一種人凝血酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及血液制品領(lǐng)域，特別是涉及一種人凝血酶的制備方法。本發(fā)明提供一種人凝血酶的制備方法，包括如下步驟：1）將人血漿Cohn級分得到的組分III復(fù)溶、病毒滅活，所得料液通過陰離子交換樹脂純化，獲得凝血酶原復(fù)合物洗脫液；2）在步驟1）所得洗脫液中加入鈣離子，孵育至凝血酶原被有效活化；3）將步驟2）所得料液通過陽離子交換樹脂進(jìn)行分離純化；4）將步驟3）所得料液進(jìn)行納米膜過濾，即得所述人凝血酶成品。本發(fā)明所提供的制備方法利用本工藝市場的凝血酶制品，不僅活力高、得率高，而且長期穩(wěn)定性也好，符合臨床應(yīng)用的安全有效的要求，具有較明顯的經(jīng)濟價值和現(xiàn)實意義。
【專利說明】
-種人凝血酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及血液制品領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種人凝血酶的制備方法，所述制備方法 可W用于從人血漿中大規(guī)模生產(chǎn)人凝血酶。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝血酶屬于絲氨酸蛋白類水解酶，由308個氨基酸殘基組成，分子量36KD，是由輕 鏈和重鏈通過二硫鍵連接而成的雙鏈分子。其中輕鏈有49個氨基酸殘基，對凝血酶的結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定性起到重要作用；重鏈有259個氨基酸殘基，是凝血酶的酶活功能區(qū)。凝血酶的前體是 凝血酶原(FII)，是一種維生素 K依賴蛋白，在肝臟合成，血漿中含量約10-15毫克/分升，分 子量68KD。
[0003] 凝血酶的形成在整個凝血機制中起到中屯、的作用。凝血機制啟動后，產(chǎn)生的微量 凝血酶能夠激活凝血因子ν,νιπ，IX等因子而放大凝血反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生大量的凝血酶。運些 凝血酶會迅速將可溶性的纖維蛋白原裂解成不可溶的纖維蛋白，并通過活化XIII在纖維蛋 白之間進(jìn)行共價交聯(lián)而形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝血酶還能夠與血小板表面的凝血酶受體結(jié) 合而活化血小板，促使血小板的釋放和聚集，并與凝固的纖維蛋白一起，在血管損傷處形成 穩(wěn)定的血栓，從而達(dá)到止血的目的。另一方面，凝血酶能夠激活蛋白C系統(tǒng)，滅活內(nèi)源性凝血 因子化和VII la的活性，終止凝血反應(yīng)，與ΑΤ-ΙΙI系統(tǒng)和組織因子途徑抑制物系統(tǒng)共同阻止 血液凝塊的形成。此外，凝血酶在激活纖溶系統(tǒng)，清除血塊，促進(jìn)傷口愈合也有重要生理功 能。
[0004] 在臨床上，凝血酶可直接作用于凝血反應(yīng)的最后環(huán)節(jié)，將血液中的纖維蛋白原轉(zhuǎn) 變?yōu)槔w維蛋白，促使血小板凝聚，加速血液凝固，達(dá)到迅速止血的目的，是一種公認(rèn)的速效 局部止血首選藥，適用于各種因素引起的出血癥狀，如消化道，氣管，W及各種手術(shù)出血等。 凝血酶還可與纖維蛋白原配合，制成纖維蛋白膠粘合劑，用于外科出血，粘合組織和處置難 度大的創(chuàng)傷。臨床研究發(fā)現(xiàn)，凝血酶可W促進(jìn)上皮細(xì)胞的生成，使創(chuàng)面愈合時間縮短一半。 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育和損傷保護中的研究表明，小劑量凝血酶可產(chǎn)生神經(jīng)保護作用， 而大劑量則具有細(xì)胞毒性作用。隨著對凝血酶制劑臨床研究的不斷深入，凝血酶的市場需 求必將呈現(xiàn)逐漸擴大的趨勢。
[0005] 相對于動物血漿來源的凝血酶，人血漿來源制備的凝血酶不會引起異源性免疫反 應(yīng)，也不存在感染CJDV等病毒的風(fēng)險，無疑具有更加良好的市場前景。
[0006] 制備人凝血酶的原料主要有去冷膠血漿，Cohn組分I上清，Cohn組分III，凝血酶原 復(fù)合物等。US PATENT 5354682報道，W去冷膠血漿為原料，通過DEAE介質(zhì)富集II因子并洗 脫收集。在洗脫液中加入巧離子和兔腦凝血活酶激活凝血酶原，解育約1小時后生成凝血 酶。經(jīng)過SD除病毒步驟，凝血酶經(jīng)過S-S邱harose進(jìn)一步純化，得到高比活的凝血酶制品。US PATENT 5907032同樣報道了一種W去冷膠血漿為原料生成凝血酶的方法。通過DEAE- cellose吸附去冷膠血漿中的凝血因子后，洗脫液中加入約70mM的巧離子，PH控制在6.4- 6.6，在20°C解育18小時即可大量生成凝血酶。作者認(rèn)為DEAE-cel lose洗脫液中含有活化與 非活化的因子IX和X，促凝憐脂W及足夠的因子V和VIII，在巧離子存在的情況下，通過內(nèi)源 凝血途徑大量生成凝血酶。為去除潛在的病毒污染，文中采用SD結(jié)合干熱法兩步措施實現(xiàn) 除病毒效果。US PATENT 5714370也介紹了一種單巧離子激活產(chǎn)生凝血酶的工藝條件，即 2.5mM巧離子，PH7.0，30°C解育80min后，1U的凝血酶原可產(chǎn)生4洲的凝血酶活性。專利特殊 的地方在于，凝血酶原被DEAE富集洗脫后即進(jìn)行凍干，然后進(jìn)行60°C干熱10hrs，80°C干熱 化r，先行干熱除病毒步驟。之后復(fù)溶凍干品，進(jìn)入下一步純化步驟。作者認(rèn)為，因為凝血酶 對高溫的天然敏感性，而凝血酶原卻對溫度有較好的耐受性，因此在凝血酶原階段進(jìn)行干 熱出病毒，能夠大幅提高凝血酶的得率。干熱除病毒階段添加穩(wěn)定劑可W提高凝血酶的得 率，但同時也可能增強病毒抗熱能力，從而削弱干熱除病毒的效果。中國專利CN02117151.3 也介紹了 一種低巧離子激活產(chǎn)生凝血酶的工藝條件，從8公斤Cohn組分III得到70000單位 的凝血酶半成品，得率為每公斤血漿制得約800單位凝血酶。由于該專利采用干熱病毒滅活 法處理凝血酶凍干品，可能對凝血酶的活力造成影響，凝血酶活力的長期穩(wěn)定性也無法得 到保證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于W上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種人凝血酶的制備方 法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種人凝血酶的制備方法，包括如 下步驟：
[0009] 1)將人血漿Cohn級分得到的組分ΙΠ 復(fù)溶、病毒滅活，所得料液通過陰離子交換樹 脂純化，獲得凝血酶原復(fù)合物洗脫液；
[0010] 2)在步驟1)所得洗脫液中加入巧離子，解育至凝血酶原被有效活化；
[0011] 3)將步驟2)所得料液通過陽離子交換樹脂進(jìn)行分離純化；
[0012] 4)將步驟3)所得料液進(jìn)行納米膜過濾，即得所述人凝血酶成品。
[0013] 所述步驟1)中，復(fù)溶所采用的溶劑通常可W是本領(lǐng)域各種適用于對人血漿Cohn級 分得到的組分ΠΙ進(jìn)行純化的溶液，例如可W是包括但不限于巧樣酸鋼水溶液、氯化鋼水溶 液中的一種或多種的組合，再例如，巧樣酸鋼水溶液中巧樣酸鋼的濃度可W為0.01Μ~ 0.02Μ，氯化鋼水溶液中氯化鋼的濃度可W為0.1Μ~0.2Μ，水溶液的pH可W為6.5~7.0。
[0014] 在本發(fā)明一些實施方式中，所述步驟1)中，病毒滅活采用S/的去病毒滅活。
[001日]所述步驟1)中，所述S/D(Solvent/dete巧ent)法病毒滅活通常指有機溶劑/去污 劑混合物(S/D)破壞包膜病毒的脂膜。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的條件對復(fù)溶后的人血 漿Cohn級分得到的組分ΙΠ 進(jìn)行S/的去病毒滅活，例如，S/的去病毒滅活的條件可W是25°C，5 ~6小時，再例如可W是0.3%TNBP+l%Triton-X100，再例如可W是0.3%TNBP+l%吐溫- 80o
[0016]所述步驟1)中，陰離子交換樹脂主要是用于吸附經(jīng)病毒滅活后的料液中的凝血因 子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選用合適種類的陰離子交換樹脂對所述料液進(jìn)行純化，具體可選用 的陰離子交換樹脂可W是例如DEAE Sephadex A50、DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、 Q Se地arose XL、Capto DEAE、Capto Q、段h施mo猿Q、扣ac化妒廊EMD TMAE、Fiacto嘗過愈EMD DEAE等凝膠中的一種或多種的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的條件使用陰離子交換樹 脂對所述料液進(jìn)行純化，w獲得凝血酶原復(fù)合物洗脫液。所述純化通常包括吸附、洗涂、洗 脫等步驟，例如，洗涂時采用的溶液可W是巧樣酸鋼水溶液、氯化鋼水溶液中的一種或多種 的組合，再例如，巧樣酸鋼水溶液中巧樣酸鋼的濃度可W為0.01M~0.02M，氯化鋼水溶液中 氯化鋼的濃度可W為0.1M~0.2M，水溶液的抑可W為6.5~7.0，再例如，洗脫時采用的溶液 可W是巧樣酸鋼水溶液、氯化鋼水溶液中的一種或多種的組合，再例如，巧樣酸鋼水溶液中 巧樣酸鋼的濃度可W為0.01M~0.02M，氯化鋼水溶液中氯化鋼的濃度可W為0.5M~2.0M， 水溶液的pH可W為6.5~7.0。
[0017] 在本發(fā)明一些實施方式中，所述步驟2)中，解育至凝血酶原通常被巧離子有效活 化，在解育過程中，通?？蒞通過檢測凝血酶活性，判斷凝血酶原是否被有效活化，例如，解 育至凝血酶原被有效活化可W通過檢測人凝血酶效價（中國藥典2015版Ξ部)判斷凝血酶 原是否有效活化。更具體的，可W通過凝血酶活性檢測，凝血酶含量趨于穩(wěn)定而不再增加， 即可判斷料液中的凝血酶原已有效活化。在本發(fā)明一些實施方式中，所述步驟2)中，洗脫液 中巧離子的濃度為lOmM~lOOmM。
[0018] 在本發(fā)明一些實施方式中，所述步驟2)中，洗脫液中加入巧離子的具體方法為:洗 脫液中加入可溶性巧鹽。
[0019] 在本發(fā)明一些實施方式中，所述步驟2)中，所述可溶性巧鹽可W為水溶性巧鹽，所 述可溶性巧鹽選自氯化巧等中的一種或多種的組合。
[0020] 所述步驟3)中，陽離子交換樹脂主要是用于吸附料液中的凝血酶。本領(lǐng)域技術(shù)人 員可選用合適種類的陽離子交換樹脂對所述料液進(jìn)行純化，具體可選用的陽離子交換樹脂 可W是例如SP-Sepharose FF,SP-Sephadex 巧0,CM-Sepha;rose FF，抗actogcl'Kl.M) S0：3- (Μ)等中的一種或多種的組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的條件使用陽離子交換樹脂對 所述料液進(jìn)行純化，W獲得較高純度的凝血酶。所述純化通常包括吸附、洗涂、洗脫等步驟， 例如，洗涂時采用的溶液可W是氯化鋼水溶液、Tris-HCL水溶液等，氯化鋼水溶液中氯化鋼 的濃度為0.1~0.2M，Tr i S-HCL水溶液的濃度可W為0.01~0.02M，水溶液的pH可W為6.5~ 7.5,再例如，洗脫時采用的溶液可W是氯化鋼水溶液、Tris-HCL水溶液等，氯化鋼水溶液中 氯化鋼的濃度為0.5~2.0M，Tris-H化水溶液的濃度可W為0.01~0.02M，水溶液的抑可W 為6.5~7.5。
[0021] 在本發(fā)明一些實施方式中，所述步驟3)和/或步驟4)中，還可W根據(jù)需要調(diào)整料液 中凝血酶的濃度，例如，可W在納米膜過濾前調(diào)整料液中凝血酶的濃度，調(diào)整后的凝血酶濃 度可 W 為 lOOIU/ml ~2000IU/ml。
[0022] 在本發(fā)明一些實施方式中，所述步驟4)中，納米膜過濾所使用的納米膜的孔徑為 10nm~50nm〇
[0023] 在本發(fā)明一些實施方式中，還可W將步驟4)所得產(chǎn)物進(jìn)行除菌和/或凍干。
[0024] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的條件對料液進(jìn)行除菌，例如，可選用除菌過濾的方 法，更具體可W使用除菌膜進(jìn)行除菌過濾，所述除菌膜可W是例如〇.22um孔徑濾膜(用于過 濾除菌)等。
[0025] 如上所述，本發(fā)明的人凝血酶的制備方法結(jié)合W往凝血酶制備工藝的經(jīng)驗W及藥 典要求，針對凝血酶產(chǎn)品特點W及工藝特要求，創(chuàng)新性地提供了一種W納米膜進(jìn)行病毒去 除的大規(guī)模工業(yè)化的凝血酶生產(chǎn)方法。所述人凝血酶的制備方法利用本工藝市場的凝血酶 制品，不僅活力高、得率高（制備的凝血酶得率每公斤血漿約5000-10000單位，比活每毫克 蛋白約800-900單位），而且長期穩(wěn)定性也好，符合臨床應(yīng)用的安全有效的要求，具有較明顯 的經(jīng)濟價值和現(xiàn)實意義。
【具體實施方式】
[0026] W下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書 所掲露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可W通過另外不同的具體實 施方式加 W實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可W基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離 本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0027] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案;還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中 另外明確指出，單數(shù)形式"一個"、"一"和"運個"包括復(fù)數(shù)形式。
[0028] 當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端 點W及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可W使用與本 發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實 現(xiàn)本發(fā)明。
[0029] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng) 域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及 相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。運些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor LaboratoiT Press,1989 and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY John Wiley&Sons，New York,1987 and periodic updates;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition'Academic Press，San Diego,1998;METH0DS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，畑romatin。.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY'Vol.119'Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0030] 實施例中所使用的檢測方法如下：
[0031 ] - .凝血酶含量的檢測
[0032] 參看中國藥典2015版二部，"凝血酶凍干粉"所列方法。標(biāo)準(zhǔn)品為凝血酶國家標(biāo)準(zhǔn) 品（GB20021105,5IU/via)，纖維蛋白原為人纖維蛋白原制品，如上海RAAS公司生產(chǎn)的HFNG (201202肥A0)。
[0033] 二.樣品蛋白濃度的檢測
[0034] 利用島津UV-1800,調(diào)整波長至280,可W測定樣品在280nm的紫外吸收值(0D280)。
[0035] 實施例1
[0036] 1. 2.3噸健康人血漿經(jīng)乙醇級分法得到的80公斤組分III，經(jīng)過SD病毒滅活和離 子交換樹脂分離純化得到11.5公斤凝血酶原復(fù)合物溶液(具體方法參見凝血酶原復(fù)合物病 毒滅活的研究[J].中國生物制品學(xué)雜志，1995,8(3): 101-104;人凝血酶原復(fù)合物的病毒滅 活與驗證[J].中國輸血雜志，1998,11(4): 195-197)。經(jīng)過lOmM巧離子激活，檢測凝血酶活 性大于lOOOIU/ml并趨于穩(wěn)定時，停止巧離子解育，進(jìn)行陽離子交換樹脂分離純化凝血酶。 層析介質(zhì)為SP-Sephadex C50，平衡緩沖液為0.1M氯化鋼，0.02M TriS-肥L，pH6.5的溶液， 洗脫緩沖液是0.5M氯化鋼，0.02M化iS-肥L，P冊.5的溶液。洗脫液為15.2公斤凝血酶溶液， 總活力為1.5 X107單位，總蛋白含量為18500毫克?；盍厥彰抗镅獫{為6500單位凝血 酶，比活為每毫克蛋白810單位凝血酶。
[0037] 2.用0.15M氯化鋼，20mM Tris，1 %甘氨酸超濾換液，配制成25公斤凝血酶原液，每 毫升含600單位凝血酶活力。用1平方米的20納米孔徑的納米膜過濾去除病毒，用除菌膜過 濾后分裝成12000瓶凝血酶半成品，每瓶裝量2毫升，含1200單位凝血酶。
[0038] 3.經(jīng)過凍干后，真空上塞密封，凝血酶成品放在2至8度低溫保存。
[0039] 實施例2
[0040] 1. 2.3噸健康人血漿經(jīng)乙醇級分法得到的81公斤組分III，經(jīng)過SD病毒滅活和離 子交換樹脂分離純化得到12公斤凝血酶原復(fù)合物溶液(具體方法參見凝血酶原復(fù)合物病毒 滅活的研究[J].中國生物制品學(xué)雜志，1995,8(3) :101-104;人凝血酶原復(fù)合物的病毒滅活 與驗證[J].中國輸血雜志，1998,11(4) :195-197)。經(jīng)過lOOmM巧離子激活，檢測凝血酶活性 大于lOOOIU/ml并趨于穩(wěn)定時，停止巧離子解育，進(jìn)行陽離子交換樹脂分離純化凝血酶。層 析介質(zhì)為SP-Sepharose FF，平衡緩沖液為0.15M氯化鋼，0.01M Tris-肥L，pH7.0的溶液，洗 脫緩沖液是1.0M氯化鋼，0.01M化iS-HCL，pH7.0的溶液。得到15.4公斤凝血酶洗脫液，總活 力為1.55X107單位，總蛋白含量為19000毫克?；盍厥彰抗镅獫{為6740單位凝血酶，比 活為每毫克蛋白815單位凝血酶。
[0041 ] 2.用0.15M氯化鋼，20mM化is，1 %甘氨酸超濾換液，配制成25.8公斤凝血酶原液， 每毫升含600單位凝血酶活力。用1平方米的20納米孔徑的納米膜過濾去除病毒，用除菌膜 過濾后分裝成12400瓶凝血酶半成品，每瓶裝量2毫升，含1200單位凝血酶。
[0042] 3.經(jīng)過凍干后，真空上塞密封，凝血酶成品放在2至8度低溫保存。
[0043] 實施例3
[0044] 將實施例2制備的凝血酶成品于25°C放置，并分別于0，1，2,3個月取出樣品，用2ml 水復(fù)溶，檢測凝血酶活性，觀察凝血酶的穩(wěn)定性，結(jié)果如下表：
[0045]
[0046] 檢測數(shù)據(jù)表明，經(jīng)過納米膜除病毒得到的凝血酶活力具有良好的長期穩(wěn)定性。
[0047] 綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。
[0〇4引上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟 悉此技術(shù)的人±皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進(jìn)行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所掲示的精神與技術(shù)思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。
【主權(quán)項】
1. 一種人凝血酶的制備方法，包括如下步驟： 1) 將人血漿Cohn級分得到的組分III復(fù)溶、病毒滅活，所得料液通過陰離子交換樹脂純 化，獲得凝血酶原復(fù)合物洗脫液； 2) 在步驟1)所得洗脫液中加入鈣離子，孵育至凝血酶原被有效活化； 3) 將步驟2)所得料液通過陽離子交換樹脂進(jìn)行分離純化； 4) 將步驟3)所得料液進(jìn)行納米膜過濾，即得所述人凝血酶成品。2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1)中，病毒滅活采用S/D法病毒 滅活。3. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1)中，所述陰離子交換樹脂選 自DEAE Sephadex A50、DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、Q Sepharose XL、Capto DEAE、Capto Q、_Eshmuno?_Q、FractogcIS.EMD TMAE、FractogeKiiEMD DEAE中的一種或多種的 組合。4. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中，洗脫液中鈣離子的濃度 為 IOmM ~IOOmM 〇5. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中，洗脫液中加入鈣離子的 具體方法為:洗脫液中加入可溶性鈣鹽。6. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中，所述陽離子交換樹脂選 自 SP-Sepharose FF ,SP-Sephadex C50, CM-Sepharose FF，F(xiàn)radogeKiiEMD SO3-(M)中的一 種或多種的組合。7. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中，在納米膜過濾前調(diào)整料 液中凝血酶的濃度至100 IU/ml~2000 IU/ml。8. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中，納米膜過濾所使用的納 米膜的孔徑為IOnm~50nm〇9. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，還可以將步驟4)所得產(chǎn)物進(jìn)行除菌和/ 或凍干。
【文檔編號】C12N9/74GK106011116SQ201610614283
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月29日
【發(fā)明人】徐俊, 施煒, 夏正祥, 王弘遠(yuǎn), 占德國, 周雪峰, 程露
【申請人】上海萊士血液制品股份有限公司