利用拆分Cas系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯和表達(dá)調(diào)控方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了利用拆分Cas系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯和表達(dá)調(diào)控方法。本發(fā)明提供了蛋白組，將Cas9蛋白氨基酸序列從第不同位點(diǎn)拆分，形成兩段蛋白組成蛋白組；本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明了，Intein介導(dǎo)的拆分的Ca9系統(tǒng)可以高效的實(shí)現(xiàn)基因編輯與基因線路的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控。本發(fā)明提供了運(yùn)用拆分的Cas9系統(tǒng)結(jié)合腫瘤細(xì)胞特異性啟動(dòng)子可以進(jìn)行膀胱癌細(xì)胞特異性檢測。
【專利說明】
利用拆分Cas系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯和表達(dá)調(diào)控方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及利用拆分化S系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯和表達(dá)調(diào)控 方法。
【背景技術(shù)】
[0002 ]基因編輯和基因表達(dá)調(diào)控是祀向基因治療領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)。由RNA引導(dǎo)的CRISPR/ 化s9系統(tǒng)自2013年起已經(jīng)成為基因組編輯的新工具，并且由于其載體構(gòu)建過程相較于另外 兩種編輯工具TALE、鋒指蛋白更為方便，受到該領(lǐng)域研究者的追捧。CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced 化ort Palin化omic Repeats成簇的規(guī)律間隔短回 文重復(fù)序列)是最新出現(xiàn)的一種由RNA指導(dǎo)化s核酸酶對(duì)祀向基因進(jìn)行特定DM修飾的技術(shù)。 CRISPR/化S系統(tǒng)廣泛分布于細(xì)菌和古生菌基因組中，是在進(jìn)化過程中形成的一種適應(yīng)性免 疫系統(tǒng)，可W降解入侵病毒或質(zhì)粒DNA。在運(yùn)一系統(tǒng)中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通過堿 基配對(duì)與1：racrRNA(trans-activating RNA)結(jié)合形成雙鏈RNA，此hacrRNA/crRNA二元復(fù) 合體指導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列祀定位點(diǎn)剪切雙鏈DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞利用自身的非同源末 端連接修復(fù)機(jī)制(non-homologous end joining，NHEJ)，引起切割位點(diǎn)的DNA插入或缺失導(dǎo) 致目標(biāo)基因功能失活。
[0003] 在CRISPR II型系統(tǒng)中，化s9基因是參與CRISPR免疫系統(tǒng)的唯一必需基因，是目前 最常用來工程改造人工核酸酶的系統(tǒng)。其中，Cas9是一個(gè)由1409氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋 白，含有2個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，即氨基端的RuvC-like結(jié)構(gòu)域，W及位于蛋白中間位置的HNWI 酸酶結(jié)構(gòu)域。HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域可W切割與crRNA互補(bǔ)配對(duì)的模板鏈，切割位點(diǎn)位于原型間 隔序列郵鄰基序（Protospacer adjacent motif,ΡΑΜ)上游：3nt處，RuvC-Uke結(jié)構(gòu)域可W對(duì) 另一條鏈進(jìn)行切害L切割位點(diǎn)位于PAM上游3-8nt處。在crRNA與tracrRNA形成的雙鏈RNA的 指導(dǎo)下，化s9蛋白對(duì)祀位點(diǎn)進(jìn)行切割。為了方便使用，在人工構(gòu)建的CRISPR/化s9系統(tǒng)中，將 tracrRNA和crRNA融合為一條，稱為guide RNA(gRNA)。
[0004] 另外，可W在核酸酶活性結(jié)構(gòu)域中引入點(diǎn)突變，使Cas9蛋白部分喪失或者完全喪 失核酸酶的活性。當(dāng)化s9的RuvC或者HNH結(jié)構(gòu)域中引入突變時(shí)，Cas9可被改造成為雙鏈DNA 切口酶(nickase)n化s9。已有報(bào)告利用nCas9與兩條不同的曲NA聯(lián)用可用于較大片段的置 換，也可增強(qiáng)編輯的特異性；當(dāng)RuvC和HNH兩個(gè)結(jié)構(gòu)域同時(shí)引入突變時(shí)，Cas9內(nèi)切活性喪失， 成為dCas9(deactivated Cas9)，然而dCas9仍能與DNA祀位點(diǎn)結(jié)合。當(dāng)dCas9結(jié)合在目的基 因的啟動(dòng)子區(qū)域或轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近區(qū)域時(shí)，可能由于空間位阻效應(yīng)阻擋了轉(zhuǎn)錄因子或 RNA聚合酶與DNA的結(jié)合，從而抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄。另外，此as9也可W與轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用域 融合，成為人工轉(zhuǎn)錄因子。例如，d化s9與KRAB轉(zhuǎn)錄抑制作用域融合成為狀as9-KRAB，可有效 抑制祀基因表達(dá)，即CRISPRi(CRISPR interference)技術(shù)；dCas9也可與轉(zhuǎn)錄激活作用域 VP64融合成為狀as9-VP64，可有效激活祀基因表達(dá)。
[0005] 基因拆分技術(shù)是建立在蛋白內(nèi)含膚Intein及其介導(dǎo)的蛋白剪接作用的基礎(chǔ)上發(fā) 展起來的，一般采用將目的基因拆分成兩個(gè)編碼蛋白的基因片段，分別與Intein兩個(gè)剪接 域的基因序列結(jié)合，形成融合基因，翻譯后形融合蛋白，單獨(dú)存在不具備蛋白質(zhì)活性，只有 通過Intein介導(dǎo)的蛋白剪接功能，將Intein從前體蛋白中切除，使兩個(gè)基因片段編碼的蛋 白序列連接起來，形成一個(gè)完整的、有功能的蛋白。
[0006] 具體而言，Intein是一類介導(dǎo)翻譯后蛋白剪接的內(nèi)部蛋白元件，其作用類似于在 RNA加工過程中被剪除的內(nèi)含子，位于多膚序列中間，經(jīng)加工切除后，兩端的Extein(蛋白 質(zhì)外顯子)連接為成熟的蛋白質(zhì)分子。其序列顯示在兩個(gè)剪接結(jié)合點(diǎn)處存在高度保守的蛋 白序列：Intein N末端有一個(gè)保守的半脫氨酸或絲氨酸，InteinC末端有保守的組氨酸-天 口冬酷胺序列，Extein的C前面往往有脫氨酸、絲氨酸和蘇氨酸作為第一氨基酸殘基。運(yùn)些 保守的氨基酸殘基直接參與催化融合蛋白的膚鍵斷裂剪切和拆分蛋白之間的膚鍵連接作 用。當(dāng)InteinC端與InteinN端相遇時(shí)，拆分的前體蛋白中的Intein作用域催化一系列反應(yīng)， 將其自身從前體蛋白中移去，并將兩側(cè)稱為Extein的蛋白片段W正常的膚鍵連接起來形成 成熟蛋白，該過程即為蛋白剪接。
[0007] 盡管CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)使基因編輯與基因表達(dá)調(diào)控更易實(shí)現(xiàn)，然而化s9基 因編碼區(qū)約有4kb，加上啟動(dòng)子等其他序列，一個(gè)完整的可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的化s9基因表達(dá)單 元往往需要5-化b的大小，然而質(zhì)粒越大越難轉(zhuǎn)染，影響使用該系統(tǒng)的場景及效率。如果能 成功使用基因拆分技術(shù)，將化s9蛋白拆分為兩段，利用蛋白剪接機(jī)制使其在轉(zhuǎn)染之后融合 為完整的蛋白，則可解決轉(zhuǎn)染難度問題，擴(kuò)大使用范圍，提高效率。此外，拆分后的化s9蛋白 可W構(gòu)成邏輯與口，只有其N端和C端同時(shí)表達(dá)時(shí)才會(huì)實(shí)現(xiàn)其功能，為邏輯基因線路提供通 用元件。除拆分一個(gè)種系的Cas9蛋白外，還可W拆分重組不同種系的Cas9蛋白，形成新的 化s9蛋白系統(tǒng)，構(gòu)建正交的化s9系統(tǒng)。已有研究人員嘗試拆分化s9蛋白，利用在雷帕霉素誘 導(dǎo)下FRB與FKBP形成的異源二聚體使其重組成完整的化s9蛋白，或者在不加任何作用域的 條件下利用排NA使拆分的化s9蛋白重組成有活性的化s9蛋白。然而運(yùn)兩種拆分系統(tǒng)所獲得 的化s9基因編輯效率還比較低，需要進(jìn)一步完善提高重組后化s9的活性。
[0008] 膀脫癌是威脅人類健康的殺手之一，特異性識(shí)別癌癥細(xì)胞，進(jìn)行特異性鑒定、識(shí) 另IJ、殺傷癌癥細(xì)胞成為日益普及的生物治療方法。該類方法一般選擇腫瘤特異性的標(biāo)志物 如在其中活性較高的啟動(dòng)子，例如hTRET (人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)啟動(dòng)子在腫瘤中有較高活性， 而在正常細(xì)胞中活性較低，hupll化uman化oplakinll)啟動(dòng)子在膀脫癌細(xì)胞中可W啟動(dòng)相 應(yīng)基因表達(dá)，而在其他細(xì)胞中則不表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是利用化s9蛋白功能作用域的可拆分特性，將一個(gè)化s9基因的編碼 區(qū)域拆分成N端和C端兩個(gè)片段(Cas9N和Cas9C)，分別與蛋白內(nèi)含子InteinN和InteinC融 合，在細(xì)胞內(nèi)由Intein結(jié)構(gòu)域催化蛋白剪切，使其在細(xì)胞內(nèi)重新結(jié)合成完整的Cas9蛋白，繼 而進(jìn)行基因編輯和基因表達(dá)調(diào)控。本發(fā)明實(shí)施例中使用的化s9蛋白來自化脈鏈球菌，即為 Sp&s9。
[0010] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供蛋白組，是利用化s9可拆分的性質(zhì)，在其柔性位置，將其 拆分成兩段，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)在化s9蛋白序列第204、第469、第714W及第1154個(gè)氨基酸的位置 拆分，該拆分可W在內(nèi)含膚可變剪接功能下在細(xì)胞內(nèi)重新組成完整的化s9蛋白。
[0011] 本發(fā)明提供的蛋白組，為如下1)-4)中任一種：
[0012] 1)由蛋白 Cas9N204和蛋白 Cas9C204組成；
[0013] 所述蛋白化S9N204和所述蛋白Cas9C204是將化s9蛋白氨基酸序列從第203和204 位之間拆分，形成的兩段蛋白；
[0014] 2)由蛋白Cas9M69和蛋白Cas9C469組成；
[0015] 所述Cas9N469和蛋白Cas9C469是將Cas9蛋白氨基酸序列從第468-469位之間拆 分，形成的兩段蛋白；
[0016] 3)由蛋白蛋白化S9N714和蛋白化s9口 14組成；
[0017] 所述蛋白化S9N714和蛋白化S9C714是將化s9蛋白氨基酸序列從第713-714位之間 拆分，形成的兩段蛋白；
[0018] 4)由蛋白 Cas9Nl 154 和蛋白 Cas9Cl 154 組成；
[0019] 所述蛋白化S9N1154和蛋白化S9C1154是將化s9蛋白氨基酸序列從第1153-1154位 之間拆分，形成的兩段蛋白。
[0020] 上述蛋白組中，所述化s9蛋白為Sp化s9或d化s9;所述Sp化s9的氨基酸序列為序列 表中序列2,所述狀as9的氨基酸序列為序列表中序列6。
[0021] 上述蛋白組中，所述蛋白化S9N204氨基酸序列為序列表中序列2第1-203位或序列 6 第 1-203位；
[0022] 所述蛋白Cas9C204氨基酸序列為序列表中序列2第204-1368位或序列6第204- 1368位；
[0023] 所述蛋白化S9M69氨基酸序列為序列表中序列2第1-468位或序列6第1-468位；
[0024] 所述蛋白Cas9C469氨基酸序列為序列表中序列2第469-1368位或序列6第469- 1368位；
[00巧]所述蛋白化S9N714氨基酸序列為序列表中序列2第1-713位或序列6第1-713位； [00%] 所述蛋白Cas9C714氨基酸序列為序列表中序列2第714-1368位或序列6第714- 1368位；
[0027] 所述蛋白化S9N1154氨基酸序列為序列表中序列2第1-1153位或序列6第1-1153 位；
[002引所述蛋白化S9C1154氨基酸序列為序列表中序列2第1154-1368位或序列6第1154- 1368位。
[0029] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供融合蛋白組。
[0030] 本發(fā)明提供的融合蛋白組，為如下A)-D)中任一種：
[0031] A)由融合蛋白Cas9N204-InteinN和融合蛋白InteinC-Cas9C204組成的融合蛋白 組；
[0032] 所述融合蛋白Cas9N204-InteinN為自N端至C端依次由上述蛋白Cas9N204與 InteinN蛋白組成；
[0033] 所述融合蛋白Cas9C204-InteinC為自N端至C端依次由InteinC蛋白與上述蛋白 Cas9C204組成；
[0034] 所述InteinN蛋白氨基酸序列為序列表中序列4第1-89位；
[0035] 所述InteinC蛋白氨基酸序列為序列表中序列4第90-126位；
[0036] B)由融合蛋白Cas9N469-InteinN和融合蛋白Cas9C469-InteinC組成的融合蛋白 組；
[0037] 所述融合蛋白化s9N469-InteinN為自N端至C端依次由將上述蛋白化S9N469與所 述InteinN蛋白組成；
[0038] 所述融合蛋白化s9C469-InteinC為自N端至C端依次由所述InteinC蛋白和上述蛋 白Cas9C469組成；
[0039] C)由融合蛋白Cas9N714-InteinN和融合蛋白Cas9C714-InteinC組成的融合蛋白 組；
[0040] 所述融合蛋白化S9N714-InteinN為自N端至C端依次由上述蛋白化S9N714與所述 InteinN蛋白融合形成融合蛋白Cas9M69-InteinN;
[0041] 所述融合蛋白化s9 口 14-InteinC為自N端至C端依次由所述InteinC蛋白和權(quán)利要 求1-3任一中所述蛋白化S9C714組成；
[0042] D)由融合蛋白Cas9N1154-InteinN和融合蛋白Cas9C1154-InteinC組成的融合蛋 白組；
[0043] 所述融合蛋白化s9Nl 154-InteinN為自N端至C端依次由上述蛋白化s9Nl 154與所 述InteinN蛋白組成；
[0044] 所述融合蛋白化s9C1154-InteinC為自N端至C端依次由所述InteinC蛋白和上述 蛋白化S9C1154在組成。
[0045] 本發(fā)明的第Ξ個(gè)目的是提供融合蛋白組。
[0046] 本發(fā)明提供的融合蛋白組，為如下1)-4)中任一種：
[0047] 1)由上述融合蛋白C^is9N204-InteinN和融合蛋白InteinC-(^is9C204-功能結(jié)構(gòu)域 蛋白組成的融合蛋白組；
[004引所述融合蛋白InteinC-Cas9C204-功能結(jié)構(gòu)域蛋白為自N端至C端依次由上述 InteinC蛋白、上述蛋白化S9C204和功能結(jié)構(gòu)域蛋白組成；
[0049] 2)由上述融合蛋白化s9N469-InteinN和融合蛋白化s9C469-InteinC-功能結(jié)構(gòu)域 蛋白組成的融合蛋白組；
[0化0]所述融合蛋白Cas9C469-InteinC-功能結(jié)構(gòu)域蛋白為自N端至C端依次由上述 InteinC蛋白、上述蛋白化S9C469和功能結(jié)構(gòu)域蛋白組成；
[0化1] 3)由上述融合蛋白化s9N714-InteinN和融合蛋白化s9口 14-InteinC-功能結(jié)構(gòu)域 蛋白組成的融合蛋白組；
[0052]所述融合蛋白Cas9C714-In teinC-功能結(jié)構(gòu)域蛋白為自N端至C端依次由所述 InteinC蛋白、上述蛋白化s9口 14和功能結(jié)構(gòu)域蛋白組成；
[0053] 4)由上述融合蛋白Cas9N1154-InteinN和融合蛋白Cas9C1154-InteinC-功能結(jié)構(gòu) 域蛋白組成的融合蛋白組；
[0054] 所述融合蛋白Cas9C1154-InteinC-功能結(jié)構(gòu)域蛋白為自N端至C端依次由所述 InteinC蛋白和上述蛋白化S9C1154和功能結(jié)構(gòu)域蛋白組成。
[0055] 上述融合蛋白組中，所述功能結(jié)構(gòu)域蛋白為調(diào)控蛋白，所述調(diào)控蛋白具體為VP64 蛋白或KRAB蛋白；
[0056] 所述VP64蛋白氨基酸序列為序列9;
[0化7] 所述KRAB蛋白氨基酸序列為序列10。
[005引本發(fā)明第四個(gè)目的是提供重組載體組。
[0059] 本發(fā)明提供的重組載體組，為如下1) -8)中任一種：
[0060] 1)由含有上述蛋白化S9N204編碼基因的重組載體和含有上述蛋白化S9C204編碼 基因的重組載體組成；
[0061 ] 2)由含有上述蛋白化S9N469編碼基因的重組載體和含有上述蛋白化S9C469編碼 基因的重組載體組成；
[0062] 3)由含有上述蛋白化S9N714編碼基因的重組載體和含有上述蛋白化S9C714編碼 基因的重組載體組成；
[0063] 4)由含有上述蛋白化S9N1154編碼基因的重組載體和含有上述蛋白Cas9Cl 154編 碼基因的重組載體組成；
[0064] 5)由含有上述融合蛋白化s9N204-InteinN編碼基因的重組載體和含有上述融合 蛋白InteinC-化S9C204編碼基因的重組載體組成；
[00化]6)由含有上述融合蛋白化s9N469-InteinN編碼基因的重組載體和含有上述融合 蛋白InteinC-化S9C469編碼基因的重組載體組成；
[0066] 7)由表達(dá)上述融合蛋白化s9N714-InteinN編碼基因的重組載體和表達(dá)上述融合 蛋白化S9C714編碼基因的重組載體組成；
[0067] 8)由表達(dá)上述融合蛋白化s9N1154-InteinN編碼基因的重組載體和表達(dá)上述融合 蛋白InteinC-化S9C1154編碼基因的重組載體組成；
[0068] 9)由含有上述融合蛋白化s9N204-InteinN編碼基因的重組載體和含有上述融合 蛋白InteinC-化S9C204-功能結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因的重組載體組成；
[0069] 10)由含有上述融合蛋白化s9N469-InteinN編碼基因的重組載體和含有上述融合 蛋白InteinC-化S9C469-功能結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因的重組載體組成；
[0070] 11)由表達(dá)上述融合蛋白化s9N714-InteinN編碼基因的重組載體和表達(dá)上述融合 蛋白InteinC-化S9C714-功能結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因的重組載體組成；
[0071] 12)由表達(dá)上述融合蛋白化s9N1154-InteinN編碼基因的重組載體和表達(dá)上述融 合蛋白InteinC-化S9C1154-功能結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因的重組載體組成。
[0072] 上述蛋白組或上述融合蛋白或上述重組載體在基因編輯中的應(yīng)用也是本發(fā)明保 護(hù)的范圍，利用拆分并重組的CRISPR-化s9系統(tǒng)進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控和基因特定祀點(diǎn)的編輯。
[0073] 上述蛋白組或上述融合蛋白或上述重組載體在祀向定位或基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活或 基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0074] 上述蛋白組或上述融合蛋白或上述重組載體在制備鑒定膀脫癌細(xì)胞產(chǎn)品中的應(yīng) 用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，利用拆分重組的化s9蛋白系統(tǒng)及膀脫癌細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子實(shí) 現(xiàn)特異性的探測膀脫癌細(xì)胞。
[0075] -種基因編輯的方法，為將祀基因或祀序列與上述蛋白組或是上述融合蛋白中的 一個(gè)蛋白編碼基因融合，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因編輯。
[0076] 所述基因編輯的對(duì)象為祀Fla-tEYFP-tgRNA-巧YFP。
[0077] 所用的cas9均來源于spcas9。
[0078] 所用的dcas9均來源于spdcas9。
[0079] 所述基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活為激活化gBFP基因轉(zhuǎn)錄;所述功能結(jié)構(gòu)域蛋白為VP64,所 述激活TagBFP基因轉(zhuǎn)錄是利用VP64激活驅(qū)動(dòng)TagBFP基因表達(dá)的TRE啟動(dòng)子活性，開啟 化濁FP基因表達(dá)；
[0080]所述基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制為抑制化gBFP基因轉(zhuǎn)錄;所述功能結(jié)構(gòu)域蛋白為KRAB，所 述抑制TagBFP基因轉(zhuǎn)錄是利用KRAB抑制驅(qū)動(dòng)TagBFP基因表達(dá)的TRE啟動(dòng)子活性，抑制 化濁FP基因表達(dá)；
[0081 ] 所用的dcas9均來源于spdcas9。
[0082] 所述鑒定膀脫癌細(xì)胞中采用dcas9,其為將膀脫癌細(xì)胞特異啟動(dòng)子地upll和癌細(xì) 胞特異啟動(dòng)子phTRET分別驅(qū)動(dòng)重組載體9)-12)中Cas9N-InteinN編碼基因和InteinC- 化S9C-VP64融合蛋白編碼基因的表達(dá)，使融合蛋白VP64激活TRE啟動(dòng)子，啟動(dòng)化濁EP表達(dá)。
[0083] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明利用內(nèi)含膚的可變剪切機(jī)制可W實(shí)現(xiàn)化s9蛋白的拆分 重組，降低轉(zhuǎn)染難度，并且高效率的完整基因編輯與基因表達(dá)調(diào)控。另外，結(jié)合腫瘤細(xì)胞特 異性的啟動(dòng)子，構(gòu)建邏輯與口，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞探測，提高細(xì)胞分選的特異性。
[0084] 本發(fā)明則利用化s9系統(tǒng)可拆分特性，利用HTRET、hup Π 分別表達(dá)化s9的一端，另外 可W利用誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子如TRE去表達(dá)曲NA，進(jìn)而可W局部用藥dox誘導(dǎo)，相比而言，增加了 一層控制單元，可W提供特異性。
【附圖說明】
[00化]圖1為化s9蛋白拆分示意圖。
[0086] 圖2為利用拆分的化s9蛋白進(jìn)行基因編輯的活性檢測原理示意圖。
[0087] 圖3為實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)一結(jié)果圖。
[0088] 圖4為利用拆分的失活化s9蛋白進(jìn)行基因線路轉(zhuǎn)錄激活示意圖。
[0089] 圖5為實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)一結(jié)果圖。
[0090] 圖6為利用拆分的失活化s9蛋白進(jìn)行基因線路轉(zhuǎn)錄抑制示意圖。
[0091 ]圖7為實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)二結(jié)果圖。
[0092] 圖8利用不加 Intein的拆分化s9蛋白進(jìn)行基因編輯的活性檢測原理示意圖。
[0093] 圖9為實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)一結(jié)果圖。
[0094] 圖10為實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)二結(jié)果圖。
[00M]圖11為利用拆分的失活化s9蛋白進(jìn)行膀脫癌細(xì)胞特異性檢測原理示意圖。
[0096] 圖12為實(shí)施例4實(shí)驗(yàn)一結(jié)果圖。
[0097] 圖13為實(shí)施例5實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[009引圖14為利用拆分的d化s9蛋白構(gòu)建Ξ邏輯與口基因開關(guān)示意圖。
[0099] 圖15為實(shí)施例6實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0100] 圖16為基于可拆分的狀as9蛋白構(gòu)建shRNA控制的基因開關(guān)設(shè)計(jì)一的示意圖
[0101] 圖17為實(shí)施例7實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0102] 圖18為基于可拆分的狀as9蛋白構(gòu)建shRNA控制的基因開關(guān)設(shè)計(jì)二的示意圖
[0103] 圖19為實(shí)施例7實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0104] 圖20為基于可拆分的狀as9蛋白構(gòu)建內(nèi)源microRNA控制的基因開關(guān)的示意圖
[0105] 圖21為實(shí)施例8實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0106] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0107] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買 得到的。
[0108] W下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
[0109] 下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置Ξ次重復(fù)，結(jié)果取平均值。
[0110] 下面的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方式：取24孔板，每孔接種0.5mL皿K293細(xì)胞懸液（含6X104個(gè) HEK293細(xì)胞），培養(yǎng)24小時(shí)后，更換新的DMEM培養(yǎng)基，然后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。
[0111] 實(shí)施例1、拆分化s9蛋白組及重組載體組的獲得及功能驗(yàn)證
[0112] 利用化s9蛋白功能作用域的可拆分特性，將一個(gè)化s9基因的編碼區(qū)域拆分成N端 和C端兩個(gè)片段(化s9N和化s9C)，分別與蛋白內(nèi)含子InteinN和InteinC，在細(xì)胞內(nèi)由Intein 結(jié)構(gòu)域催化蛋白剪切，使其在細(xì)胞內(nèi)重新結(jié)合成完整的化s9蛋白，繼而進(jìn)行基因編輯和基 因表達(dá)調(diào)控。
[0113] 圖1為化s9蛋白拆分示意圖，為將化s9蛋白氨基酸序列從如下至少一種位置拆分 得到的不同段氨基酸序列；位置為第203-204位之間、第468-469位之間、第713-714位之間 和第1153-1154之間。
[0114] 本發(fā)明實(shí)施例中使用的化s9蛋白為來自化脈鏈球菌即hp化s9,其氨基酸序列為序 列表中序列2,其編碼基因 Sp化s9的核巧酸序列為序列表中序列1。
[0115] Sp化s9蛋白按照不同氨基酸位點(diǎn)拆分：
[0116] Sp化S9N204的氨基酸序列為序列表中序列2第1-203位，其編碼基因 Sp化S9N204的 核巧酸序列為序列表序列1第1 -609位；
[0117] 5口〔曰39〔204的氨基酸序列為序列表中序列2第204-1368位，其編碼基因 Sp化S9C204的核巧酸序列為序列表序列1第610-4104位；
[0118] Sp化S9N469的氨基酸序列為序列表中序列2第1-468位，其編碼基因 Sp化S9N469的 核巧酸序列為序列表序列2第1-1404位；
[0119] 5口〔曰39〔469的氨基酸序列為序列表中序列2第469-1368位，其編碼基因 Sp化S9C469的核巧酸序列為序列表序列1第1415-4104位；
[0120] Sp化S9N714的氨基酸序列為序列表中序列2第1-713位，其編碼基因
[0121] Sp化S9N714的核巧酸序列為序列表序列1第1-2139位；
[0122] SpCas9C7 14的氨基酸序列為序列表中序列2第7 14-1 368位，其編碼基因 SpCas9C714的核巧酸序列為序列表序列1第2140-4104位；
[012引 SpCas9Nl 154的氨基酸序列為序列表中序列2第1-1153位，其編碼基因 Sp化S9N1154的核巧酸序列為序列表序列1第1-3459位；
[0124] SpCas9Cl 154的氨基酸序列為序列表中序列2第1154-1368位，其編碼基因 Sp化S9C1154的核巧酸序列為序列表序列1第3460-4104位。
[0125] Intein的氨基酸序列為序列表中序列4,其編碼基因 Intein的核巧酸序列為序列 表中序列3;
[01%] InteinN的氨基酸序列為序列表中序列4第1-89位，其編碼基因 InteinN的核巧酸 序列為序列表中序列3第1-267位；
[0127] InteinC的氨基酸序列為序列表中序列4第90-126位，其編碼基因 InteinC的核巧 酸序列為序列表中序列3第268-378位。
[01巧]一、重組載體的構(gòu)建
[01巧]1)從203-204位拆分化s9構(gòu)建重組載體
[0130] 重組載體pCAG-Sp化s9N204-InteinN的核巧酸序列為序列11，其中，序列表中序列 11第6081-6957位核巧酸為融合蛋白Sp化s9N204-InteinN的編碼基因，該載體表達(dá)的融合 蛋白SpCas9N204-InteinN，其氨基酸序列為序列表中序列12。
[0131] 融合蛋白SpCas9N204-Inte inN從上游起依次由SpCas9N204和Inte inN組成。
[0132] 重組載體pCAG-InteinC-Sp化S9C204的核巧酸序列為序列13,其中，序列表中序列 13第6077-9686位核巧酸為融合蛋白InteinC-Sp化S9C204的編碼基因，該載體表達(dá)融合蛋 白InteinC-Sp化S9C204,其氨基酸序列為序列表中序列14。
[0133] 融合蛋白InteinC-SpCas9C204從上游起依次由InteinC和SpCas9C204組成。
[0134] 2)從468-469位拆分化s9構(gòu)建重組載體
[01巧]重組載體pCAG-Sp化s9N469-InteinN的核巧酸序列為序列15,其中，序列表中序列 15第6081-7752位核巧酸為融合蛋白Sp化s9N469-InteinN的編碼基因，該載體表達(dá)融合蛋 白Sp化s9M69-InteinN，其氨基酸序列為序列表中序列16。
[0136] 融合蛋白SpCas9M69-Inte inN從上游起依次由SpCas9M69和Inte inN組成。
[0137] 重組載體pCAG-InteinC-Sp化S9C469的核巧酸序列為序列17,其中，序列表中序列 17第6077-8891位核巧酸為融合蛋白InteinC-Sp化S9C469的的編碼基因，該載體表達(dá)融合 蛋白InteinC-Sp化S9C469,該融合蛋白的氨基酸序列為序列表中序列18。
[0138] 融合蛋白InteinC-SpCas9C469從上游起依次由InteinC和SpCas9C469組成。
[0139] 3)從713-714位拆分化s9構(gòu)建重組載體
[0140] 重組載體pCAG-Sp化s9N714-InteinN的核巧酸序列為序列19,其中，序列表中序列 19第6081-8487位核巧酸為融合蛋白Sp化s9N714-InteinN的編碼基因，該載體表達(dá)融合蛋 白Sp化s9N714-InteinN，該融合蛋白的氨基酸序列為序列表中序列20。
[0141] 融合蛋白SpCas9N714-Inte inN從上游起依次由SpCas9N714和Inte inN組成。
[0142] 重組載體pCAG-InteinC-Sp化s9 口 14的核巧酸序列為序列21，其中，序列表中序列 21第6077-8156位核巧酸為融合蛋白InteinC-Sp化s9口 14的編碼基因，該載體表達(dá)融合蛋 白InteinC-Sp化S9C714,該融合蛋白的氨基酸序列為序列表中序列22。
[0143] 融合蛋白InteinC-SpCas9C714從上游起依次由InteinC和SpCas9C714組成。
[0144] 4)從1153-1154位拆分化s9構(gòu)建重組載體
[0145] 重組載體pCAG-SpCas9N1154-InteinN的核巧酸序列為序列23,其中，序列表中序 列23第6081-9807位核巧酸為融合蛋白Sp化s9N1154-InteinN的編碼基因，該載體表達(dá)融合 蛋白Sp化s9N1154-InteinN，該融合蛋白的氨基酸序列為序列表中序列24。
[0146] 融合蛋白 SpCas9Nl 154-Inte inN從上游起依次由 SpCas9Nl 154和 Inte inN組成。
[0147] 重組載體pCAG-InteinC-SpCas9C1154的核巧酸序列為序列25,其中，序列表中序 列25第6077-6836位核巧酸為融合蛋白InteinC-Sp化S9C1154C的編碼基因，該載體表達(dá)融 合蛋白InteinC-Sp化S9C1154C，該融合蛋白的氨基酸序列為序列表中序列26。
[0148] 融合蛋白 InteinC-SpCas9Cl 154C從上游起依次由 InteinC和SpCas9Cl 154C組成。
[0149] 二、可拆分的Sp化s9蛋白進(jìn)行基因編輯的功能驗(yàn)證
[0150] pCAG-Sp化s9質(zhì)粒購買自合生基因公司，產(chǎn)品編號(hào)HS-CR-0005,啟動(dòng)子為CAG啟動(dòng) 子，Cas9為SpCas9,可W進(jìn)行DNA鏈切割；
[0151] pCAG-tagBFP質(zhì)粒如序列7,其中4248-4986編碼CAG啟動(dòng)子，6008-6770編碼 Ta 濁 FP;
[0152] PDT7004質(zhì)粒如序列8;
[0153] pU6-guide RNA，pU6-guide off ta巧etRNA，祀Fla-巧YFP-tgRNA-巧YFP購買自合 生基因公司gRNA活性巧光檢測試劑盒，產(chǎn)品編號(hào)服-SR-0001。祀Fla-tEYFP-tgRNA-巧YFP中 間插有終止密碼子，并且兩段有化s9/gRNA識(shí)別的祀位點(diǎn)，在化s9和排NA的作用下，祀點(diǎn)位 置的雙鏈DNA被切割形成DSB，細(xì)胞通過同源重組效應(yīng)形成有活性的巧光蛋白。
[0154] pCAG-SpCas9N-InteinN質(zhì)粒、pCAG-SpCas9C-InteinC質(zhì)粒、pU6-guide RNA質(zhì)粒、 祀Fla-巧YFP-tgRNA-巧YFP質(zhì)粒、pCAG-tagBFP質(zhì)粒的作用機(jī)理示意圖見圖2。在CAG啟動(dòng)子 的作用下Sp化s9N、Sp化s9C分別表達(dá)，在InteinN和InteinC的可變剪接作用下，形成完整的 Cas9蛋白，在guide RNA1的引導(dǎo)下，剪切祀Fla-巧YFP-tgRNAl-tEYFP中g(shù)RNAl祀位點(diǎn)，利用 非同源末端重組機(jī)制，重組成完整的EYFP基因，開啟表達(dá)，具體如下：
[01對(duì)實(shí)驗(yàn)組：
[0156] 將上述 1 獲得的重組載體 pCAG-SpCas9N204-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C204 質(zhì)粒、pU6-guide RNA質(zhì)粒、pEFla-tEYFP-tgRNA-巧YFP質(zhì)粒、pCAG-ta濁FP質(zhì)粒（內(nèi)參質(zhì)粒） 共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞（Invitrogen公司，目錄號(hào)11631017,每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒各10化邑）。
[0157] 對(duì)照組：為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的正確性，設(shè)計(jì)了多重對(duì)照，確認(rèn)在只有SpCaS9C1或者 Sp化s9Nl的情況下，EYFP不會(huì)表達(dá)，W及在脫祀的RNA作用下EYFP也未表達(dá)，并且與未切割 的完整的化s9蛋白調(diào)控效果進(jìn)行對(duì)比。具體如下表1。
[0158] 表1為不同組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
[0159]
[0160] 表1中的第1組為實(shí)驗(yàn)組（split Cas9N+C+gRNA)，第2-6組為對(duì)照組，其中第2組為 脫祀的gRNA(split化s9N+C+off target排NA)，第3組為完整的化s9蛋白進(jìn)行基因編輯 (Cas9+排NA)，第4組為完整的Cas9蛋白在脫祀的排NA指導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（Cas9+off target 排ΝΑ),第5、6組分別只有拆分的Cas9蛋白的N端（split Cas9N+排ΝΑ)或C端（splitCas9C+ gRNA)DpDT7004是空質(zhì)粒，保障每組轉(zhuǎn)入質(zhì)?？偭恳欢?。
[0161] 同樣的，按照上面的表 1，將pCAG-SpCas9N204-InteinN、pCAG-InteinC- SpCas9C204換成pCAG-SpCas9N469-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C469，pCAG- SpCas9N714-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C714，pCAG-Sp(^is9N1154-InteinN、pCAG- InteinC-SpCas9C1154C，W測試其它Ξ組的基因編輯功能。
[0162] 將上述各組轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測EYFP的巧光強(qiáng)度和化濁FP的 巧光強(qiáng)度。其中化gBFP作為內(nèi)參，用來標(biāo)定共轉(zhuǎn)染的效率。EYFP巧光相對(duì)強(qiáng)度= EYFP的巧光 強(qiáng)度/Ta濁FP的巧光強(qiáng)度。使用EYFP巧光相對(duì)強(qiáng)度來衡量拆分化s9系統(tǒng)的效率流式分析。
[0163] 結(jié)果見圖3，
[0164] SCas9Nl+SCas9Cl 組為 pCAG-SpCas9N204-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C204、 pU6-guide RNA、祀Fla-巧YFP-tgRNA-巧YFP和pCAG-tag邸P轉(zhuǎn)染肥K293細(xì)胞；該組中各小組 如表1所示；
[01 化]SCas9N2+SCas9C2 組為 pCAG-SpCas9N469-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C469、 pU6-guide RNA、祀Fla-巧YFP-tgRNA-巧YFP和pCAG-tag邸P轉(zhuǎn)染肥K293細(xì)胞；該組中各小組 如表1所示；
[0166] SCas9N3+SCas9C3 組為 pCAG-SpCas9N714-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C714、 pU6-guide RNA、祀Fla-巧YFP-tgRNA-巧YFP和pCAG-tag邸P轉(zhuǎn)染肥K293細(xì)胞；該組中各小組 如表1所示；
[0167] SCas9M+SCas9C4 組為 pCAG-SpCas9N1154-InteinN、pCAG-InteinC-SpCas9C1154、 pU6-guide RNA、祀Fla-巧YFP-tgRNA-巧YFP和pCAG-tag邸P轉(zhuǎn)染肥K293細(xì)胞；該組中各小組 如表1所示；
[0168] 可W看出，拆分的化s9蛋白在Intein蛋白的可變剪接作用下，可W編輯下游質(zhì)粒， 點(diǎn)亮EYFP，其效率僅次于完整的Cas9蛋白，具體數(shù)據(jù)如SCas9Nl+SCas9Cl組拆分化s9蛋白 (split Cas9N+C+gRNA)效率為 1.19,僅次于完整的Cas9蛋白（SpCas9+gRNA)l. 56,數(shù)倍于負(fù) 對(duì)照組的0.20(非完整Cas9蛋白 W及脫祀RNA)DSCas9N2+SCas9C2、SCas9N3+SCas9C3、 SCas9M+SCas9C4組結(jié)果與此類似。
[0169] 因此，證明利用拆分的化s9系統(tǒng)可W有效的進(jìn)行基因特定位點(diǎn)的切割，從而實(shí)現(xiàn) 基因編輯的功能。
[0170] 實(shí)施例2、拆分狀as9蛋白組及重組載體組的獲得及功能驗(yàn)證
[0171] 下述實(shí)驗(yàn)中用到的拆分Cas9蛋白均為dCas9蛋白，不能進(jìn)行基因編輯，只能引導(dǎo) VP64(氨基酸序列為序列9)或者KRAB(氨基酸序列為序列10)進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控。此外，下述 實(shí)驗(yàn)組拆分位點(diǎn)是狀as9蛋白第713-714位氨基酸之間位置。
[0172] 此as9蛋白氨基酸序列為序列表中序列6,其編碼基因 dCas9的核巧酸序列為序列 表中序列5。
[0173] dCas9N氨基酸序列為序列表中序列6第1-713位，其編碼基因 dCas9N的核巧酸序列 為序列表序列5第1-2139位；
[0174] dCas9C氨基酸序列為序列表中序列6第714-1368位，其編碼基因 dCas9C的核巧酸 序列為序列表序列5第2140-4104位。
[0175] 一、可拆分的d化s9蛋白進(jìn)行基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活
[0176] 1、重組載體的構(gòu)建
[0177] pCAG-dCas9N-InteinN的核巧酸序列為序列27,其中，序列表中序列27第6081- 8487位核巧酸為融合蛋白dCas9N-InteinN的編碼基因，該載體表達(dá)融合蛋白dCas9N- InteinN，該融合蛋白的氨基酸序列為序列表中序列28;
[017引融合蛋白d化s9N-Inte inN從上游起依次由d化s9N和Inte inN組成。
[01巧]pCAG-InteinC-dCas9C-VP64的核巧酸序列為序列29,其中，序列表中序列29第 6081-8371位核巧酸為融合蛋白InteinC-dCas9C-VP64編碼基因，序列表中序列29第6081- 8156位核巧酸為InteinC-d化s9C編碼基因，序列29第8202-8371位核巧酸為VP64編碼基因， 該載體表達(dá)融合蛋白InteinC-d化S9C-VP64,該融合蛋白的氨基酸序列為序列表中序列30;
[0180] 融合蛋白 InteinC-dCas9C-VP64從上游起由 InteinC、dCas9C和VP64組成。
[0181] 2、可拆分的狀as9蛋白進(jìn)行基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活的功能驗(yàn)證
[0182] pCAG-dCas9-VP64質(zhì)粒如序列31，其中第4249-4896位核巧酸編碼CAG啟動(dòng)子，第 6069-10172位核巧酸編碼dCas9蛋白，第10218-10387位核巧酸編碼VP64蛋白。
[0183] pU6-guide RNA1質(zhì)粒的核巧酸序列為序列32,其中第72-317位核巧酸編碼U6啟動(dòng) 子，第322-341為祀向RNA序列20bp。
[0184] pTRE-TagBFP質(zhì)粒的核巧酸序列為序列33,其中第3615-3864位核巧酸編碼TRE啟 動(dòng)子，第4045-4737編碼Ta濁FP蛋白。
[01化]pEFla-mKate質(zhì)粒的核巧酸序列為序列34,其中第4250-5023編碼祀Fla啟動(dòng)子，第 5481-6186位核巧酸編碼mKate蛋白。
[01化]祀Fla-dTA質(zhì)粒的核巧酸序列為序列35,其中第4250-5023編碼pEFla啟動(dòng)子，第 5476-6222位核巧酸編碼ΚΤΑ。
[0187]實(shí)驗(yàn)組中，拆分重組后的dCas9在排ΝΑ的指導(dǎo)下，將會(huì)集中在TRE啟動(dòng)子上游相應(yīng) 的位點(diǎn)，而dCas9融合的VP64可W激活TRE啟動(dòng)子，進(jìn)而表達(dá)TagBEP巧光蛋白，如果只有 d化s9N端或者dCas9C端表達(dá)，則VP64不會(huì)被拖拽到TRE相應(yīng)的位點(diǎn)，無法激活下游基因的表 達(dá)。
[018引具體如下：
[0189] 實(shí)驗(yàn)組：將 pCAG-dCas9N-InteinN 質(zhì)粒、pCAG-InteinC-dCas9C-VP64 質(zhì)粒、pU6- guide RNA1質(zhì)粒、pEFla-mKate質(zhì)粒（內(nèi)參質(zhì)粒）、pTRE-TagBFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入肥K293細(xì)胞(每 孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒各10化g)。
[0190] 對(duì)照組:為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的正確性，設(shè)置了利用完整的dCas9蛋白攜帶￥?64和的了4進(jìn)行 正對(duì)照(表2的2組）W及不加曲NA作為負(fù)對(duì)照(表2的3組）。
[0191] 表2為不同組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
[0192]
[0193] 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測mKate的巧光強(qiáng)度和化濁FP的巧光強(qiáng)度。 其作用機(jī)理圖見附圖4。其中mKate作為內(nèi)參，用來標(biāo)定共轉(zhuǎn)染的效率。Ta濁FP巧光相對(duì)強(qiáng)度 =實(shí)驗(yàn)組化濁FP的巧光強(qiáng)度/同組mKate的巧光強(qiáng)度。使用化gBFP巧光相對(duì)強(qiáng)度來衡量拆分 化s9系統(tǒng)進(jìn)行基因線路轉(zhuǎn)錄激活的效率。
[0194] 轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖5，spl it dCas9vp64+gRNA為表2中的 1 組;dCas9VP64+gRNA為表2的2 組；split dCas9表2的3組；rtTA+Dox表2的4組；可W看出，在拆分的dCas9蛋白的調(diào)控下， TagBFP相對(duì)巧光強(qiáng)度為0. 17(split dCas9vp64 + gRNA)，低于完整的失活Cas9蛋白 (dCas9VP64+gRNA)的44% ^及的了4+0〇義的0.74，但是遠(yuǎn)高于在沒有g(shù)RNA時(shí)的0.008。
[01M]二、可拆分的狀as9蛋白進(jìn)行基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制
[0196] 1、重組載體的構(gòu)建
[0197] pCAG-InteinC-dCas9C-KRAB的核巧酸序列為序列36,其中，序列表中第6077-8504 位為融合蛋白InteinC-dCas9C-KRAB編碼基因，該載體表達(dá)融合蛋白InteinC-dCas9C- KRAB，該融合蛋白的氨基酸序列為序列表中序列37。
[0198] 融合蛋白 InteinC-dCas9C-KRAB從上游起依次由 InteinC、dCas9C和KRAB組成。
[0199] 2、可拆分的狀as9蛋白進(jìn)行基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制
[0200] pCAG-dCas9-KRAB的核巧酸序列為序列38,其中第4253-4894位核巧酸編碼CAG啟 動(dòng)子，第6069-10172位核巧酸編碼dcas9蛋白，第10245-10540位核巧酸編碼KRAB。
[0201] 實(shí)驗(yàn)組中，拆分重組后的dCas9在排NA的指導(dǎo)下，將會(huì)集中在TRE啟動(dòng)子上游相應(yīng) 的位點(diǎn)，而狀as9融合的KRAB可W與TRE啟動(dòng)子激活區(qū)域結(jié)合，抑制dTA與TRE的結(jié)合，阻止 化gBFP的表達(dá)，如果只有dCas9N端或者dCas9C端表達(dá)，貝化RAB不會(huì)被拖拽到TRE相應(yīng)的位 點(diǎn)，rtTA可W與TRE正常結(jié)合，下游基因可W正常表達(dá)。
[0202] 實(shí)驗(yàn)組（表3 中的 2-5組）：將pCAG-dCas9N-InteinN質(zhì)粒、pCAG-InteinC-dCas9C- KRAB質(zhì)粒、pU6-guide RNA1 質(zhì)粒、pEFla-mKate質(zhì)粒、pTRE-TagBFP、祀Fla-rtTA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 入HEK293細(xì)胞(每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量見表3)。
[0203] 對(duì)照組:表3中的1、6組。
[0204] 具體轉(zhuǎn)染方案見下表3。
[0205] 表3為不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
[0206]
[0207] 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測mKate的巧光強(qiáng)度和化濁FP的巧光強(qiáng)度。 其作用機(jī)理圖見圖6。邸48與的了4競爭性與TRE結(jié)合，阻止化gBFP的表達(dá)。其中mKate作為內(nèi) 參，用來標(biāo)定共轉(zhuǎn)染的效率。TagBFP巧光相對(duì)強(qiáng)度=實(shí)驗(yàn)組化gBFP的巧光強(qiáng)度/同組mKate 的巧光強(qiáng)度。使用化濁FP巧光相對(duì)強(qiáng)度來衡量拆分化s9系統(tǒng)進(jìn)行基因線路轉(zhuǎn)錄抑制的抑制 效果。
[0208] 通過調(diào)整拆分的dCas9蛋白的量，對(duì)比TagBFP巧光相對(duì)強(qiáng)度，W及設(shè)置不拆分的 d化s9蛋白作為正對(duì)照。
[0209] 流式結(jié)果見圖7，split-dCas9-KRAB Ong為表3的 1組；split-dCas9-KRAB 25ng為 表3的2組；39111-北曰39-抓46 50叫為表3的3組；39111-北曰39-抓46 75叫為表3的4組； split-dCas9-KRAB lOOng為表3的5組；dCas9-KRAB lOOng為表3的6組；可W看出，隨著拆分 的d化s9蛋白量的增力陽RAB占據(jù)的更多與TRE結(jié)合的位點(diǎn)，從而阻止化gBFP的表達(dá)，TagBFP 巧光相對(duì)強(qiáng)度下降，與圖7的結(jié)果吻合。在同樣是lOOng的前提下，拆分的dCas9蛋白的 化邑8。？巧光相對(duì)強(qiáng)度為0.15(391^-(1化39-邸46 100叫），略大于完整的此曰39蛋白調(diào)控下 的0.06(dCas9-KRAB lOOng)。
[0210] 實(shí)施例3、對(duì)比不使用Intein介導(dǎo)的拆分化s9系統(tǒng)與使用Intein介導(dǎo)的拆分化s系 統(tǒng)進(jìn)行基因編輯
[0211] 鑒于有文章報(bào)道拆分的化s9蛋白可W在細(xì)胞內(nèi)自動(dòng)重組，本實(shí)施測試在本發(fā)明中 所選用的Sp化s9第714、1154個(gè)氨基酸位置拆分進(jìn)行測試，并與實(shí)施例1進(jìn)行比較。
[0212] 一.Spcas9的714位點(diǎn)拆分是否使用Intein介導(dǎo)效率對(duì)比
[0213] 1、重組載體的構(gòu)建
[0214] pCAG-SpCas9N714質(zhì)粒，其核巧酸序列為序列39,其中序列39第4635-6773位核巧 酸為蛋白Sp化S9N714編碼基因，該載體表達(dá)蛋白Sp化S9N714,該蛋白的氨基酸序列為序列2 第1-713位。
[0215] pCAG-SpCas9C714質(zhì)粒，其核巧酸序列為序列40,其中序列40第4638-6599位核巧 酸為蛋白Sp化S9C714編碼基因，該載體表達(dá)蛋白Sp化S9C714,該蛋白的氨基酸序列為序列2 第 714-1368位。
[0216] 2、不使用Intein介導(dǎo)的拆分化s9系統(tǒng)與使用Intein介導(dǎo)的拆分化S系統(tǒng)進(jìn)行基因 編輯
[0217] 實(shí)驗(yàn)組；
[021引不使用Intein介導(dǎo)：將實(shí)施例1獲得的pCAG-SpCas9N714質(zhì)粒、pCAG-SpCas9C714質(zhì) 粒、pU6-guide RNA質(zhì)粒、pEFla-tEYFP-tgRNA-tEYFP質(zhì)粒、pEFla-mKate質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入 HEK293細(xì)胞(每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒各10化g)轉(zhuǎn)染。
[0219] 使用 Intein 介導(dǎo)：將實(shí)施例 1 獲得的 pCAG-SpCas9N714-InteinN 質(zhì)粒、pCAG- InteinC-SpCas9C714質(zhì)粒、pU6-guide RNA質(zhì)粒、pEFla-tEYFP-tgRNA-tEYFP質(zhì)粒、pEFla- mKate質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞(每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒各10化g)轉(zhuǎn)染。
[0220] 對(duì)照組:表4中的2-4組，為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的正確性，設(shè)置了在脫祀的RNA帶領(lǐng)下EYFP未 表達(dá)，并且與在Intein介導(dǎo)下的化s9蛋白調(diào)控效果進(jìn)行對(duì)比。
[0221] 上述各組轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測EYFP的巧光強(qiáng)度和mKate的巧 光強(qiáng)度，其作用示意圖見圖8。其中mKate作為內(nèi)參，用來標(biāo)定共轉(zhuǎn)染的效率。EYFP巧光相對(duì) 強(qiáng)度=實(shí)驗(yàn)組EYFP的巧光強(qiáng)度/同組mKate的巧光強(qiáng)度。使用EYFP巧光相對(duì)強(qiáng)度來衡量拆分 化s9系統(tǒng)的效率。
[0222] 具體如下表4。
[0223] 表4為不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
[0224]
[02巧]轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖9,無 intein介導(dǎo)拆分化s9714(l組）、無 intein介導(dǎo)拆分化S9714+脫 祀RNA(2組）、有intein介導(dǎo)拆分Cas9714(3組）、無 intein介導(dǎo)拆分Cas9714+脫祀RNA(4組）， 可W看出，不加 Intein拆分化s9蛋白系統(tǒng)中EYFP的相對(duì)巧光強(qiáng)度為1.67,而Intein介導(dǎo)下 的拆分化s9蛋白系統(tǒng)的EYFP的相對(duì)巧光強(qiáng)度為1.96,符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，可W證明Intein介導(dǎo) 下的拆分化s9系統(tǒng)基因編輯效率更高。
[0。6] 二.Spcas9的1154位點(diǎn)拆分是否使用Intein介導(dǎo)效率對(duì)比 [0227] 1、重組載體的構(gòu)建
[022引 pCAG-Sp化S9N1154質(zhì)粒，其核巧酸序列為序列45,其中序列45第4635-8093位核巧 酸為蛋白Sp化S9N1154編碼基因，該載體表達(dá)蛋白Sp化S9N1154，該蛋白的氨基酸序列為序 列2第1-1153位。
[02巧]pCAG-Sp化S9C1154質(zhì)粒，其核巧酸序列為序列46,其中序列46第4644-5279位核巧 酸為蛋白Sp化S9C1154編碼基因，該載體表達(dá)蛋白Sp化S9C1154，該蛋白的氨基酸序列為序 列2第 1154-1368位。
[0230] 2、不使用Intein介導(dǎo)的拆分化s9系統(tǒng)與使用Intein介導(dǎo)的拆分化s系統(tǒng)進(jìn)行基因 編輯
[02川實(shí)驗(yàn)組：
[0232] 不使用 Intein 介導(dǎo)：將實(shí)施例 1 獲得的 pCAG-SpCas9N1154 質(zhì)粒、pCAG-SpCas9C1154 質(zhì)粒、pU6-guide RNA質(zhì)粒、pEFla-tEYFP-t排NA-tEYFP質(zhì)粒、pEFla-mKate質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入 HEK293細(xì)胞(每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒各10化g)轉(zhuǎn)染。
[0233] 使用 Intein 介導(dǎo)：將實(shí)施例 1 獲得的 pCAG-SpCas9N1154-InteinN 質(zhì)粒、pCAG- InteinC-SpCas9C1154質(zhì)粒、pU6-guide RNA質(zhì)粒、pEFla-tEYFP-tgRNA-巧YFP質(zhì)粒、pEFla- mKate質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞(每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒各10化g)轉(zhuǎn)染。
[0234] 對(duì)照組:表4中的2-4組，為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的正確性，設(shè)置了在脫祀的RNA帶領(lǐng)下EYFP未 表達(dá)，并且與在Intein介導(dǎo)下的化s9蛋白調(diào)控效果進(jìn)行對(duì)比。
[0235] 上述各組轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測EYFP的巧光強(qiáng)度和mKate的巧 光強(qiáng)度，其作用示意圖見圖8。其中mKate作為內(nèi)參，用來標(biāo)定共轉(zhuǎn)染的效率。EYFP巧光相對(duì) 強(qiáng)度=實(shí)驗(yàn)組EYFP的巧光強(qiáng)度/同組mKate的巧光強(qiáng)度。使用EYFP巧光相對(duì)強(qiáng)度來衡量拆分 化s9系統(tǒng)的效率。
[0236] 具體如下表5。
[0237] 表5為不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
[023引
[0239] 轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖10,無 intein介導(dǎo)拆分&s91154(1組）、無 intein介導(dǎo)拆分&s91154 +脫祀RNA(2組）、有intein介導(dǎo)拆分Cas91154(3組）、無 intein介導(dǎo)拆分Cas91154+脫祀RNA (4組），可W看出，不加 Intein拆分化s9蛋白系統(tǒng)中EYFP的相對(duì)巧光強(qiáng)度為0.16,而Intein 介導(dǎo)下的拆分Cas9蛋白系統(tǒng)的EYFP的相對(duì)巧光強(qiáng)度為2.00,符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，可W證明 Intein在拆分的cas9系統(tǒng)中的作用，即不能自動(dòng)重組的拆分cas9系統(tǒng)（1154位點(diǎn)）在Intein 的介導(dǎo)下，可W高效的進(jìn)行基因編輯功能。
[0240] 實(shí)施例4、利用拆分的失活化s9蛋白進(jìn)行膀脫癌細(xì)胞特異性檢測功能驗(yàn)證
[0241] 1、重組載體的構(gòu)建
[0242] 祀NTR_L4_hupII_Ll，其核巧酸序列為序列41，其中第745-1100編碼hupn啟動(dòng)子；
[0243] 祀NTR_L4_hTRET_Ll，其核巧酸序列為序列42,其中第705-1160編碼叫1?61'啟動(dòng)子；
[0244] 地upII-dCas9N-InteinN，其核巧酸序列為序列43,其中第4843-7279編碼融合蛋 白dCas9N-InteinN編碼基因，其中第4284-4637編碼啟動(dòng)子luipll，該載體表達(dá)融合蛋白 d化s9N-InteinN，該融合蛋白的氨基酸序列為序列28。
[0245] 融合蛋白d&s9N-Inte inN從上游起依次由d&s9N和Inte inN組成。
[0246] 地TRET-InteinC-dCas9C-VP64其核巧酸序列為序列44,其中第3421-5715編碼融 合蛋白Inte inC-dCas9C-VP64編碼基因，其中第2798-3253編碼啟動(dòng)子hTRET，該載體表達(dá)融 合蛋白InteinC-d化S9C-VP64，該融合蛋白的氨基酸序列為序列30。
[0247] 2.利用拆分的失活化s9蛋白進(jìn)行膀脫癌細(xì)胞特異性檢測功能驗(yàn)證
[0248] 化濁FP是一個(gè)報(bào)告蛋白，可W通過儀器檢測其發(fā)光強(qiáng)度。在正常細(xì)胞中，由于缺少 特異性啟動(dòng)子，tre不會(huì)啟動(dòng)，TagBFP就不會(huì)發(fā)光，而膀脫癌細(xì)胞系中化e會(huì)啟動(dòng)，TagBFP就 回表達(dá)，會(huì)發(fā)光。TagBFP也可W替換為其他巧光蛋白。決定癌細(xì)胞特異性檢測的是選用的 hupll和hTRET運(yùn)兩個(gè)啟動(dòng)子。利用運(yùn)兩個(gè)啟動(dòng)子和拆分的cas9系統(tǒng)構(gòu)建了特異性檢測裝 置，具體如下：
[0249] 實(shí)驗(yàn)組中，拆分重組后的dCas9在排NA的指導(dǎo)下，將會(huì)集中在TRE啟動(dòng)子上游相應(yīng) 的位點(diǎn)，而dCas9融合的VP64可W激活TRE啟動(dòng)子，進(jìn)而表達(dá)TagBEP巧光蛋白，如果只有 d化s9N端或者dCas9C端表達(dá)，則VP64不會(huì)被拖拽到TRE相應(yīng)的位點(diǎn)，無法激活下游基因的表 達(dá)。
[0巧日]具體如下：
[0巧1]實(shí)驗(yàn)組：將 phupII-dCas9N-InteinN 質(zhì)粒、phTRET-InteinC-dCas9C-VP64 質(zhì)粒、 pU6-guide RNA1質(zhì)粒、pEFla-mKate質(zhì)粒（內(nèi)參質(zhì)粒）、pTRE-TagBFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入膀脫癌 5637細(xì)胞系(上海素爾生物科技有限公司產(chǎn)品）（每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒各l(K)ng)。
[0巧2] 對(duì)照組：為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的正確性，設(shè)置了只有dCas9N-InteinN或者只有InteinC- dCas9C-VP64的負(fù)對(duì)照（表6的3組）。
[0253] 表6為不同組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
[0 巧 4]
[0255] 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測mKate的巧光強(qiáng)度和化濁FP的巧光強(qiáng)度。 其作用機(jī)理圖見附圖11。其中mKate作為內(nèi)參，用來標(biāo)定共轉(zhuǎn)染的效率。TagBFP巧光相對(duì)強(qiáng) 度=實(shí)驗(yàn)組化濁FP的巧光強(qiáng)度/同組mKate的巧光強(qiáng)度。使用化濁FP巧光相對(duì)強(qiáng)度來衡量拆 分化s9系統(tǒng)進(jìn)行膀脫癌細(xì)胞特異性檢測的效率。
[0256] 轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖 12，hTRET-InteinC-dCas9C-VP64+hupII-dCas9N-InteinN+gRNA 為 表5中的1組;hupII-dCas9N-Intein化曲NA為表5的2組，
[0257] hTRET-InteinC-dCas9C-VP64+gRNA為表5的3組；可 W看出，在拆分的dCas9蛋白的 調(diào)控下，TagBFP 相對(duì)巧光強(qiáng)度為 0.78 化 TRET-InteinC-dCas9C-VP64+h 叩 II-dCas9N- Intein化曲ΝΑ)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組的化濁FP相對(duì)巧光強(qiáng)度(不及0.10)。
[0258] 實(shí)施例5、d化s9的204、469、714、1154位點(diǎn)拆分是否使用111*6111介導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄 激活的效率對(duì)比
[0259] 1.重組載體的構(gòu)建
[0260] pCAG-d化S9N204,其核巧酸序列為序列49,其中序列49第4635-5243位核巧酸為蛋 白d化S9N204編碼基因，該載體表達(dá)蛋白d化S9N204。
[0%1] pCAG-d化S9C204-VPR，其核巧酸序列為序列50,其中序列50第4635-9744位核巧酸 為蛋白d化S9C204-VH?編碼基因，該載體表達(dá)蛋白d化S9C204-VPR。
[0262] pCAG-d化S9M69,其核巧酸序列為序列51，其中序列51第4635-6038位核巧酸為蛋 白d化S9M69編碼基因，該載體表達(dá)蛋白d化S9M69。
[0263] pCAG-dCas9C469-VPR，其核巧酸序列為序列52,其中序列52第4635-8949位核巧酸 為蛋白d化S9C469-VH?編碼基因，該載體表達(dá)蛋白d化S9C469-VPR。
[0264] pCAG-d化S9N714,其核巧酸序列為序列53,其中序列53第4635-6774位核巧酸為蛋 白d化S9N714編碼基因，該載體表達(dá)蛋白d化S9N714。
[02化]pCAG-d化s9 口14-VPR，其核巧酸序列為序列54,其中序列54第4635-8215位核巧酸 為蛋白d化s9C714-VH?編碼基因，該載體表達(dá)蛋白d化s9C714-VPR。
[0266] pCAG-dCas9N1154,其核巧酸序列為序列55,其中序列55第4635-8094位核巧酸為 蛋白d化s9Nl 154編碼基因，該載體表達(dá)蛋白d化s9Nl 154。
[0%7] pCAG-dCas9Cl 154-VPR，其核巧酸序列為序列56，其中序列56第4635-6894位核巧 酸為蛋白d化s9Cl 154-VH?編碼基因，該載體表達(dá)蛋白d化s9Cl 154-VPR。
[0268] pCAG-dCas9N204-InteinN，其核巧酸序列為序列57，其中序列57第4635-5511位核 巧酸為蛋白dCas9N204-InteinN編碼基因，該載體表達(dá)蛋白dCas9N204-InteinN。
[0269] pCAG-InteinC-dCas9C204-VPR，其核巧酸序列為序列 58,其中序列 58 第4635-9855 位核巧酸為蛋白InteinC-dCas9C204-VPR編碼基因，該載體表達(dá)蛋白InteinC-dCas9C204- VPR。
[0270] pCAG-dCas9N469-InteinN，其核巧酸序列為序列59,其中序列59第4635-6306位核 巧酸為蛋白dCas9M69-InteinN編碼基因，該載體表達(dá)蛋白dCas9M69-InteinN。
[0271] pCAG-InteinC-dCas9C469-VPR，其核巧酸序列為序列 60,其中序列 60 第4635-9060 位核巧酸為蛋白InteinC-dCas9C469-VPR編碼基因，該載體表達(dá)蛋白InteinC-dCas9C469- VPR。
[0272] pCAG-dCas9N714-InteinN，其核巧酸序列為序列61，其中序列61第4635-8559位核 巧酸為蛋白dCas9N714-InteinN編碼基因，該載體表達(dá)蛋白dCas9N714-InteinN。
[0273] pCAG-InteinC-dCas9C714-VPR，其核巧酸序列為序列 62,其中序列 62 第4635-8325 位核巧酸為蛋白InteinC-dCas9C714-VPR編碼基因，該載體表達(dá)蛋白InteinC-dCas9C714- VPR。
[0274] pCAG-dCas9N1154-InteinN，其核巧酸序列為序列63,其中序列63第4635-8360位 核巧酸為蛋白dCas9Nl 154-InteinN編碼基因，該載體表達(dá)蛋白dCas9Nl 154-InteinN。
[02巧]pCAG-InteinC-dCas9C1154-VPR，其核巧酸序列為序列64,其中序列64第4635- 7004位核巧酸為蛋白InteinC-dCas9C1154-VPR編碼基因，該載體表達(dá)蛋白InteinC- dCas9C1154-VPR。
[0276] d化S9N204的氨基酸序列為序列表中序列6第1-203位，其編碼基因 d化S9N204的核 巧酸序列為序列表序列5第1-609位；
[0277] 此as9C204的氨基酸序列為序列表中序列6第204-1368位，其編碼基因 dCas9C204 的核巧酸序列為序列表序列5第610-4104位；
[0278] 此as9N469的氨基酸序列為序列表中序列6第1-468位，其編碼基因此as9N469的 核巧酸序列為序列表序列5第1-1404位；
[02巧]此as9C469的氨基酸序列為序列表中序列6第469-1368位，其編碼基因 dCas9C469 的核巧酸序列為序列表序列5第1415-4104位；
[0280] d化S9N714的氨基酸序列為序列表中序列6第1-713位，其編碼基因 d化S9N714的核 巧酸序列為序列表序列5第1-2139位；
[0281] 此as9C714的氨基酸序列為序列表中序列6第714-1368位，其編碼基因 dCas9C714 的核巧酸序列為序列表序列5第2140-4104位；
[0282] dCas9N1154的氨基酸序列為序列表中序列6第1-1153位，其編碼基因此日39化154 的核巧酸序列為序列表序列5第1 -3459位；
[028引 dCas9Cl 154的氨基酸序列為序列表中序列6第11 54-1368位，其編碼基因 d化S9C1154的核巧酸序列為序列表序列5第3460-4104位。
[0284] 2、實(shí)驗(yàn)組：
[0285] 不使用 Intein 介導(dǎo)：將 pCAG-dCas9N204 質(zhì)粒、pCAG-dCas9C204-VPR 質(zhì)粒、pCAG- dCas9N469 質(zhì)粒、pCAG-dCas9C469-VPR 質(zhì)粒、pCAG-dCas9N714 質(zhì)粒、pCAG-dCas9C714-VPR 質(zhì) 粒、pCAG-dCas9N1154質(zhì)粒、pCAG-dCas9C1154-VPR質(zhì)粒成對(duì)與pU6-guide RNA1 質(zhì)粒、pEFla- mKate質(zhì)粒（內(nèi)參質(zhì)粒）、pTRE-TagBFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入皿K293細(xì)胞質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入皿K293細(xì)d胞 (每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒各l(K)ng)轉(zhuǎn)染。
[02 化]使用 Intein 介導(dǎo)：將 pCAG-dCas9N204-InteinN 質(zhì)粒、pCAG-InteinC-dCas9C204- VPR 質(zhì)粒、pCAG-dCas9N469-InteinN 質(zhì)粒、pCAG-InteinC-dCas9C469-VPR 質(zhì)粒、pCAG- dCas9N714-InteinN 質(zhì)粒、pCAG-InteinC-dCas9C714-VPR 質(zhì)粒、pCAG-dCas9N1154-InteinN 質(zhì)粒、pCAG-InteinC-dCas9C1154-VPR質(zhì)粒成對(duì)與pU6-guide RNAl質(zhì)粒、pEFla-mKate質(zhì)粒 (內(nèi)參質(zhì)粒）、pTRE-TagBFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入皿K293細(xì)胞質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入肥K293細(xì)胞(每孔轉(zhuǎn)染質(zhì) 粒各l(K)ng)轉(zhuǎn)染。
[0287] 對(duì)照組：為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的正確性，設(shè)置了不加 dCas9帶領(lǐng)下化gBFP未表達(dá)的負(fù)對(duì)照， W及加完整的狀as9的正對(duì)照，并且與在Intein介導(dǎo)下的化s9蛋白調(diào)控效果進(jìn)行對(duì)比。
[0288] 上述各組轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測化gBFP的巧光強(qiáng)度和mKate的 巧光強(qiáng)度。其中mKate作為內(nèi)參，用來標(biāo)定共轉(zhuǎn)染的效率。TagBFP巧光相對(duì)強(qiáng)度=實(shí)驗(yàn)組 化濁FP的巧光強(qiáng)度/同組mKate的巧光強(qiáng)度。使用化gBFP巧光相對(duì)強(qiáng)度來衡量拆分dCas9系 統(tǒng)的效率。具體如下表7。
[0289] 表7為不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
[0290]
[0291]
[0292] 同樣的，按照上面的表，將pCAG-d化s9N204-InteinN、pCAG-InteinC-d化s9C204- VPR 換成pCAG-dCas9N469-InteinN、pCAG-InteinC-dCas9C469-VPR，pCAG-dCas9N714- InteinN、pCAG-InteinC-dCas9C714-VPR，pCAG-dCas9Nl154-InteinN、pCAG-InteinC- d化s9C1154C-VPR，W測試其它Ξ組在有無 Intein介導(dǎo)下的的基因激活效率。
[0293] 轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖13,可W看出，不加 Intein拆分dCas9蛋白系統(tǒng)中化gBFP的相對(duì)巧光 強(qiáng)度顯著弱于Intein介導(dǎo)下的拆分dCas9蛋白系統(tǒng)的化gBFP的相對(duì)巧光強(qiáng)度，符合實(shí)驗(yàn)預(yù) 期，可W證明Intein介導(dǎo)下的拆分d化s9系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)錄激活效率更高。
[0294] 實(shí)施例6、利用拆分的失活狀as9蛋白構(gòu)建Ξ邏輯與口基因開關(guān)
[02巧]1、下述實(shí)驗(yàn)組拆分位點(diǎn)是dCas9蛋白第713-714位氨基酸之間位置和第1153-1154 位氨基酸之間位置。
[0巧6]重組載體的構(gòu)建：
[0297] pCAG-d化S9N714,其核巧酸序列為序列53,其中序列53第4635-6774位核巧酸為蛋 白d化S9N714編碼基因，該載體表達(dá)蛋白d化S9N714。
[0298] pCAG-dCas9M-InteinN質(zhì)粒其核巧酸序列為序列65,其中序列65第4635-6222位核 巧酸為蛋白d化s9M-InteinN編碼基因，該載體表達(dá)蛋白d化s9M-InteinN。
[0299] pCAG-InteinC-dCas9C1154-Suntag 其核巧酸序列為序列 66,其中序列 66 第4635- 6200位核巧酸為蛋白InteinC-dCas9C1154-Suntag編碼基因，該載體表達(dá)蛋白1]116；[]1〇 d&s9Cl 154-Suntag。
[0300] d化S9N714的氨基酸序列為序列表中序列6第1-713位，其編碼基因 d化S9N714的核 巧酸序列為序列表序列5第1-2139位；
[0301] dCas9M的氨基酸序列為序列表中序列6第714-1153位，其編碼基因狀日391的核巧 酸序列為序列表序列5第2140-3459位；
[0302] dCas9Cl 154的氨基酸序列為序列表中序列6第11 54-1368位，其編碼基因 d化S9C1154的核巧酸序列為序列表序列5第3460-4104位；
[0303] 2、實(shí)驗(yàn)組
[0304] pCAG-ScFv-化64質(zhì)粒的核巧酸序列為序列67,其中序列67第2807-3543位核巧酸 編碼CAG啟動(dòng)子，第4635-5896位編碼ScFv-Vp64蛋白。
[0305] 將pCAG-d化 S9N714 質(zhì)粒、pCAG-dCas9M-InteinN質(zhì)粒、pCAG-InteinC-d化 s9Cl 154- Suntag質(zhì)粒、9〔46-5。。￥-化64、9116-旨111(16 RNAl質(zhì)粒、pEFla-mKate質(zhì)粒（內(nèi)參質(zhì)粒）、pTRE- TagBFP、pDT7004質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入皿K293細(xì)胞質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入皿K293細(xì)胞轉(zhuǎn)染。dCas9N714、 dCas9M-InteinN、InteinC-d(^is9C1154-Suntag 會(huì)形成 dCas9-Suntag 然而與排 ΝΑ 結(jié)合并吸 引ScFv-Vp64，最終激活TRE-Ta濁FP。具體示意圖見圖14。
[0306] 轉(zhuǎn)染表如表8。表8中的第2、3、4、5、6、7、8組為負(fù)對(duì)照組，不能形成完整的(1化39。
[0307] 表8為不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 [030引
[0310] 上述各組轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測化gBFP的巧光強(qiáng)度和mKate的 巧光強(qiáng)度。其中mKate作為內(nèi)參，用來標(biāo)定共轉(zhuǎn)染的效率。TagBFP巧光相對(duì)強(qiáng)度=實(shí)驗(yàn)組 化濁FP的巧光強(qiáng)度/同組mKate的巧光強(qiáng)度。使用化gBFP巧光相對(duì)強(qiáng)度來衡量拆分dCas9系 統(tǒng)的效率。
[0311] 轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖15，可W看出只有在dCas9N、d化s9M、dCas9C同時(shí)存在的情況下，下 游報(bào)告巧光才可W被激活，缺少其中任何一段都不能夠激活化gBFP，很好的實(shí)現(xiàn)了 Ξ邏輯 與的功能。
[0312] 實(shí)施例7、基于可拆分的d化s9蛋白構(gòu)建shRNA控制的基因開關(guān)
[0313]已有研究表明突變化s9的PI區(qū)域可W使化s9識(shí)別不同的PAM序列，相關(guān)研究表明 將化s9氨基酸序列做如下突變:將1135氨基酸天冬氨酸(D)突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸(V)、將第1218位 氨基酸甘氨酸(G)突變?yōu)榫彼?R)、將第1335位氨基酸精氨酸(R)突變?yōu)楣劝彼峄⒌?1337位氨基酸蘇氨酸(T)突變?yōu)榫彼?R)，便可W識(shí)別NGCG PAM序列，而且不能識(shí)別NGG PAM序列，從而做到與野生型化s9正交。
[0314]現(xiàn)對(duì)狀as9做上述突變，將1135氨基酸天冬氨酸(D)突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸(V)、將第1218位 氨基酸甘氨酸(G)突變?yōu)榫彼?R)、將第1335位氨基酸精氨酸(R)突變?yōu)楣劝彼峄?、將?1337位氨基酸蘇氨酸(T)突變?yōu)榫彼?R)，突變后dCas9蛋白的氨基酸序列見序列表序列 48,其對(duì)應(yīng)的核巧酸序列見序列表序列47。
[0315] 一、
[0316] 1、重組載體的構(gòu)建
[0317] pUASx5-T9巧9*3-InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14-4xTa巧et~FF4 其核巧酸序列為序列68,其中序列68第2278-9244位核巧酸為蛋白111*6111(：-(^化39"714- 1368)-VPR-2A-TALER14編碼基因，該載體表達(dá)蛋白 InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A- TAL邸14。
[0318] pUASx5-T14+T14*3-InteinC-dCas9C(714-1368)-Krab-2A-TALER9-4xTarget'FF5 其核巧酸序列為序列69,其中序列69第2188-8335位核巧酸為蛋白InteinC-dCas9C(714- 1368)-Krab-2A-TAL邸9編碼基因，該載體表達(dá)蛋白 InteinC-dCas9C(714-1368)-Krab-2A- TAL邸 9。
[0319] pCAG-dCas9N714-InteinN，其核巧酸序列為序列61，其中序列61第4635-8559位核 巧酸為蛋白d化s9N714-InteinN編碼基因，該載體表達(dá)蛋白d化s9N714-InteinN。
[0320] dMCas9C(714-1368)的氨基酸序列為序列表中序列48第714-1368位，其編碼基因 dMCas9C(714-1368)的核巧酸序列為序列表序列47第2140-4104位。
[0321] dCas9C(714-1368)的氨基酸序列為序列表中序列6第714-1368位，其編碼基因 dCas9C(714-1368)的核巧酸序列為序列表序列5第2140-4104位；
[0322] 此as9N714的氨基酸序列為序列表中序列6第1-713位，其編碼基因 dCas9N71的核 巧酸序列為序列表序列5第1-2139位；
[0323] 2.實(shí)驗(yàn)組
[0324] pCAG-Gal4VP16-2A-TagBFP質(zhì)粒的核巧酸序列為序列70,其中序列70第4253-4989 位核巧酸編碼CAG啟動(dòng)子，第6016-7458位編碼Gal4VP16-2A-化濁FP蛋白。
[03巧]pMTRE-EYFP質(zhì)粒的核巧酸序列為序列71，其中序列71第5685-8621位核巧酸編碼 MTRE啟動(dòng)子，第2-721位編碼EYFP蛋白。
[03%] pSIREN_U6-shRNA-F巧質(zhì)粒的核巧酸序列為序列72,其中序列72第229-477位核巧 酸編碼U6啟動(dòng)子，第485-533位編碼shRNA-FF5。
[0327] pSIREN_U6-shRNA-FF4質(zhì)粒的核巧酸序列為序列73,其中序列73第229-477位核巧 酸編碼U6啟動(dòng)子，第485-533位編碼shRNA-FF4。
[03巧]基于可拆分的dCas9蛋白構(gòu)建shRNA控制的基因開關(guān)示意圖見圖16，pUASx5-T9+ T9*3-InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14-4xTarget~FF4，pUASx5-T14+T14*3- InteinC-dCas9C(714-1368)-Krab-2A-TALER9-4xTarget~FF5,受到上游 Gal4VP16 的誘導(dǎo)進(jìn) 而表達(dá)，TALER14和TALER9相互抑制，當(dāng)加入外源化RNA-FF5情況下，TALER9受到抑制，進(jìn)而 系統(tǒng)表達(dá)出更多的dMCas9C(714-1368)-VPR，與dCas9N結(jié)合形成完整的dCas9-VPR在gRNA引 導(dǎo)下激活EYFP。當(dāng)加入外源化RNA-FF4情況下，TALER14受到抑制，進(jìn)而系統(tǒng)表達(dá)出更多的 dCas9C(714-1368)-Krab，與 dCas9N 結(jié)合形成完整的 dCas9-Krab 在 gRNA 引導(dǎo)下抑制 EYFP。具 體轉(zhuǎn)染配比如表9。
[0329] 表9不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
[0330]
[0332] 上述各組轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測化gBFP的巧光強(qiáng)度和EYFP的巧 光強(qiáng)度。其中化gBFP作為內(nèi)參，用來標(biāo)定共轉(zhuǎn)染的效率。EYFP巧光相對(duì)強(qiáng)度=實(shí)驗(yàn)組EYFP的 巧光強(qiáng)度/同組化濁FP的巧光強(qiáng)度。
[0333] 轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖17,可W看出在shRNA-FF5作用下，系統(tǒng)高表達(dá)EYFP，而在shRNA-FF4 的作用下，系統(tǒng)基本不表達(dá)EYFP，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。
[0334] 二、
[03巧]1、重組載體的構(gòu)建
[0336] pUASx5-T9巧9*3-InteinC-dCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14-4xTa巧et~FF4其 核巧酸序列為序列74,其中序列74第2295-9248位核巧酸為蛋白InteinC-dCas9C(714- 1368) -VPR-2A-TALER14編碼基因，該載體表達(dá)蛋白 InteinC-dCas9C(714-1368) -VPR-2A- TAL邸14。
[0337] pUASx5-T14+T14*3-InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER9-4xTarget~FF5 其核巧酸序列為序列75,其中序列75第2262-9635位核巧酸為蛋白InteinC-dMCas9C(714- 1368) -VPR-2A-TALER9編碼基因，該載體表達(dá)蛋白 InteinC-dMCas9C(714-1368) -VPR-2A- TAL邸 9。
[0338] dCas9C(714-1368)的氨基酸序列為序列表中序列6第714-1368位，其編碼基因 dCas9C(714-1368)的核巧酸序列為序列表序列5第2140-4104位。dMCas9C(714-1368)的氨 基酸序列為序列表中序列48第714-1368位，其編碼基因 dMCas9C(714-1368)的核巧酸序列 為序列表序列47第2140-4104位；
[0339] 2.實(shí)驗(yàn)組
[0340] pTRE-EYFP質(zhì)粒的核巧酸序列為序列76,其中序列76第3615-3929位核巧酸編碼 TRE啟動(dòng)子，第4065-4764位編碼EYFP蛋白。
[0%1] pMTRE-mKate質(zhì)粒的核巧酸序列為序列77,其中序列77第1859-2195位核巧酸編碼 MTRE啟動(dòng)子，第2292-2997位編碼mKate蛋白。 惦創(chuàng)基于可拆分的dCas9蛋白構(gòu)建shRNA控制的基因開關(guān)示意圖見圖18，pUASx5-T9+ T9*3-InteinC-dCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14-4xTarget-FF4，pUASx5-T14+T14*3- InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER9-4xTarget^'FF5, 受到上游 Gal4VP16 的誘導(dǎo)進(jìn) 而表達(dá)，TALER14和TALER9相互抑制，當(dāng)加入外源化RNA-FF5情況下，TALER9受到抑制，進(jìn)而 系統(tǒng)表達(dá)出更多的dCas9C(714-1368)-VPR，與dCas9N結(jié)合形成完整的dCas9-VPR，其識(shí)別 NGG PAM序列，在gRNAl引導(dǎo)下激活EYFP。當(dāng)加入外源化RNA-FF4情況下，TALER14受到抑制， 進(jìn)而系統(tǒng)表達(dá)出更多的dMCas9C(714-1368)-VPR，與dCas9N結(jié)合形成完整的dMCas9-VPR，其 識(shí)別NGCG PAM序列，在gRNA引導(dǎo)下激活mKate。具體轉(zhuǎn)染配比如表10。
[0343] 表10不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
[0344]
[0345]
[0346] 上述各組轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測化gBFP的巧光強(qiáng)度和EYFP的巧 光強(qiáng)度W及mKate的巧光強(qiáng)度。其中化gBFP作為內(nèi)參，用來標(biāo)定共轉(zhuǎn)染的效率。EYFP巧光相 對(duì)強(qiáng)度=實(shí)驗(yàn)組EYFP的巧光強(qiáng)度/同組TagBFP的巧光強(qiáng)度。mKate巧光相對(duì)強(qiáng)度=實(shí)驗(yàn)組 mKate的巧光強(qiáng)度/同組化濁FP的巧光強(qiáng)度。
[0347] 轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖19，可W看出在shRNA-FF5作用下，系統(tǒng)高表達(dá)EYFP，而在shRNA-FF4 的作用下，系統(tǒng)高表達(dá)mKate，符合我們的實(shí)驗(yàn)預(yù)期。
[0348] 實(shí)施例8、基于可拆分的d化S 9蛋白構(gòu)建內(nèi)源m i cr oRNA控制的基因開關(guān)
[0349] 1、重組載體的構(gòu)建
[0350] pUASx5-T9巧9*3-InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14-4xTa巧et~T18a 其核巧酸序列為序列78,其中序列78第2278-9238位核巧酸為蛋白111*6111(：-(^化39"714- 1368)-VPR-2A-TALER14編碼基因，該載體表達(dá)蛋白 InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A- TAL邸14。
[0：351] pUASx5-T14+T14*3-InteinC-dCas9C(714-1368)-Krab-2A-TALER9-4xTarget'T21 其核巧酸序列為序列79,其中序列79第2188-8334位核巧酸為蛋白InteinC-dCas9C(714- 1368)-Krab-2A-TAL邸9編碼基因，該載體表達(dá)蛋白 InteinC-dCas9C(714-1368)-Krab-2A- TAL邸 9。
[0352] dMCas9C(714-1368)的氨基酸序列為序列表中序列48第714-1368位，其編碼基因 dMCas9C(714-1368)的核巧酸序列為序列表序列47第2140-4104位。dCas9C(714-1368)的氨 基酸序列為序列表中序列6第714-1368位，其編碼基因 dCas9C(714-1368)的核巧酸序列為 序列表序列5第2140-4104位；
[0巧3] 2.實(shí)驗(yàn)組
[0354]在實(shí)施例7中基于可拆分的dCas9蛋白構(gòu)建了由shRNA控制的基因開關(guān)，在本實(shí)施 例中，我們用microRNA21替代化RNA-FF5,相應(yīng)的祀點(diǎn)Target~FF5也由T21替代，用 microRNAlSa 替代 aiRNA-FF4,相應(yīng)的祀點(diǎn) Target~FF4 也由 T18a 替代。MicroRNA21 在 Hela 細(xì) 胞系中高表達(dá)，microRNAlSa在化k293細(xì)胞中高表達(dá)。具體示意圖見圖20。
[03 巧]pUASx5-T9巧9*3-InteinC-dMCas9C(714-1368)-VPR-2A-TALER14-4xTarget~ T18a，pUASx5-T14+T14*3-InteinC-dCas9C(714-1368)-Krab-2A-TALER9-4xTarget~T21，受 到上游Gal4VP16的誘導(dǎo)進(jìn)而表達(dá)，TALER14和TALER9相互抑制，當(dāng)Hela細(xì)胞中，microRNA21 高表達(dá)，TALER9受到抑制，進(jìn)而系統(tǒng)表達(dá)出更多的dMCas9C(714-1368)-VPR，與dCas9N結(jié)合 形成完整的dCas9-VPR在gRNA引導(dǎo)下激活EYFP。當(dāng)Hek293細(xì)胞中，microRNAlSa高表達(dá)， TAL邸14受到抑制，進(jìn)而系統(tǒng)表達(dá)出更多的dCas9C(714-1368)-Krab，與dCas9N結(jié)合形成完 整的dCas9-Krab在gRNA引導(dǎo)下抑制EYFP。具體轉(zhuǎn)染配比如表11。
[0356] 表11不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
[0357]
[0358] 上述各組轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測化gBFP的巧光強(qiáng)度和EYFP的巧 光強(qiáng)度。其中化gBFP作為內(nèi)參，用來標(biāo)定共轉(zhuǎn)染的效率。EYFP巧光相對(duì)強(qiáng)度=實(shí)驗(yàn)組EYFP的 巧光強(qiáng)度/同組化濁FP的巧光強(qiáng)度。
[0359] 轉(zhuǎn)染結(jié)果見圖21，可W看出在化la細(xì)胞中，系統(tǒng)高表達(dá)EYFP，而在化k293細(xì)胞中， 系統(tǒng)基本低表達(dá)EYFP，符合的實(shí)驗(yàn)預(yù)期。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 蛋白組，為將Cas9蛋白氨基酸序列從如下至少一種位置拆分得到的不同段氨基酸序 列組成的蛋白組； 所述位置為第203-204位之間、第468-469位之間、第713-714位之間和第1153-1154之 間。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白組，為如下1)_4)中任一種： 1) 由蛋白Cas9N204和蛋白Cas9C204組成； 所述蛋白Cas9N204和所述蛋白Cas9C204是將Cas9蛋白氨基酸序列從第203-204位之間 拆分，形成的兩段蛋白； 2) 由蛋白Cas9N469和蛋白Cas9C469組成； 所述Cas9N469和蛋白Cas9C469是將Cas9蛋白氨基酸序列從第468-469位之間拆分，形 成的兩段蛋白； 3) 由蛋白Cas9N714和蛋白Cas9C714組成； 所述蛋白Cas9N714和蛋白Cas9C714是將Cas9蛋白氨基酸序列從第713-714位之間拆 分，形成的兩段蛋白； 4) 由蛋白Cas9Nl 154和蛋白Cas9Cl 154組成； 所述蛋白Cas9Nl 154和蛋白Cas9Cl 154是將Cas9蛋白氨基酸序列從第1153-1154位之間 拆分，形成的兩段蛋白； 5) 由蛋白 Cas9N714、Cas9M 和 Cas9Cl 154 組成； 所述蛋白Cas9N714、Cas9M和Cas9C1154是將Cas9蛋白氨基酸序列從第713-714位之間 和第1153-1154位之間拆分，形成的3段蛋白。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白組，其特征在于:所述Cas9蛋白為SpCas9或dCas9;所 述SpCas9的氨基酸序列為序列表中序列2,所述dCas9的氨基酸序列為序列表中序列6或序 列48。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的蛋白組，其特征在于： 所述蛋白Cas9N204氨基酸序列為序列表中序列2第1-203位或序列6第1-203位或序列 48 第 1-203位； 所述蛋白Cas9C204氨基酸序列為序列表中序列2第204-1368位或序列6第204-1368位 或序列48第204-1368位； 所述蛋白Cas9N469氨基酸序列為序列表中序列2第1-468位或序列6第1-468位或序列 48 第 204-1368位； 所述蛋白Cas9C469氨基酸序列為序列表中序列2第469-1368位或序列6第469-1368位 或序列48第469-1368位； 所述蛋白Cas9N714氨基酸序列為序列表中序列2第1-713位或序列6第1-713位或序列 48第 1-713位； 所述蛋白Cas9C714氨基酸序列為序列表中序列2第714-1368位或序列6第714-1368位 或序列48第1-713位； 所述蛋白Cas9N1154氨基酸序列為序列表中序列2第1-1153位或序列6第1-1153位或序 列48第1-1153位； 所述蛋白Cas9C1154氨基酸序列為序列表中序列2第1154-1368位或序列6第1154-1368 位或序列48第1154-1368位。5. 融合蛋白組，為如下A)-D)中任一種： A) 由融合蛋白Cas9N204-InteinN和融合蛋白InteinC-Cas9C204組成的融合蛋白組； 所述融合蛋白Cas9N204-InteinN為自N端至C端依次由權(quán)利要求1-4任一中所述蛋白 Cas9N204與 InteinN 蛋白組成； 所述融合蛋白Cas9C204-InteinC為自N端至C端依次由InteinC蛋白與權(quán)利要求1-4任 一中所述蛋白Cas9C204組成； B) 由融合蛋白Cas9N469-InteinN和融合蛋白Cas9C469-InteinC組成的融合蛋白組； 所述融合蛋白Cas9N469-InteinN為自N端至C端依次由將權(quán)利要求1-4任一中所述蛋白 Cas9N469與所述InteinN蛋白組成； 所述融合蛋白Cas9C469-InteinC為自N端至C端依次由所述InteinC蛋白和權(quán)利要求1-3任一中所述蛋白Cas9C469組成； C) 由融合蛋白Cas9N714-InteinN和融合蛋白Cas9C714-InteinC組成的融合蛋白組； 所述融合蛋白Cas9N714-Inte inN為自N端至C端依次由權(quán)利要求1 -4任一中所述蛋白 Cas9N714與所述InteinN蛋白融合形成融合蛋白Cas9N469_InteinN; 所述融合蛋白Cas9C714-InteinC為自N端至C端依次由所述InteinC蛋白和權(quán)利要求1-3任一中所述蛋白Cas9C714組成； D) 由融合蛋白Cas9N1154-InteinN和融合蛋白Cas9C1154-InteinC組成的融合蛋白組； 所述融合蛋白〇3891'11154-11^6；[111'1為自1'1端至(]端依次由權(quán)利要求1-4任一中所述蛋白 Cas9Nl 154與所述InteinN蛋白組成； 所述融合蛋白Cas9Cl 154-InteinC為自N端至C端依次由所述InteinC蛋白和權(quán)利要求 1-3任一中所述蛋白Cas9Cl 154在組成； 所述InteinN蛋白氨基酸序列為序列表中序列4第1-89位； 所述InteinC蛋白氨基酸序列為序列表中序列4第90-126位。6. 融合蛋白組，為如下1)_4)中任一種： 1) 由權(quán)利要求5中的所述融合蛋白Cas9N204-InteinN和融合蛋白InteinC-Cas9C204-功能結(jié)構(gòu)域蛋白組成的融合蛋白組； 所述融合蛋白InteinC-Cas9C204-功能結(jié)構(gòu)域蛋白為自N端至C端依次由權(quán)利要求5中 的所述InteinC蛋白、權(quán)利要求1-4任一中所述蛋白Cas9C204和功能結(jié)構(gòu)域蛋白組成； 2) 由權(quán)利要求5中的所述融合蛋白Cas9N469-InteinN和融合蛋白Cas9C469-InteinC-功能結(jié)構(gòu)域蛋白組成的融合蛋白組； 所述融合蛋白Cas9C469-InteinC-功能結(jié)構(gòu)域蛋白為自N端至C端依次由權(quán)利要求5中 的所述InteinC蛋白、權(quán)利要求1-4任一中所述蛋白Cas9C469和功能結(jié)構(gòu)域蛋白組成； 3) 由權(quán)利要求5中的所述融合蛋白Cas9N714-InteinN和融合蛋白Cas9C714-InteinC-功能結(jié)構(gòu)域蛋白組成的融合蛋白組； 所述融合蛋白Cas9C714-InteinC-功能結(jié)構(gòu)域蛋白為自N端至C端依次由所述InteinC 蛋白、權(quán)利要求1-4任一中所述蛋白Cas9C714和功能結(jié)構(gòu)域蛋白組成； 4) 由權(quán)利要求5中的所述融合蛋白〇389~1154-11^611^和融合蛋白〇389(：1154-InteinC-功能結(jié)構(gòu)域蛋白組成的融合蛋白組； 所述融合蛋白Cas9C1154-InteinC-功能結(jié)構(gòu)域蛋白為自N端至C端依次由所述InteinC 蛋白和權(quán)利要求1-4任一中所述蛋白Cas9Cl 154和功能結(jié)構(gòu)域蛋白組成。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的融合蛋白組，其特征在于： 所述功能結(jié)構(gòu)域蛋白為調(diào)控蛋白，所述調(diào)控蛋白具體為VP64蛋白或KRAB蛋白。8. 重組載體組，為如下1)_8)中任一種： 1) 由含有權(quán)利要求1-4任一中所述蛋白Cas9N204編碼基因的重組載體和含有權(quán)利要求 1 -4任一中所述蛋白Cas9C204編碼基因的重組載體組成； 2) 由含有權(quán)利要求1-4任一中所述蛋白Cas9N469編碼基因的重組載體和含有權(quán)利要求 1-4任一中所述蛋白Cas9C469編碼基因的重組載體組成； 3) 由含有權(quán)利要求1-4任一中所述蛋白Cas9N714編碼基因的重組載體和含有權(quán)利要求 1-4任一中所述蛋白Cas9C714編碼基因的重組載體組成； 4) 由含有權(quán)利要求1-4任一中所述蛋白Cas9N1154編碼基因的重組載體和含有權(quán)利要 求1-4任一中所述蛋白Cas9C1154編碼基因的重組載體組成； 5) 由含有權(quán)利要求5中所述融合蛋白Cas9N204-InteinN編碼基因的重組載體和含有權(quán) 利要求5中所述融合蛋白InteinC-Cas9C204編碼基因的重組載體組成； 6) 由含有權(quán)利要求5中所述融合蛋白Cas9N469-InteinN編碼基因的重組載體和含有權(quán) 利要求5中所述融合蛋白InteinC-Cas9C469編碼基因的重組載體組成； 7) 由表達(dá)權(quán)利要求5中所述融合蛋白Cas9N714-InteinN編碼基因的重組載體和表達(dá)權(quán) 利要求4中所述融合蛋白Cas9C714編碼基因的重組載體組成； 8) 由表達(dá)權(quán)利要求5中所述融合蛋白Cas9N1154-InteinN編碼基因的重組載體和表達(dá) 權(quán)利要求5中所述融合蛋白InteinC-Cas9Cl 154編碼基因的重組載體組成； 9) 由含有權(quán)利要求6或7中所述融合蛋白Cas9N204-InteinN編碼基因的重組載體和含 有權(quán)利要求6或7中所述融合蛋白InteinC-Cas9C204-功能結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因的重組載體 組成； 10) 由含有權(quán)利要求6或7中所述融合蛋白Cas9N469-InteinN編碼基因的重組載體和含 有權(quán)利要求6或7中所述融合蛋白InteinC-Cas9C469-功能結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因的重組載體 組成； 11) 由表達(dá)權(quán)利要求6或7中所述融合蛋白Cas9N714-InteinN編碼基因的重組載體和表 達(dá)權(quán)利要求6或7中所述融合蛋白InteinC-Cas9C714-功能結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因的重組載體 組成； 12) 由表達(dá)權(quán)利要求6或7中所述融合蛋白Cas9N1154-InteinN編碼基因的重組載體和 表達(dá)權(quán)利要求6或7中所述融合蛋白InteinC-Cas9C1154-功能結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因的重組 載體組成。9. 權(quán)利要求1-4任一中所述蛋白組或權(quán)利要求5-7中任一所述融合蛋白或權(quán)利要求8所 述重組載體在基因編輯中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1-4任一中所述蛋白組或權(quán)利要求5-7中任一所述融合蛋白或權(quán)利要求8所 述重組載體在靶向定位或基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活或基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄抑制中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求1-4任一中所述蛋白組或權(quán)利要求5-7中任一所述融合蛋白或權(quán)利要求8 所述重組載體在制備鑒定膀胱癌細(xì)胞產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK106011104SQ201610341363
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】謝震, 馬大程, 彭曙光
【申請人】清華大學(xué)