一種豬嵴病毒的培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種豬嵴病毒的培養(yǎng)方法，用MDCK細(xì)胞成功地對(duì)豬嵴病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)，并進(jìn)行了傳代，成功獲得了可以用于豬嵴病毒分離傳代的細(xì)胞系，利用PCR方法證實(shí)了其傳代培養(yǎng)分離病毒的效果，首次提出了一種能用于豬嵴病毒培養(yǎng)的細(xì)胞系，具有一定的創(chuàng)新性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
_種豬嵴病毒的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬嵴病毒的培養(yǎng)方法。
[0002]背景內(nèi)容
[0003]目前，通過(guò)國(guó)內(nèi)外資料查詢(xún)，尚未找到合適豬嵴病毒傳代的細(xì)胞系，為了能夠找到適合豬嵴病毒傳代的細(xì)胞系，用于豬嵴病毒的增殖傳代，為進(jìn)一步進(jìn)行豬嵴病毒疫苗的研制以及診斷防制方法的開(kāi)發(fā)，提供有效的途徑。本試驗(yàn)中用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系有:BHK，VERO，293T，HELA，PK-15，ST等，但這些細(xì)胞都不能實(shí)現(xiàn)其穩(wěn)定傳代。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供一種豬嵴病毒的培養(yǎng)方法，應(yīng)用MDCK細(xì)胞成功地對(duì)豬嵴病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)，并進(jìn)行了傳代，成功獲得了可以用于豬嵴病毒分離傳代的細(xì)胞系。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0006]—種豬嵴病毒的培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0007]SI復(fù)蘇MDCK細(xì)胞后，連續(xù)傳代若干次，待細(xì)胞狀態(tài)良好；
[0008]S2將帶有豬嵴病毒的糞便樣品稀釋?zhuān)x心，離心后的上清過(guò)濾到無(wú)菌離心管中，SP為接種病毒液；
[0009]S3將鵝脫養(yǎng)膽酸⑶CA用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)琠20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0010]S4進(jìn)行豬嵴病毒接種前I天，將步驟SI得到的MDCK細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，細(xì)胞數(shù)量以第二天接種時(shí)細(xì)胞鋪滿(mǎn)所述細(xì)胞培養(yǎng)瓶的底部達(dá)90%的為準(zhǔn)；
[0011 ] S5對(duì)步驟S4中最終得到的MDCK細(xì)胞利用步驟S2的接種病毒液進(jìn)行接種病毒，接種時(shí)細(xì)胞呈單層鋪滿(mǎn)狀態(tài)且長(zhǎng)勢(shì)良好:
[0012]5.1)先棄去步驟細(xì)胞培養(yǎng)瓶中原有的培養(yǎng)液，用I XPBS洗細(xì)胞表面然后除盡殘留的PBS，然后將用I XPBS洗細(xì)胞表面并除盡殘留的PBS的細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)I組、實(shí)驗(yàn)2組和對(duì)照組；
[0013]5.2)分別將ImL步驟S2所得的接種病毒液輕輕加入到實(shí)驗(yàn)I組和實(shí)驗(yàn)2組細(xì)胞表面，然后蓋上瓶塞，輕輕將搖晃瓶子，讓接種病毒液在細(xì)胞面上來(lái)回幾次，使病毒在細(xì)胞上均勻吸附;在對(duì)照細(xì)胞中，加入ImL維持液；
[0014]5.3)將實(shí)驗(yàn)I組和實(shí)驗(yàn)2組的細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞一起放入37°C的⑶2培養(yǎng)箱培養(yǎng)Ih;其中每隔20min，輕輕搖晃細(xì)胞瓶，使病毒液或維持液能充分接觸細(xì)胞；
[0015]5.4)吸棄實(shí)驗(yàn)I組和實(shí)驗(yàn)2組的病毒液以及對(duì)照組的維持液，然后在實(shí)驗(yàn)I組加入8mL FBS濃度為2%的維持液和濃度為50μΜ的步驟S3制得的⑶CA 80yL，實(shí)驗(yàn)2組中加入8mLFBS濃度為2%的維持液，對(duì)照組加入8mL FBS濃度為2%的維持液，然后實(shí)驗(yàn)I組、實(shí)驗(yàn)2組和對(duì)照組在37 °C CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；
[0016]5.5)每天觀察實(shí)驗(yàn)I組、實(shí)驗(yàn)2組的細(xì)胞病變情況，當(dāng)90%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)即可收集對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的病毒液；
[0017]5.6)對(duì)于實(shí)驗(yàn)I組和實(shí)驗(yàn)2組，步驟5.5)中收集得到病毒液分裝保存在2mL離心管，在12 OOOg離心3min，以此除去細(xì)胞碎片，收集離心后的上清液，用于病毒的傳代培養(yǎng)和病毒的檢測(cè)；
[0018]5.7)豬嵴病毒在MDCK細(xì)胞上連續(xù)傳50代。
[0019]需要說(shuō)明的是，步驟SI中，復(fù)蘇的MDCK細(xì)胞連續(xù)傳代2?3次。
[0020]需要說(shuō)明的是，步驟S2中，所述糞便樣品5倍稀釋。
[0021]需要說(shuō)明的是，步驟S2中，離心的條件為40C，12000g，時(shí)間為5min。
[0022]需要說(shuō)明的是，步驟S2中，用0.22μπι濾器對(duì)上清進(jìn)行過(guò)濾。
[0023]需要說(shuō)明的是，步驟S3中，⑶CA稀釋為50mM的儲(chǔ)存濃度。
[0024]需要說(shuō)明的是，步驟5.5)中，采用反復(fù)凍融的方法收集病毒液:將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入-20 0C冰箱，細(xì)胞培養(yǎng)液完全結(jié)凍后，在流水中使其完全融化，搖動(dòng)細(xì)胞瓶，使細(xì)胞破裂釋放出病毒顆粒，如此反復(fù)3次。
[0025]本發(fā)明的有益效果在于:應(yīng)用MDCK細(xì)胞成功地對(duì)豬嵴病毒進(jìn)行分離培養(yǎng)，并進(jìn)行了傳代，成功獲得了可以用于豬嵴病毒分離傳代的細(xì)胞系。本發(fā)明首次提出了一種能用于豬嵴病毒培養(yǎng)的細(xì)胞系。
【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為本發(fā)明的總體流程圖；
[0027]圖2為MDCK接種嵴病毒后第三代36h細(xì)胞病變情況；
[0028]圖3為MDCK接種嵴病毒后第三代RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，需要說(shuō)明的是，本實(shí)施例以本技術(shù)方案為前提，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于本實(shí)施例。
[0030]如圖1所示，一種豬嵴病毒的培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
[0031 ] SI復(fù)蘇MDCK細(xì)胞后，連續(xù)傳代若干次，待細(xì)胞狀態(tài)良好；
[0032]S2將帶有豬嵴病毒的糞便樣品(糞便樣品采集自5日齡仔豬的小腸)稀釋?zhuān)x心，離心后的上清過(guò)濾到無(wú)菌離心管中，即為接種病毒液；
[0033]S3將鵝脫養(yǎng)膽酸CDCA用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)琠20°C保存?zhèn)溆茫?br>[0034]S4進(jìn)行豬嵴病毒接種前I天，將步驟SI得到的MDCK細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，細(xì)胞數(shù)量以第二天接種時(shí)細(xì)胞鋪滿(mǎn)所述細(xì)胞培養(yǎng)瓶的底部達(dá)90%的為準(zhǔn)；
[0035]S5對(duì)步驟S4中最終得到的MDCK細(xì)胞利用步驟S2的接種病毒液進(jìn)行接種病毒，接種時(shí)細(xì)胞呈單層鋪滿(mǎn)狀態(tài)且長(zhǎng)勢(shì)良好:
[0036]5.1)先棄去步驟細(xì)胞培養(yǎng)瓶中原有的培養(yǎng)液，用I XPBS洗細(xì)胞表面然后除盡殘留的PBS，然后將用I XPBS洗細(xì)胞表面并除盡殘留的PBS的細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)I組、實(shí)驗(yàn)2組和對(duì)照組；
[0037]5.2)分別將ImL步驟S2所得的接種病毒液輕輕加入到實(shí)驗(yàn)I組和實(shí)驗(yàn)2組細(xì)胞表面，然后蓋上瓶塞，輕輕將搖晃瓶子，讓接種病毒液在細(xì)胞面上來(lái)回幾次，使病毒在細(xì)胞上均勻吸附;在對(duì)照細(xì)胞中，加入ImL維持液；
[0038]5.3)將實(shí)驗(yàn)I組和實(shí)驗(yàn)2組的細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞一起放入37°C的⑶2培養(yǎng)箱培養(yǎng)Ih;其中每隔20min，輕輕搖晃細(xì)胞瓶，使病毒液或維持液能充分接觸細(xì)胞；
[0039]5.4)吸棄實(shí)驗(yàn)I組和實(shí)驗(yàn)2組的病毒液以及對(duì)照組的維持液，然后在實(shí)驗(yàn)I組加入8mL FBS濃度為2%的維持液和濃度為50μΜ的步驟S3制得的⑶CA 80yL，實(shí)驗(yàn)2組中加入8mLFBS濃度為2%的維持液，對(duì)照組加入8mL FBS濃度為2%的維持液，然后實(shí)驗(yàn)I組、實(shí)驗(yàn)2組和對(duì)照組在37 °C CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；
[0040]5.5)每天觀察實(shí)驗(yàn)I組、實(shí)驗(yàn)2組的細(xì)胞病變情況，當(dāng)90 %的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)即可收集對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的病毒液；
[0041]可以采用反復(fù)凍融的方法收集病毒液:將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入_20°C冰箱，細(xì)胞培養(yǎng)液完全結(jié)凍后，在流水中使其完全融化，搖動(dòng)細(xì)胞瓶，使細(xì)胞破裂釋放出病毒顆粒，如此反復(fù)3次。
[0042]5.6)對(duì)于實(shí)驗(yàn)I組和實(shí)驗(yàn)2組，步驟5.5)中收集得到病毒液分裝保存在2mL離心管，在12 OOOg離心3min，以此除去細(xì)胞碎片，收集離心后的上清液，用于病毒的傳代培養(yǎng)和病毒的檢測(cè)；
[0043]5.7)豬嵴病毒在MDCK細(xì)胞上連續(xù)傳50代。
[0044]以下采用PCR的方法證實(shí)本發(fā)明獲得的用于豬嵴病毒分離傳代的細(xì)胞系具有傳代培養(yǎng)分尚病毒的效果。
[0045]1、引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank公布的swKoV CH441株基因序列(登錄號(hào):KF539763)，設(shè)計(jì)豬嵴病毒的檢測(cè)引物。引物序列:K2F: CGTTGGGCTGAGCGTGTA ;K2R:AGGGAGCAGAAGAAATGAGGTT。
[0046]2、根據(jù)MiniBEST Universal RNA Extract1n Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取CH441 株豬嵴病毒的RNA，利用One Step PrimeScript?RT-PCR Kit試劑盒RT-PCR擴(kuò)增K2基因。K2基因是本發(fā)明設(shè)計(jì)的用于豬嵴病毒檢測(cè)的擴(kuò)增片段，它是豬嵴病毒2C基因的一部分，對(duì)豬嵴病毒的檢測(cè)具有較高的特異性和靈敏性。
[0047]PCR反應(yīng)體系50yL: 2 XOne Step Buffer 25yL,Prime Script 2yL，RNA模板7yL，上、下游引物(25μπιο I/L)各IyL，DEPC H2O 14yL。PCR反應(yīng)條件:50 °C 反轉(zhuǎn)錄45miη; 94 °C預(yù)變性2min;94°C變性308，50°(:退火458，72°(:延伸1111丨11，35個(gè)循環(huán)；72°(:延伸10111丨11。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收?；厥蘸蟮幕蚱慰寺〉絧MD19-T Simple Vector。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB固體培養(yǎng)基，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取3株單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，220r/min培養(yǎng)6h后取IyL菌液作為模版，進(jìn)行菌液PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系25yL:2XEcotaq PCR SuperMix 12.5yL,ddH20 9.5yL，上、下游引物(25411101/1)各141^，0嫩模板14匕？0?反應(yīng)條件:95°(:預(yù)變性3111丨11;95°(:變性308，52°(:退火458，72°(:延伸408，共25個(gè)循環(huán)；72°(:延伸10111丨11。提取？0?鑒定陽(yáng)性的克隆質(zhì)粒3?5個(gè)，pMD 19-T-3C進(jìn)行基因序列測(cè)定。
[0048]以下通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的可行性。
[0049]1、MDCK接種病毒后細(xì)胞病變效應(yīng)
[0050]豬嵴病毒接種MDCK細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)病變。開(kāi)始時(shí)病變出現(xiàn)較快24h?36h細(xì)胞病變即可達(dá)到90 %以上，待傳代穩(wěn)定后，實(shí)驗(yàn)I組出現(xiàn)90 %病變的時(shí)間為36h，實(shí)驗(yàn)2組出現(xiàn)90 %病變的時(shí)間為48h如(圖2)。
[0051 ] 2、MDCK接種病毒后RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
[0052]MDCK接種病毒后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示在544bp處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。測(cè)序結(jié)果顯示，該序列是豬嵴病毒基因組序列，如圖3所示。
[0053]3、CDCA不僅可以降低膽汁內(nèi)膽固醇的飽和度而且可以作為激素樣調(diào)節(jié)分子調(diào)節(jié)特異的細(xì)胞受體。STATl是IFN介導(dǎo)的機(jī)體抗病毒天然免疫的重要組成成分，CDCA可通過(guò)下調(diào)STATl的活性使腸道病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)。比較本發(fā)明中實(shí)驗(yàn)I組和2組出現(xiàn)90%細(xì)胞病變的時(shí)間可知，CDCA可以促進(jìn)豬嵴病毒細(xì)胞病變效應(yīng)，與上述結(jié)論相符。細(xì)胞病變效應(yīng)和PCR檢測(cè)結(jié)果表明，MDCK細(xì)胞可以作為豬嵴病毒可以作為豬嵴病毒的感染細(xì)胞并可連續(xù)傳一定的代次。
[0054]對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)以上的技術(shù)方案和構(gòu)思，作出各種相應(yīng)的改變和變形，而所有的這些改變和變形都應(yīng)該包括在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種豬嵴病毒的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟: SI復(fù)蘇MDCK細(xì)胞后，連續(xù)傳代若干次，待細(xì)胞狀態(tài)良好； S2將帶有豬嵴病毒的糞便樣品稀釋?zhuān)x心，離心后的上清過(guò)濾到無(wú)菌離心管中，即為接種病毒液； S3將鵝脫養(yǎng)膽酸⑶CA用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)?20 °C保存?zhèn)溆茫? S4進(jìn)行豬嵴病毒接種前I天，將步驟SI得到的MDCK細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，細(xì)胞數(shù)量以第二天接種時(shí)細(xì)胞鋪滿(mǎn)所述細(xì)胞培養(yǎng)瓶的底部達(dá)90%的為準(zhǔn)； S5對(duì)步驟S4中最終得到的MDCK細(xì)胞利用步驟S2的接種病毒液進(jìn)行接種病毒，接種時(shí)細(xì)胞呈單層鋪滿(mǎn)狀態(tài)且長(zhǎng)勢(shì)良好: 5.1)先棄去步驟細(xì)胞培養(yǎng)瓶中原有的培養(yǎng)液，用I X PBS洗細(xì)胞表面然后除盡殘留的PBS，然后將用I XPBS洗細(xì)胞表面并除盡殘留的PBS的細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)I組、實(shí)驗(yàn)2組和對(duì)照組； 5.2)分別將ImL步驟S2所得的接種病毒液輕輕加入到實(shí)驗(yàn)I組和實(shí)驗(yàn)2組細(xì)胞表面，然后蓋上瓶塞，輕輕將搖晃瓶子，讓接種病毒液在細(xì)胞面上來(lái)回幾次，使病毒在細(xì)胞上均勻吸附;在對(duì)照細(xì)胞中，加入ImL維持液； 5.3)將實(shí)驗(yàn)I組和實(shí)驗(yàn)2組的細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞一起放入37°C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)Ih;其中每隔20min，輕輕搖晃細(xì)胞瓶，使病毒液或維持液能充分接觸細(xì)胞； 5.4)吸棄實(shí)驗(yàn)I組和實(shí)驗(yàn)2組的病毒液以及對(duì)照組的維持液，然后在實(shí)驗(yàn)I組加入SmLFBS濃度為2%的維持液和濃度為50μΜ的步驟S3制得的⑶CA 80yL，實(shí)驗(yàn)2組中加入8mL FBS濃度為2 %的維持液，對(duì)照組加入8mL FBS濃度為2 %的維持液，然后實(shí)驗(yàn)I組、實(shí)驗(yàn)2組和對(duì)照組在37 °C CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)； 5.5)每天觀察實(shí)驗(yàn)I組、實(shí)驗(yàn)2組的細(xì)胞病變情況，當(dāng)90%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)即可收集對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的病毒液； 5.6)對(duì)于實(shí)驗(yàn)I組和實(shí)驗(yàn)2組，步驟5.5)中收集得到病毒液分裝保存在2mL離心管，在12OOOg離心3min，以此除去細(xì)胞碎片，收集離心后的上清液，用于病毒的傳代培養(yǎng)和病毒的檢測(cè)； 5.7)豬嵴病毒在MDCK細(xì)胞上連續(xù)傳50代。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬嵴病毒的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟SI中，復(fù)蘇的MDCK細(xì)胞連續(xù)傳代2?3次。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬嵴病毒的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟S2中，所述糞便樣品5倍稀釋。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬嵴病毒的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟S2中，離心的條件為4°C，12000g，時(shí)間為5min。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬嵴病毒的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟S2中，用0.22μπι濾器對(duì)上清進(jìn)行過(guò)濾。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬嵴病毒的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟S3中，CDCA稀釋為50mM的儲(chǔ)存濃度。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬嵴病毒的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟5.5)中，采用反復(fù)凍融的方法收集病毒液:將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入-20°C冰箱，細(xì)胞培養(yǎng)液完全結(jié)凍后，在流水中使其完全融化，搖動(dòng)細(xì)胞瓶，使細(xì)胞破裂釋放出病毒顆粒，如此反復(fù)3次。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK106011080SQ201610348968
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月23日
【發(fā)明人】蘭喜, 楊彬, 祝俊鵬, 王琛, 劉永生
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所