一種利用無?；碧侵苌锕矁r修飾的溶菌酶及其修飾方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用槐糖脂衍生物共價修飾的溶菌酶及其修飾方法和應(yīng)用，該修飾方法包括以下步驟：(1)將無酰基槐糖脂衍生物的活性酯溶解在DMSO，然后加入天然溶菌酶的NaHCO3水溶液，攪拌條件下進(jìn)行縮合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后得到共價修飾混合物；所述的槐糖脂衍生物為羧酸型無?；碧侵?；(2)依次采用去離子水和磷酸鹽緩沖液對步驟(1)得到的緩沖液體系進(jìn)行透析，得到的透析物經(jīng)過離心分離得到共價修飾后的溶菌酶。所得到的溶菌酶不僅能有效抑制革蘭氏陽性菌活性，同時也能顯著抑制革蘭氏陰性菌活性，可作為多功能食品保鮮劑。
【專利說明】
-種利用無醜基槐糖脂衍生物共價修飾的溶菌酶及其修飾方 法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及利用生物表面活性劑槐糖脂共價修飾蛋清溶 菌酶，從而擴(kuò)展天然溶菌酶的抗菌譜，進(jìn)一步拓寬溶菌酶的應(yīng)用范圍，特別是在食品保鮮領(lǐng) 域的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 溶菌酶是一種堿性酶，可W水解黏多糖。溶菌酶主要通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酷 胞壁酸和N-乙酷氨基葡糖間的β-1，4糖巧鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖膚，導(dǎo) 致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。存在于動植物體內(nèi)和人的外分泌液中，目前可W 從牛、羊、馬等乳汁中分離出溶菌酶，其中蛋清溶菌酶含量最豐富，約為0.3%~0.4%。從雞 蛋清中提取分離的溶菌酶是由18種，129個氨基酸殘基構(gòu)成的單一膚鏈。它富含堿性氨基 酸，有4對二硫鍵維持酶構(gòu)型，其Ν端為賴氨酸，C端為亮氨酸?？煞纸馊鼙谖⑶蚓?、巨大芽抱 桿菌、黃色八疊球菌等革蘭陽性菌?；瘜W(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，對熱也極為穩(wěn)定。溶菌酶的最適溫 度為5(TC，最適pH為6，溶菌酶具有熱穩(wěn)定性，100攝氏度保持十分鐘仍具有活性。它作為一 種小分子蛋白質(zhì)，具有對組織無刺激無毒性等優(yōu)點。在《關(guān)于批準(zhǔn)溶菌酶等物質(zhì)為食品添加 劑及部分食品添加劑和營養(yǎng)強(qiáng)化劑擴(kuò)大使用范圍、用量的公告（（2010年第23號）中》，溶菌 酶已經(jīng)可W在干酪和發(fā)酵酒中作為防腐劑使用。
[0003] 溶菌酶應(yīng)用時具有如下優(yōu)點：（1)溶菌酶是很穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，有較強(qiáng)的抗熱性。蛋 清溶菌酶是C型，是已知的最耐熱的酶；（2)溶菌酶不會因為有機(jī)溶劑的處理而失活，當(dāng)轉(zhuǎn)移 到水溶液中時，溶菌酶的活力可全部恢復(fù)；（3)溶菌酶可被冷凍或干燥處理，且活力穩(wěn)定；
[4] 溶菌酶適宜抑5.3-6.4,可用于低酸性食品防腐；（5)溶菌酶生產(chǎn)成本較低；（6)溶菌酶作 為防腐劑安全性高。溶菌酶是一種天然蛋白質(zhì)，1992年FA0/WT0的食品添加劑協(xié)會已經(jīng)認(rèn)定 溶菌酶在食品中應(yīng)用是安全的。
[0004] 但由于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜外壁存在一層脂多糖LPS，天然的溶菌酶很難溶解 該膜層，所W無法有效抑制該類菌的活性，限制了溶菌酶的應(yīng)用范圍。目前，為了提高溶菌 酶對大腸桿菌等革蘭氏陰性細(xì)菌的抑菌效果，國內(nèi)外已經(jīng)做了一些相關(guān)研究，可W通過熱 處理、利用還原劑還原溶菌酶的二硫鍵添加其它化學(xué)物質(zhì)與溶菌酶協(xié)同作用等改變酶的構(gòu) 象。溶菌酶的化學(xué)修飾研究主要集中在：利用化學(xué)小分子（small molecule)或多糖 (poly saccharides)與溶菌酶結(jié)合（conjugation)進(jìn)而修飾溶菌酶，或利用蛋白水解酶 (proteol^ic enzymes)修飾的溶菌酶。
[0005] 此外，槐糖脂（sophorolipids)是一類無毒、可生物降解的生物表面活性劑?；碧?脂亦可用作食品乳化劑和發(fā)泡劑。近年來，研究者們還發(fā)現(xiàn)一些槐糖脂還表現(xiàn)出良好的抑 菌活性，可用作多功能食品保鮮劑。我們利用無酷基槐糖脂衍生物(D化-C18共價修飾天然 蛋清溶菌酶，改善其對革蘭氏陰性菌的抑菌效果，從而擴(kuò)增溶菌酶的抗菌譜，進(jìn)一步拓寬溶 菌酶的應(yīng)用范圍，特別是在食品保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種利用生物表面活性劑槐糖脂衍生物共價修飾的天然蛋清溶菌 酶及其修飾方法，改善溶菌酶對革蘭氏陰性菌的抑菌效果，從而擴(kuò)展溶菌酶的抗菌譜，進(jìn)一 步拓寬溶菌酶的應(yīng)用范圍。
[0007] -種利用無酷基槐糖脂衍生物共價修飾的溶菌酶，由無酷基槐糖脂衍生物與天然 溶菌酶通過共價結(jié)合得到，其中，所述的無酷基槐糖脂衍生物的簇基與天然溶菌酶的氨基 酸殘基形成酷胺鍵；
[000引所述的無酷基槐糖脂衍生物為簇酸型無酷基槐糖脂，結(jié)構(gòu)如下式所示：
[0009]
[0010] 本發(fā)明中，使簇酸型無酷基槐糖脂衍生物與溶菌酶的氨基酸殘基通過共價結(jié)合得 到修飾后的溶菌酶，從而將槐糖脂結(jié)構(gòu)引入到溶菌酶的表面，經(jīng)過活性測試，發(fā)現(xiàn)其對革蘭 氏陰性菌具有更好的抑菌效果，同時，對其抗菌譜也有較大的擴(kuò)展。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種溶菌酶的修飾方法，包括W下步驟：
[0012] (1)將槐糖脂衍生物的活性醋溶解在DMS0,然后加入溶菌酶的化肥化水溶液，攬拌 條件下進(jìn)行縮合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，加入甘氨酸溶液得到反應(yīng)混合物；
[0013] 所述的槐糖脂衍生物為簇酸型無酷基槐糖脂；
[0014] (2)依次采用去離子水和憐酸鹽緩沖液對步驟(1)得到的緩沖液進(jìn)行透析，得到的 透析物經(jīng)過離屯、分離得到修飾后的溶菌酶。
[0015] 形成活性醋的目的是為了活化簇基，使得槐糖脂衍生物能夠與溶菌酶的氨基成 鍵，完成修飾過程，作為優(yōu)選，所述的活性醋為N-徑基班巧酷亞胺醋。
[0016] 作為優(yōu)選，所述的溶菌酶為蛋清溶菌酶，采用鹽提法制備的蛋清溶菌酶的成本較 低。
[0017] 作為優(yōu)選，所述的簇酸型無酷基槐糖脂(D化-C18)的添加量為1.0-2.Og/L。所述的 溶菌酶的添加量為1.5-2.0肖/1。溶菌酶與無酷基槐糖脂衍生物的混合溫度為30°(>35°(：。通 過上述方法可W無酷基槐糖脂衍生物的活性幾基與溶菌酶的氨基酸殘基通過共價結(jié)合得 到修飾后的溶菌酶，從而將槐糖脂結(jié)構(gòu)引入到溶菌酶的表面。
[0018] 具體修飾方法如下：將無酷基槐糖脂衍生物的N-徑基班巧酷亞胺醋溶解在5mL DMS0形成溶液的最終濃度為0.7mM，攬拌情況下，逐滴滴加入25mL 1 %化肥化的蛋清溶菌酶 溶液(0.2mM)，繼續(xù)緩慢攬拌30°C下反應(yīng)化。反應(yīng)結(jié)束后，向體系內(nèi)加入25mL lOOmM的甘氨 酸溶液，30°C恒溫lOmin。反應(yīng)體系室溫下利用去離子水透析，再利用抑7.0 20mM憐酸鹽緩 沖液，4°C，透析1天左右。為了除去未反應(yīng)的簇酸型無酷基槐糖脂(D化-C18)，透析物在5°C， 12000巧m離屯、1 Omin，做種收集懸浮物。
[0019] 作為優(yōu)選，所述的簇酸型無酷基槐糖脂(D化-C18)采用如下方法制備得到：
[0020]在隔絕水汽的條件下，向槐糖脂中加入絕干甲醇和甲醇鋼，然后加熱回流進(jìn)行反 應(yīng)，然后降至室溫，加入堿液繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)過酸化得到所述的簇酸型無酷基槐 糖脂。
[0021 ]具體通過W下步驟制備得到：
[0022] 向lOOmL的圓底燒瓶中順序加入槐糖脂，絕干甲醇和甲醇鋼，CaCb保護(hù)，加熱回流 祉，降至室溫，再加入適量K0H水溶液，繼續(xù)回流化，減壓除溶劑，溶解于去離子水溶，利用 肥1調(diào)抑至苯酪呈紅色，置于冰浴中至有沉淀析出，通過硅膠層析柱分離得到產(chǎn)物。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種所述的槐糖脂的發(fā)酵法制備方法，包括如下步驟：
[0024] (1)將購置的凍干假絲酵母菌C.bombicola ATCC 22214均勻分散至ImL滅菌后的 YM培養(yǎng)基中（YM培養(yǎng)基組成包括，單位化:酵母粉3 . Og，麥芽粉3 . Og，蛋白腺5 . Og，葡萄糖 10.0 g，用蒸饋水定容至1L)。隨后畫線接種到Y(jié)M瓊脂培養(yǎng)基斜面上(YM瓊脂培養(yǎng)基組成包 括:酵母粉3. Og/L，麥芽粉3. Og/L，蛋白腺5. Og/L，葡萄糖10.0 g/L，瓊脂20.0 g/L)，于25°C恒 溫2天后，挑取單菌落接種至滅菌后的液體培養(yǎng)基中，25°C，200巧m培養(yǎng)24K液體培養(yǎng)基組 成包括，單位1L:酵母粉3.0g，麥芽粉3.0g，蛋白腺5.0g，葡萄糖lO.Og，用蒸饋水定容至1L)， 并分裝于甘油管中，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0025] (2)將上述步驟(1)菌懸液按照體積百分比5%的接種量將菌懸液接入上述冷卻的 液體種子培養(yǎng)基中，2500-血規(guī)格的搖瓶，裝液量為500mL，搖瓶于25 °C，200巧m，培養(yǎng)2地，得 到液體種子；
[0026] (3)將上述步驟(2)液體種子培養(yǎng)基接種至滅菌后的裝配有電子數(shù)控與攬拌裝置 的10-L發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度25°C，轉(zhuǎn)速不超過1200rpm，溶氧控制在30%，利用6M氨氧 化鋼溶液調(diào)控體系抑3.5。當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入靜止期時，將葡萄糖(50%，v/v)及菜巧油W適 宜的速率添加入發(fā)酵罐中，發(fā)酵過程中每隔化監(jiān)測發(fā)酵液中的葡萄糖濃度，當(dāng)葡萄糖濃度 低于150mM時，補(bǔ)加葡萄糖。
[0027] (4)發(fā)酵72h結(jié)束后，將發(fā)酵液于8000巧m下離屯、lOmin，離屯、后，發(fā)酵液體系呈Ξ 相，最上層為培養(yǎng)基液體層，中間層主要含槐糖脂產(chǎn)物，而最下層固體相為細(xì)胞層?；厥兆?底層細(xì)胞W備循環(huán)復(fù)用。同時利用等體積乙酸乙醋洗涂Ξ次底層，用與等體積的有機(jī)溶劑 正己燒回收發(fā)酵液中未反應(yīng)的油脂(洗3次）。合并乙酸乙醋，減壓除溶劑得槐糖脂粗產(chǎn)品， 得到產(chǎn)物產(chǎn)量為200-220g/L。
[0028] 作為優(yōu)選，步驟（5)中所述無酷基槐糖脂衍生物與甲醇鋼的添加量摩爾比為1: 015: -1:0.2。回流時間3-化。所用的酸的濃度無特別嚴(yán)格的要求。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種利用槐糖脂衍生物共價修飾的溶菌酶，由所述的修飾方法制 備得到。
[0030] 本發(fā)明還提供了一種所述的溶菌酶的應(yīng)用，所述的溶菌酶用于制備多功能食品保 鮮劑或者抑菌劑。
[0031] 同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0032] (1)本發(fā)明利用生物表面活性劑槐糖脂衍生物對天然蛋清溶菌酶實施了有效化學(xué) 修飾，酶在修飾過程中的酶活損失小，調(diào)整酶活性中屯、的空間結(jié)構(gòu)，強(qiáng)化了溶菌酶的抑菌效 果，開發(fā)了一種新穎的溶菌酶修飾修飾劑及方法，方式簡單靈活、是一種頗具實用價值的生 物工程技術(shù)。
[0033] (2)本發(fā)明提供的一種擴(kuò)展溶菌酶抗菌譜的方法，較之天然溶菌酶，不僅對革蘭氏 陽性菌具有抑菌活性，而且對革蘭氏陰性菌的抑菌活性大幅提高，有效拓展了溶菌酶的抑 菌譜。
【附圖說明】
[0034] 圖1是無酷基槐糖脂衍生物的核磁碳譜圖；
[0035] 圖2是天然溶菌酶與槐糖脂衍生物共價修飾溶菌酶的酶活力對比；
[0036] 圖3是槐糖脂衍生物共價修飾溶菌酶對常見食源性致病菌的抑菌圈直徑。
【具體實施方式】
[0037] 實施例1
[0038] 無酷基槐糖脂衍生物的制備方法：
[0039] 向lOOmL的圓底燒瓶中順序加入假絲酵母菌C.bombicola ATCC22214發(fā)酵產(chǎn)物 29.80g(43.27mmol，leq)，50mL 絕干甲醇和 1.621^(6.49111111〇1，0.1569)甲醇鋼，〔曰(：12保護(hù)， 加熱回流化，降至室溫，再加入25mL20 %K0H水溶液，繼續(xù)回流化，減壓除溶劑，溶解于去離 子水中，利用HC1調(diào)pH至苯酪呈紅色，置于冰浴中至有沉淀析出，通過硅膠層析柱分離得到 產(chǎn)物，流動相為氯仿/甲醇（3:22to 4:22，v/v)</H NMR(C曲0H-d4):5.35(2H，m，H-9andH- 10),4.63(lH，d，J)8.1Hz，Η-Γ),4.44(lH，d，J)7.5Hz，Η-Γ),3.82-3.87(3H，m，H-6'b，H-護(hù) b，andH-17)，3.63-3.68(3H，m，H-6'a，H-6"a，andH-5")，3.53-3.58(2H，m，H-2'andH- 3'），3.21-3.41(5H，m，H-3"，H-2"，H-4"，H-4'，andH-5'），2.27(2H，t，J)7.3Hz，H-2)，2.03- 2.05(4H，m，H-8and H-11),1.57-1.62(4H，m，H-3and H-16)，1.30-1.46(16H，m，H-4-7and H-12-15)，1.24(3H，dJ)6.0Hz，H-18)。
[0040] 實施例2
[0041] 利用簇酸型無酷基槐糖脂(D化-C18)共價修飾天然蛋清溶菌酶：
[0042] 1)將無酷基槐糖脂衍生物的N-徑基班巧酷亞胺醋溶解在5mL DMS0形成溶液的最 終濃度為0.7mM，攬拌情況下，逐滴滴加入25mL，0.2mM，1 %化肥化的蛋清溶菌酶水溶液，繼 續(xù)緩慢攬拌30°C下反應(yīng)化。反應(yīng)結(jié)束后，向體系內(nèi)加入25mL lOOmM的甘氨酸溶液，30°C恒溫 lOmin，室溫下利用去離子水透析，再20mM憐酸鹽緩沖液透析，pH 7.0,4°C維持1天左右。為 了除去未反應(yīng)的酸型全乙酷基槐糖脂，透析物在5°C1200化pm離屯、lOmin，做種收集懸浮物。
[0043] 2)溶菌酶酶活測定：
[0044] 將待測酶液和底物懸液分別置于25°C水浴中保溫20min，吸取底物懸液2.8mL，置 于1 cm比色皿中比色測定450nm下的0D值，此為零時讀數(shù)，然后加入酶液0.2mL，迅速搖均，從 加入酶液起計時，每隔Imin測定1次450nm下的0D值，共測定3次。本實驗的酶活力單位定義 為:每分鐘0D值下降0.001為1個活力單位(25°C、pH值6.2)，即每毫克活力單位化/111旨）=^ 0D4s/min) X 10^樣品的質(zhì)量(mg)?；碧侵苌镄揎椚芫该富钍翘烊幻富?2.9%。
[0045] 實施例3
[0046] 抑菌圈的測定：采用杯碟法。取20mL溶化的固體培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中，凝固后，取 0.2mL濃度為106-107C即/血的各菌懸液均勻涂布于固體培養(yǎng)基中，lOmin后，將牛津杯放置 于培養(yǎng)皿表面，加入樣品液，蓋好培養(yǎng)基，置于37Γ恒溫培養(yǎng)2地，測抑菌圈直徑。每個樣品 液實驗重復(fù)3次，取平均值。
【主權(quán)項】
1. 一種利用無?；碧侵苌锕矁r修飾的溶菌酶，其特征在于，由無?；碧侵?生物與天然溶菌酶通過共價結(jié)合得到，其中，所述的無?；碧侵苌锏聂然c天然溶 菌酶的氨基酸殘基形成酰胺鍵； 所述的無酰基槐糖脂衍生物為羧酸型無?；碧侵?，結(jié)構(gòu)如下式所示：2. -種如權(quán)利要求1所述的溶菌酶的修飾方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將所述的無?；碧侵苌锏幕钚怎ト芙庠贒MSO中，然后加入天然溶菌酶的 NaHCO3水溶液，攪拌條件下進(jìn)行縮合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后得到反應(yīng)混合物； (2) 依次采用去離子水和磷酸鹽緩沖液對步驟（1)得到的混合液進(jìn)行透析，得到的透析 物經(jīng)過離心分離得到共價修飾后的溶菌酶。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的溶菌酶的修飾方法，其特征在于，所述的活性酯為N-羥基琥珀 酰亞胺酯。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的溶菌酶的修飾方法，其特征在于，所述的溶菌酶為蛋清溶菌 酶。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的溶菌酶的修飾方法，其特征在于，所述的羧酸型無?；碧侵?米用如下方法制備得到： 在無水條件下，向槐糖脂中加入無水甲醇和甲醇鈉，繼續(xù)加熱回流進(jìn)行反應(yīng)，然后降至 室溫，加入堿液繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)過酸化得到所述的羧酸型無?；碧侵?。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的溶菌酶的修飾方法，其特征在于，所述的槐糖脂與甲醇鈉的摩 爾比為1:0.15-1:0.2，反應(yīng)回流時間為3-611 ; 所用堿液為NaOH水溶液，質(zhì)量百分比濃度為20 %。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的溶菌酶的修飾方法，其特征在于，所述的槐糖脂采用以下方法 制備得到： (1) 將凍干假絲酵母菌C.bombicola ATCC 22214均勻分散至滅菌后的YM培養(yǎng)基中，隨 后畫線接種至YM瓊脂培養(yǎng)基斜面上，25°C恒溫2天，挑取單菌落接種至滅菌后的液體培養(yǎng)基 中，25°C，200rpm培養(yǎng)24h，得到菌懸液； (2) 將步驟（1)得到的菌懸液接種至滅菌后的種子培養(yǎng)基中，于25°C，200rpm培養(yǎng)24h; (3) 將步驟(2)的種子培養(yǎng)基接種至滅菌后的裝配有電子數(shù)控與攪拌裝置的發(fā)酵罐培 養(yǎng)基中，25°C，轉(zhuǎn)速不超過1200rpm，溶氧控制在30%，利用氫氧化鈉溶液調(diào)控體系pH 3.5， 當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入靜止期后，將葡萄糖及菜籽油添加入發(fā)酵罐中，每隔3h監(jiān)測發(fā)酵液中葡萄 糖濃度，濃度低于150mM時補(bǔ)加葡萄糖； (4) 將步驟(3)的發(fā)酵液于SOOOrpm下離心10min，離心后，發(fā)酵液體系呈三相，中間層含 槐糖脂產(chǎn)物，利用等體積乙酸乙酯洗滌，合并有機(jī)相，減壓除溶劑得槐糖脂。
【文檔編號】A23L3/3571GK106011110SQ201610485255
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】石玉剛, 任月萍, 邵詩音, 蔡文強(qiáng), 袁燕微, 汪琦, 朱陳敏
【申請人】浙江工商大學(xué)