可應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)缺損及整形美容專業(yè)中組織缺損的修復(fù)和重建。
【專利說明】
小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 機(jī)械損傷和關(guān)節(jié)退行性改變常導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷發(fā)生，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)無血管神經(jīng)分 布，軟骨細(xì)胞細(xì)胞密度低且缺乏正常組織修復(fù)的生長因子，因而缺乏自我修復(fù)能力。自體軟 骨移植雖能有效改善軟骨缺損，但是自體軟骨細(xì)胞來源困難W及供體部位二次損傷束縛軟 骨細(xì)胞移植和軟骨工程學(xué)發(fā)展。因此尋找一種細(xì)胞來源豐富且能夠產(chǎn)生足夠的軟骨細(xì)胞外 基質(zhì)的細(xì)胞作為種子細(xì)胞治療關(guān)節(jié)軟骨損傷具有重要臨床意義。
[0003] 神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcell，NSCs)是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細(xì) 胞，它可W通過不對(duì)等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞。需要強(qiáng)調(diào)的是，在腦脊髓等所 有神經(jīng)組織中，不同的神經(jīng)干細(xì)胞類型產(chǎn)生的子代細(xì)胞種類不同，分布也不同。神經(jīng)干細(xì)胞 可用于治療中風(fēng)（腦梗塞、腦出血）、小腦萎縮癥（腦性擁痕）、脊髓損傷、腦萎縮、腦外傷后 遺癥、帕金森氏綜合癥、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、多發(fā)性硬化、面擁、多系統(tǒng)萎縮癥、老年癡呆癥、視神 經(jīng)萎縮、顛葉癒痛等多種疾病。主要原因是包括：患病部位組織損傷后釋放各種趨化因子， 可W吸引神經(jīng)干細(xì)胞聚集到損傷部位，并在局部微環(huán)境的作用下分化為不同種類的細(xì)胞， 修復(fù)及補(bǔ)充損傷的神經(jīng)細(xì)胞。由于缺血、缺氧導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，使局 部通透性增加，另外在多種黏附分子的作用下，神經(jīng)干細(xì)胞可W透過血腦屏障，高濃度的聚 集在損傷部位；神經(jīng)干細(xì)胞可W分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進(jìn)損傷細(xì)胞的修復(fù)；另外，神經(jīng) 干細(xì)胞可W增強(qiáng)神經(jīng)突觸之間的聯(lián)系，建立新的神經(jīng)環(huán)路。
[0004] 目前，對(duì)于哺乳動(dòng)物胚胎階段和成年動(dòng)物的特定腦區(qū)存在神經(jīng)干細(xì)胞得到不斷證 實(shí)，海馬區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞更是同哺乳動(dòng)物的記憶能力密切相關(guān)，對(duì)該區(qū)域源性的神經(jīng)干細(xì) 胞的培養(yǎng)成功對(duì)干細(xì)胞應(yīng)用于各種組織修復(fù)領(lǐng)域提供了理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明應(yīng)用特定的誘導(dǎo)分化液在體外將小鼠小鼠海馬干細(xì)胞定向分化為軟骨細(xì) 胞，具體的方法步驟包括：
[0006] S1 :原代神經(jīng)干細(xì)胞的分離和克隆化培養(yǎng)：將新生昆明種小鼠斷頸處死后，置于 體積分?jǐn)?shù)為0. 75的乙醇中浸泡消毒，無菌條件下取腦，仔細(xì)去除腦膜和血管，剝離出大腦 半球用D-Hank' S清洗，在體視顯微鏡下分離出海馬組織，用眼科剪剪碎，200目不誘鋼篩 網(wǎng)過濾，DMEM/F12培養(yǎng)基加 B27,濃度10旨/1，堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因子終 濃度均為20ug/l，稀釋細(xì)胞后，W 1. 5 X IOVl接種于培養(yǎng)瓶，37°C，體積分?jǐn)?shù)為0. 05的C〇2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0007] S2 :神經(jīng)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：待原代細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進(jìn)行傳代培 養(yǎng)，采用嚴(yán)格無菌操作，在倒置顯微鏡下用自制玻璃微針將其中的大克隆球切成數(shù)塊，小 克隆球不作處理，繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)克隆球生長情況，5~7天傳代1次，方法同前；
[0008] S3 :單細(xì)胞克隆及鑒定：用有限稀釋法獲取單細(xì)胞克隆，離屯、收集細(xì)胞后，用1ml 無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，用吸管吸取后移入1. 5ml的邱P管中，W 5ml -次性注射器反 復(fù)抽吸吹打細(xì)胞沉淀，約50次左右，將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后，用200ul槍頭移入96孔板 中，W 1:10的倍比稀釋法移入96孔板的各孔中，相差顯微鏡下觀察獲得的單細(xì)胞培養(yǎng)孔， 標(biāo)記后將孔內(nèi)的細(xì)胞移入50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，待次代克隆形成后連續(xù)傳代，對(duì)原代克隆及第20 代亞克隆行化stin免疫巧光染色鑒定。
[0009] S4 :成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)：取生長良好的P4代細(xì)胞，W IX l〇5/ml接種于6孔板 內(nèi)，加入含10% FBS的DMEM-L完全培養(yǎng)基，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。然后分 別更換為含0、10、50、lOOng/ml CDMP-1的軟骨誘導(dǎo)液（conditioned medium, CM)連續(xù)誘導(dǎo) 3周，每隔3天更換CM并加入相應(yīng)濃度的CDMP-1。CM成分為含10-7M地塞米松、50 μ g/ml 維生素 C、1 % FBS、1 % ITS+、40 μ g/ml k脯氨酸和100 μ g/ml丙酬酸鋼的DMEM高糖溶液。
[0010] S5 :RT-PCR檢測誘導(dǎo)細(xì)胞II型膠原和Aggrecan表達(dá)：不同濃度CDMP-1誘 導(dǎo)NSCs3周后，按Trizol說明書提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR。Collagen II引物序列：上 游 TTCAGCTATGGAGATGACAATC，下游 AGAGTCCTAGAGTGACTGAG，擴(kuò)增片段長度為 472bp ; Aggrecan 引物序列：上游 TGACCACTTTACTCTGGGTTTTCG，下游 ACACGATGCCTTTCACCACG， 擴(kuò)增片段長度為46化P ;GAPDH引物序列：上游引物ACCACAGTCCATGCCATCAC，下游： TCCACCACCCTGTTGCTGTA，擴(kuò)增片段長度為 450bp。
[0011] RT和PCR步驟按常規(guī)進(jìn)行。反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3min ;然后執(zhí)行40個(gè)循環(huán)： 94°C變性 30s，退火 30s，退火溫度 Collagen II 為 56°C，Aggrecan 為 52°C ;72°C延伸 Imin ; 最后總延伸72°C 5min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ 1，在含有Goldview的2%瓊脂糖 凝膠中電泳，將電泳凝膠置于配0忿P紐tnin錢AC凝膠成像系統(tǒng)照相。 陽01引 S6 : II型膠原組化檢測：將lOOng/ml CDMP-1誘導(dǎo)21d的NSCs消化制作細(xì)胞爬片。 4%多聚甲醒4°C固定30min，用含0. 1% Triton溶液破膜30min，用含3%肥02的PBS溶 液室溫滅活15min，山羊血清室溫封閉30min，小屯、甩干封閉液，PBS沖洗3次，每次3min。 按1 :100稀釋兔抗人II型膠原多克隆抗體，4°C解育過夜。應(yīng)用SABC免疫組織化學(xué)染色試 劑盒，按照試劑盒說明操作，最后用DAB試劑盒顯色，檢測組織中II型膠原的表達(dá)，陽性反 應(yīng)呈棟黃色。WPBS代替一抗作陰性對(duì)照染色。
[0013] S7 :番紅0染色及阿利新藍(lán)染色：將NSCs按照IX 105cells/ml接種于6孔板內(nèi)， 采用含l(K)ng/ml CDMP-1的誘導(dǎo)液培養(yǎng)21d，PBS漂洗3min。4%多聚甲醒4°C固定30min。 采用1 %蘇木精染色液染色lOmin，PBS漂洗lOmin，用0. 001 % FCF溶液染色5min，1 %冰醋 酸迅速分化10-15秒。然后用0. 1 %番紅0染色5min，PBS漂洗后置于倒置顯微鏡系統(tǒng)成 像。;另將NSCs按照1 X 105cells/ml接種于12孔板內(nèi)，采用含lOOng/ml CDMP-1的誘導(dǎo)液 培養(yǎng)21d，PBS漂洗3min。4%多聚甲醒4°C固定30min。漂洗后用1%阿利新藍(lán)冰醋酸溶液 (P肥.5)室溫染色30min，蒸饋水漂洗2min，用0. 1 %中性核固紅溶液染色5min。蒸饋水沖 洗后置于倒置顯微鏡系統(tǒng)成像。
[0014] 本發(fā)明的體外將小鼠海馬干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞的方 陽0巧]法，利用CDMP-1的軟骨誘導(dǎo)液（conditioned medium, CM)對(duì)小鼠海馬干細(xì)胞進(jìn)行 誘導(dǎo)分化，明顯提高了成軟骨誘導(dǎo)的效率。
【附圖說明】
[0016] 通過下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得 顯而易見。其中：
[0017] 圖1所示為本發(fā)明的方法步驟流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 材料試劑DMEM-L培養(yǎng)基、胎牛血清（FB巧、膜蛋白酶購置于Gibco公司；CDMP-1 購置于趴protech公司；ITS+、k脯氨酸、丙酬酸鋼、阿利辛藍(lán)等購置于Sigma公司； anti-human CD34、CD44、CD105 購置于 Biolegend 公司，兔抗人 II 型膠原抗體（Santa Cruz)，F(xiàn)ITC 標(biāo)記或切3 標(biāo)記的羊抗兔二抗（sigma) ;TRIzol Reagent (Invitrogen)、 ReverTra Dash〇OY0B0)、2XTaq PCR MasterMixaiANGEN)，GoldView;SABC，DAB顯色試劑 盒；PCR儀度iometra，Τ3型），巧光倒置顯微鏡（OLYMPUS CX21FS1)
[0019] 參見圖1，本發(fā)明的所述方法包括如下步驟：
[0020] S1 :原代神經(jīng)干細(xì)胞的分離和克隆化培養(yǎng)：將新生昆明種小鼠斷頸處死后，置于 體積分?jǐn)?shù)為0. 75的乙醇中浸泡消毒，無菌條件下取腦，仔細(xì)去除腦膜和血管，剝離出大腦 半球用D-Hank' S清洗，在體視顯微鏡下分離出海馬組織，用眼科剪剪碎，200目不誘鋼篩 網(wǎng)過濾，DMEM/F12培養(yǎng)基加 B27,濃度10旨/1，堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因子終 濃度均為20ug/l，稀釋細(xì)胞后，W 1. 5 X IOVl接種于培養(yǎng)瓶，37°C，體積分?jǐn)?shù)為0. 05的C〇2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0021] S2 :神經(jīng)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：待原代細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進(jìn)行傳代培 養(yǎng)，采用嚴(yán)格無菌操作，在倒置顯微鏡下用自制玻璃微針將其中的大克隆球切成數(shù)塊，小 克隆球不作處理，繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)克隆球生長情況，5~7天傳代1次，方法同前；
[0022] S3 :單細(xì)胞克隆及鑒定：用有限稀釋法獲取單細(xì)胞克隆，離屯、收集細(xì)胞后，用1ml 無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，用吸管吸取后移入1. 5ml的邱P管中，W 5ml -次性注射器反 復(fù)抽吸吹打細(xì)胞沉淀，約50次左右，將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后，用200ul槍頭移入96孔板 中，W 1:10的倍比稀釋法移入96孔板的各孔中，相差顯微鏡下觀察獲得的單細(xì)胞培養(yǎng)孔， 標(biāo)記后將孔內(nèi)的細(xì)胞移入50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，待次代克隆形成后連續(xù)傳代，對(duì)原代克隆及第20 代亞克隆行化stin免疫巧光染色鑒定。
[0023] S4 :成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)：取生長良好的P4代細(xì)胞，W IX l〇5/ml接種于6孔板 內(nèi)，加入含10% FBS的DMEM-L完全培養(yǎng)基，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。然后分 別更換為含0、10、50、lOOng/ml CDMP-1的軟骨誘導(dǎo)液（conditioned medium, CM)連續(xù)誘導(dǎo) 3周，每隔3天更換CM并加入相應(yīng)濃度的CDMP-1。CM成分為含10-7M地塞米松、50 μ g/ml 維生素 C、1 % FBS、1 % ITS+、40 μ g/ml k脯氨酸和100 μ g/ml丙酬酸鋼的DMEM高糖溶液。
[0024] S5 :RT-PCR檢測誘導(dǎo)細(xì)胞II型膠原和Aggrecan表達(dá)：不同濃度CDMP-1誘 導(dǎo)NSCs3周后，按Trizol說明書提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR。Collagen II引物序列：上 游 TTCAGCTATGGAGATGACAATC，下游 AGAGTCCTAGAGTGACTGAG，擴(kuò)增片段長度為 472bp ; Aggrecan 引物序列：上游 TGACCACTTTACTCTGGGTTTTCG，下游 ACACGATGCCTTTCACCACG， 擴(kuò)增片段長度為46化P ;GAPDH引物序列：上游引物ACCACAGTCCATGCCATCAC，下游： TCCACCACCCTGTTGCTGTA，擴(kuò)增片段長度為 450bp。
[00巧]RT和PCR步驟按常規(guī)進(jìn)行。反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3min ;然后執(zhí)行40個(gè)循環(huán)： 94°C變性 30s，退火 30s，退火溫度 Collagen II 為 56°C，Aggrecan 為 52°C ;72°C延伸 Imin; 最后總延伸72°C 5min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ 1，在含有Goldview的2%瓊脂糖 凝膠中電泳，將電泳凝膠置于B i oSpec tr un役AC凝膠成像系統(tǒng)照相。
[0026] S6 : II型膠原組化檢測：將lOOng/ml CDMP-1誘導(dǎo)21d的NSCs消化制作細(xì)胞爬片。 4%多聚甲醒4°C固定30min，用含0. 1% Triton溶液破膜30min，用含3%肥02的PBS溶 液室溫滅活15min，山羊血清室溫封閉30min，小屯、甩干封閉液，PBS沖洗3次，每次3min。 按1 :100稀釋兔抗人II型膠原多克隆抗體，4°C解育過夜。應(yīng)用SABC免疫組織化學(xué)染色試 劑盒，按照試劑盒說明操作，最后用DAB試劑盒顯色，檢測組織中II型膠原的表達(dá)，陽性反 應(yīng)呈棟黃色。WPBS代替一抗作陰性對(duì)照染色。
[0027] S7 :番紅0染色及阿利新藍(lán)染色：將NSCs按照1 X 105cells/ml接種于6孔板內(nèi)， 采用含l(K)ng/ml CDMP-1的誘導(dǎo)液培養(yǎng)21d，PBS漂洗3min。4%多聚甲醒4°C固定30min。 采用1 %蘇木精染色液染色lOmin，PBS漂洗lOmin，用0. 001 % FCF溶液染色5min，1 %冰醋 酸迅速分化10-15秒。然后用0. 1 %番紅0染色5min，PBS漂洗后置于倒置顯微鏡系統(tǒng)成 像。；另將NSCs按照1 X 105cells/ml接種于12孔板內(nèi)，采用含10化g/mlCDMP-1的誘導(dǎo)液 培養(yǎng)21d，PBS漂洗3min。4%多聚甲醒4°C固定30min。漂洗后用1%阿利新藍(lán)冰醋酸溶液 (P肥.5)室溫染色30min，蒸饋水漂洗2min，用0. 1 %中性核固紅溶液染色5min。蒸饋水沖 洗后置于倒置顯微鏡系統(tǒng)成像。
[0028] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析如下：
[0029] 1.不同濃度CDMP-1誘導(dǎo)4山細(xì)胞形態(tài)變化不大，仍保留NSCs典型的梭形，隨著 CDMP-1濃度增加，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。誘導(dǎo)7d后，5化g/ml和10化g/ml組細(xì)胞增殖明顯， 體積變大，細(xì)胞形態(tài)逐漸由長梭形向多邊形、類圓形轉(zhuǎn)化，CM組和lOng/ml組細(xì)胞僅表現(xiàn)出 一定程度細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞仍為長梭形。繼續(xù)誘導(dǎo)至21d，各組細(xì)胞體積均不同程度增大， 數(shù)量增多，細(xì)胞由單層變成多層生長。50ng和l(K)ng組細(xì)胞得寬大扁平，細(xì)胞胞漿豐富，并 分泌大量基質(zhì)。lOOng組可見局部細(xì)胞集聚形成團(tuán)塊狀結(jié)晶。
[0030] 2. NSCs用含不同濃度CDMP-1的CM導(dǎo)3周后，結(jié)果顯示隨著CDMP-1濃度的增加， II型膠原和Aggrecan在mRNA水平的表達(dá)增加。II型膠原表達(dá)量各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義（P < 0. 05)。Aggrecan的表達(dá)CM組和lOng組之間差異量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其它各組其 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0. 05)。 陽〇3U 3.根據(jù)W上RT-PCR結(jié)果并查閱文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)選取lOOng/ml CDMP-1誘導(dǎo)NSCs,檢測 NSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)組織學(xué)變化。結(jié)果顯示II型膠原免疫組化染色陽性表達(dá)，阿利新藍(lán)染 色處于密集處的細(xì)胞間隙，尤其是細(xì)胞團(tuán)塊狀聚集結(jié)節(jié)處無定形物質(zhì)染色呈強(qiáng)陽性，番紅0 染色可見胞漿呈紅色，細(xì)胞密集處可見無定型物質(zhì)呈現(xiàn)強(qiáng)陽性。
[0032] 本發(fā)明并不局限于所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公 開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍W權(quán)利要求書限定的范圍為 準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種將小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的方法，其包括如下步驟： 51 :原代神經(jīng)干細(xì)胞的分離和克隆化培養(yǎng)：將新生昆明種小鼠斷頸處死后，置于體積 分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇中浸泡消毒，無菌條件下取腦，仔細(xì)去除腦膜和血管，剝離出大腦半球 用D-Hank' s清洗，在體視顯微鏡下分離出海馬組織，用眼科剪剪碎，200目不銹鋼篩網(wǎng)過 濾，DMEM/F12培養(yǎng)基加 B27,濃度10g/L，堿性成纖維細(xì)胞生長因子和表皮生長因子終濃度 均為20ug/L，稀釋細(xì)胞后，以1. 5 X 107/L接種于培養(yǎng)瓶，37°C，體積分?jǐn)?shù)為0. 05的C02培養(yǎng) 箱培養(yǎng)； 52 :神經(jīng)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：待原代細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進(jìn)行傳代培養(yǎng)， 采用嚴(yán)格無菌操作，在倒置顯微鏡下用自制玻璃微針將其中的大克隆球切成數(shù)塊，小克隆 球不作處理，繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)克隆球生長情況，5~7天傳代1次，方法同前； 53 :單細(xì)胞克隆及鑒定：用有限稀釋法獲取單細(xì)胞克隆，離心收集細(xì)胞后，用lml無血 清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，用吸管吸取后移入1. 5ml的Epp管中，以5ml -次性注射器反復(fù)抽 吸吹打細(xì)胞沉淀，約50次左右，將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后，用200ul槍頭移入96孔板中，以 1:10的倍比稀釋法移入96孔板的各孔中，相差顯微鏡下觀察獲得的單細(xì)胞培養(yǎng)孔，標(biāo)記后 將孔內(nèi)的細(xì)胞移入50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，待次代克隆形成后連續(xù)傳代，對(duì)原代克隆及第20代亞克 隆行Nestin免疫熒光染色鑒定； 54 :成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)：取生長良好的P4代細(xì)胞，以1 X 105/ml接種于6孔板內(nèi)，加 入含10% FBS的DMEM-L完全培養(yǎng)基，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。然后分別更 換為含〇、10、50、100ng/ml CDMP-1的軟骨誘導(dǎo)液連續(xù)誘導(dǎo)3周，每隔3天更換CM并加入相 應(yīng)濃度的CDMP-1，誘導(dǎo)液成分為含10-7M地塞米松、50 μ g/ml維生素 C、1 % FBS、1 % ITS+、 40 μ g/ml L-脯氨酸和100 μ g/ml丙酮酸鈉的DMEM高糖溶液； 55 :RT-PCR檢測誘導(dǎo)細(xì)胞II型膠原和Aggrecan表達(dá)：不同濃度CDMP-1誘導(dǎo)NSCs3周 后，按Trizol說明書提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3min ;然后執(zhí)行40 個(gè)循環(huán)：94°C變性 30s，退火 30s，退火溫度 Collagen II 為 56°C，Aggrecan 為 52°C ;72°C延 伸lmin ;最后總延伸72°C 5min ;反應(yīng)結(jié)束后取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ 1，在含有Goldview的2% 瓊脂糖凝膠中電泳，將電泳凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)照相； 56. II型膠原組化檢測：將100ng/ml CDMP-1誘導(dǎo)21d的NSCs消化制作細(xì)胞爬片；4% 多聚甲醛4°C固定30min，用含0. 1% Triton溶液破膜30min，用含3%H202的PBS溶液室 溫滅活15min,山羊血清室溫封閉30min，小心甩干封閉液，PBS沖洗3次，每次3min。按1 : 100稀釋兔抗人II型膠原多克隆抗體，4°C孵育過夜。應(yīng)用SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒， 按照試劑盒說明操作，最后用DAB試劑盒顯色，檢測組織中II型膠原的表達(dá)，陽性反應(yīng)呈棕 黃色。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照染色； 57 :番紅0染色及阿利新藍(lán)染色：將NSCs按照1 X 105cells/ml接種于6孔板內(nèi)，采用 含100ng/ml CDMP-1的誘導(dǎo)液培養(yǎng)21d，PBS漂洗3min ;4%多聚甲醛4°C固定30min。采用 1%蘇木精染色液染色l〇min，PBS漂洗10min，用0. 001% FCF溶液染色5min，1%冰醋酸迅 速分化10-15秒；然后用0. 1 %番紅0染色5min，PBS漂洗后置于倒置顯微鏡系統(tǒng)成像；另 將NSCs按照lX105cells/ml接種于12孔板內(nèi)，采用含100ng/ml CDMP-1的誘導(dǎo)液培養(yǎng) 21d，PBS漂洗3min ;4%多聚甲醛4°C固定30min ;漂洗后用1%阿利新藍(lán)冰醋酸溶液；室溫 染色30min，蒸餾水漂洗2min，用0. 1 %中性核固紅溶液染色5min ;蒸餾水沖洗后置于倒置 顯微鏡系統(tǒng)成像。
【文檔編號(hào)】C12N5/077GK106011054SQ201510131755
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2015年3月24日
【發(fā)明人】華國紅
【申請(qǐng)人】華國紅