一種人正常前列腺上皮神經(jīng)內(nèi)分泌亞型細胞系的建立方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種人正常前列腺上皮神經(jīng)內(nèi)分泌亞型細胞系的建立方法，包括NHPrE1細胞系的培養(yǎng)、神經(jīng)內(nèi)分泌亞型細胞NTU2分離和純化、NTU2細胞的擴增、NTU2細胞克隆化、NTU2細胞體外鑒定、NTU2細胞體內(nèi)鑒定等步驟。本發(fā)明本細胞系(NTU2)的建立為前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌細胞(NEC)的功能研究；神經(jīng)內(nèi)分泌細胞在前列腺癌發(fā)生和發(fā)展中腫瘤生物學作用及其與腫瘤細胞相互分子作用的研究；以及激素非依賴型前列腺癌(CRPC)的新藥篩選開發(fā)研究提供基礎實驗材料。
【專利說明】
一種人正常前列腺上皮神經(jīng)內(nèi)分泌亞型細胞系的建立方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種人正常前列腺上皮神經(jīng)內(nèi)分泌亞型細胞系的建立方法。【背景技術】
[0002]神經(jīng)內(nèi)分泌細胞(NEC)是目前公認的終末分化細胞，是肺癌、胃腸道癌和前列腺癌等腫瘤中常見的細胞類型。具有抗放、化療的特征。其終末分化特性制約了其在體外的基礎研究及新藥篩選等應用研究的開展。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的在于為前列腺癌去激素治療后前列腺癌組織內(nèi)細胞的神經(jīng)內(nèi)分泌化導致的前列腺癌抗放、化療的研究，以及相關新藥的篩選、開發(fā)等研究，提供基礎實驗材料的人正常前列腺上皮神經(jīng)內(nèi)分泌亞型細胞系的建立方法。
[0004]本發(fā)明的技術解決方案是:一種人正常前列腺上皮神經(jīng)內(nèi)分泌亞型細胞系(本細胞系是
【申請人】建立的細胞系，縮寫為NTU2)的建立方法，其特征是:包括下列步驟:(1)NHPrEl細胞系的培養(yǎng):1:1 DMEM/F12,加5% FBS液，1% ITS，5ng/mL EGF，50ng/mL BPE;于5% C02，37 °C培養(yǎng);2 — 3天換液一次，1:3-4傳代；(2)神經(jīng)內(nèi)分泌亞型細胞NTU2分離:將NHPrEl細胞培養(yǎng)物用胰蛋白酶消化后，1000 RPM 離心收集細胞，IX PBS洗滌三次后，用3% BSA于4°C封閉20分鐘;加入1:50鼠抗人ChG A抗體 (sigma)，4°C孵育30分鐘后，用IX PBS洗滌三次;加入羊抗鼠磁珠抗體，4°C孵育30分鐘后， 用mini MACS ? Separator進行細胞分離；(3)NTU2細胞的擴增:將分離所得陽性細胞用1:1 DMEM/F12培養(yǎng)液，加5% FBS，1% ITS， 5ng/mL EGF，50ng/mL BPE;于5% C02,37°C培養(yǎng);每3天換液一次；(4)NTU2細胞克隆化:將擴增NTU2細胞用1:1 DMEM/F12培養(yǎng)液，加5% FBS，1% ITS，5ng/ mL EGF，50ng/mL BPE;按0.5個細胞/孔接種至96孔板;每3天換液一次，生長成單細胞克隆后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶用上述培養(yǎng)基進行擴增；(5)NTU2細胞體外鑒定:14mm圓型蓋玻片用多聚賴氨酸包被后放入24孔板，接種NTU2細胞，生長至60 —70%密度后，多聚甲醛固定，PBS充分洗滌后，分別用神經(jīng)內(nèi)分泌細胞標志分子抗體ChG A和Syn進行細胞免疫化學分析；(6)NTU2細胞體內(nèi)鑒定:NTU2細胞按20%比例分別與PC-3和DU145細胞混合后，應用組織重組方法分別種植至裸鼠腎包膜下；成瘤后取出瘤體，多聚甲醛固定，石臘包埋切片，用神經(jīng)內(nèi)分泌標志分子進行免疫熒光組織化學分析。
[0005]本發(fā)明NTU2細胞系用于前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌細胞(NEC)的功能研究。用于神經(jīng)內(nèi)分泌細胞在前列腺癌發(fā)生和發(fā)展中腫瘤生物學作用及其與腫瘤細胞相互分子作用的研究。用于激素非依賴型前列腺癌(CRPC)的新藥篩選開發(fā)研究。
[0006]本發(fā)明本細胞系(NTU2)的建立為前列腺神經(jīng)內(nèi)分泌細胞(NEC)的功能研究、神經(jīng)內(nèi)分泌細胞在前列腺癌發(fā)生和發(fā)展中腫瘤生物學作用及其與腫瘤細胞相互分子作用的研究、以及激素非依賴型前列腺癌(CRPC)的新藥篩選開發(fā)研究提供基礎實驗材料。
[0007]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。【具體實施方式】
[0008]一種人正常前列腺上皮神經(jīng)內(nèi)分泌亞型細胞系(NTU2)的建立方法，包括下列步驟:(1)NHPrEl細胞系的培養(yǎng):1:1 DMEM/F12,加5% FBS液，1% ITS，5ng/mL EGF，50ng/mL BPE;于5% C02，37 °C培養(yǎng);2 — 3天換液一次，1:3-4傳代；(2)神經(jīng)內(nèi)分泌亞型細胞NTU2分離:將NHPrEl細胞培養(yǎng)物用胰蛋白酶消化后，1000 RPM 離心收集細胞，IX PBS洗滌三次后，用3% BSA于4°C封閉20分鐘;加入1:50鼠抗人ChG A抗體 sigma，4°C孵育30分鐘后，用IX PBS洗滌三次;加入羊抗鼠磁珠抗體，4°C孵育30分鐘后，用 miniMACS ? Separator進行細胞分離；(3)NTU2細胞的擴增:將分離所得陽性細胞用1:1 DMEM/F12培養(yǎng)液，加5% FBS，1% ITS， 5ng/mL EGF，50ng/mL BPE;于5% C02,37°C培養(yǎng);每3天換液一次；(4)NTU2細胞克隆化:將擴增NTU2細胞用1:1 DMEM/F12培養(yǎng)液，加5% FBS，1% ITS，5ng/ mL EGF，50ng/mL BPE;按0.5個細胞/孔接種至96孔板;每3天換液一次，生長成單細胞克隆后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶用上述培養(yǎng)基進行擴增；(5)NTU2細胞體外鑒定:a.培養(yǎng)細胞經(jīng)戊二醛固定，2%瓊脂糖包埋后，戊二醛再固定后進行電鏡制樣觀察。
[0009]b.14mm圓型蓋玻片用多聚賴氨酸包被后放入24孔板，接種NTU2細胞，生長至60 — 70%密度后，多聚甲醛固定，IX PBS充分洗滌后，分別用神經(jīng)內(nèi)分泌細胞標志分子抗體ChG A 和Syn進行細胞免疫化學分析；(6)NTU2細胞體內(nèi)鑒定:NTU2細胞按20%比例分別與PC-3和DU145細胞混合后，應用組織重組方法分別種植至裸鼠腎包膜下；成瘤后取出瘤體，多聚甲醛固定，石臘包埋切片，用神經(jīng)內(nèi)分泌標志分子進行免疫組織化學分析。[0〇1〇]細胞建系材料來源:永生化人正常前列腺上皮祖細胞系(NHPrEl)。該細胞系由江明教授建系。并已轉(zhuǎn)入GFP作為分子標志。
【主權項】
1.一種人正常前列腺上皮神經(jīng)內(nèi)分泌亞型細胞系的建立方法，其特征是:包括下列步 驟:(1)人正常前列腺上皮祖細胞系NHPrEl細胞系的培養(yǎng):1:1 DMEM/F12,加5% FBS，1% ITS，5ng/mL EGF，50ng/mL BPE;于5% C02,37°C培養(yǎng);2 — 3天換液一次，1:3-4傳代；(2)人正常前列腺上皮神經(jīng)內(nèi)分泌亞型細胞系NTU2的分離和純化:將NHPrEl培養(yǎng)細胞 用胰蛋白酶酶消化后，1000 RPM離心收集細胞，IX PBS洗滌三次后，用3% BSA于4°C封閉20 分鐘；加入1:50鼠抗人ChG A抗體，4°C孵育30分鐘后，用1 X PBS洗滌三次;加入羊抗鼠磁珠 抗體，4°C孵育30分鐘后，用mini MACS? Separator進行細胞分離；(3)NTU2細胞的擴增:將分離所得陽性細胞用1:1 DMEM/F12培養(yǎng)液，加5% FBS，1% ITS， 5ng/mL EGF，50ng/mL BPE;于5% C02,37°C 培養(yǎng);每3天換液一次；(4)NTU2細胞克隆化:將擴增NTU2細胞用1:1 DMEM/F12培養(yǎng)液，加5% FBS，1% ITS，5ng/ mL EGF，50ng/mL BPE;按0.5個細胞/孔接種至96孔板;每3天換液一次，生長成單細胞克隆 后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶用上述培養(yǎng)基進行擴增。2.根據(jù)權利要求1所述的人正常前列腺上皮神經(jīng)內(nèi)分泌亞型細胞系的建立方法，其特 征是:步驟(4)后還進行NTU2細胞體外鑒定:14 mm圓型蓋玻片用多聚賴氨酸包被后放入24 孔板，接種NTU2細胞，生長至60 — 70%密度后，多聚甲醛固定，1 X PBS充分洗滌后，分別用神 經(jīng)內(nèi)分泌細胞標志分子抗體Chromogranin A和Synapsin進行細胞免疫化學分析。3.根據(jù)權利要求1所述的人正常前列腺上皮神經(jīng)內(nèi)分泌亞型細胞系的建立方法，其特 征是:步驟(4)后還進行NTU2細胞體內(nèi)鑒定:NTU2細胞按20%比例分別與人進展期前列腺癌 PC-3和DU145細胞混合后，應用組織重組方法分別種植至裸鼠腎包膜下；成瘤后取出瘤體， 多聚甲醛固定，石臘包埋切片，用神經(jīng)內(nèi)分泌標志分子進行免疫組織化學分析。
【文檔編號】C12N5/079GK106011064SQ201610385303
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】江明, 張沖, 張永輝, 陳苗苗, 鄂群, 曹靖晨, 王海燕
【申請人】南通大學