一種Fe^3＋依賴型食品級(jí)酸性脲酶及其在黃酒中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶及其在黃酒中的應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用來(lái)自于食品級(jí)宿主地衣芽孢桿菌且依賴于Fe3+的酶，F(xiàn)e3+依賴性脲酶相對(duì)于Ni依賴性脲酶所存在的安全隱患來(lái)說(shuō)，是真正意義上的食品級(jí)脲酶。本發(fā)明所獲得的Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶能夠高效的降解黃酒中的尿素和氨基甲酸乙酯(添加酶量為500U/L時(shí)，可消除黃酒中90％的尿素及30％左右的EC)，從而實(shí)現(xiàn)從源頭到終端對(duì)氨基甲酸乙酯的控制，為實(shí)現(xiàn)脲酶工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，具有巨大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。
【專利說(shuō)明】
-種Fe3+依賴型食品級(jí)酸性服酶及其在黃酒中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脈酶及其在黃酒中的應(yīng)用，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 脈酶(化ease，EC3.5.1.5 )，廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌等中，其能專一性的 催化尿素水解產(chǎn)生兩分子氨和一分子碳酸。脈酶是世界上首次成功獲得的結(jié)晶態(tài)的酶，它 于1926年由Summer首次從刀豆中提取出。根據(jù)脈酶作用的最適pH值，可將脈酶分為酸性脈 酶、中性脈酶和堿性脈酶。
[0003] 氨基甲酸乙醋化thyl化rbamate或化ethane，簡(jiǎn)稱EC)，具有遺傳毒性及致癌性， 廣泛存在于多種發(fā)酵食品（如醬油、食醋、泡菜)和酒精飲料(如黃酒、白酒、葡萄酒等）中。研 究證實(shí)發(fā)酵食品（如黃酒、醬油等）中尿素是EC形成的主要前體物質(zhì)，它和乙醇自發(fā)的反應(yīng) 生成EC，從而嚴(yán)重影響人類的健康。酸性脈酶可W高效消除發(fā)酵食品（如酒精類飲料）中的 尿素，從而可W有效的減少了 EC的形成。
[0004] 但是，已報(bào)道的脈酶均為Ni2+依賴性脈酶，Ni2+作為重金屬，對(duì)人類的健康影響也 存在隱患。因此，嚴(yán)格來(lái)講，Ni2+依賴性脈酶均為非食品酶，應(yīng)用于食品中時(shí)存在安全隱患。 而鐵是人體含量的必需微量元素，是血紅蛋白的重要部分，人全身都需要它，運(yùn)種礦物質(zhì)可 W存在于向肌肉供給氧氣的紅細(xì)胞中，還是許多酶和免疫系統(tǒng)化合物的成分。鐵對(duì)人體的 功能表現(xiàn)在許多方面，鐵參與氧的運(yùn)輸和儲(chǔ)存;促進(jìn)發(fā)育;增加對(duì)疾病的抵抗力；調(diào)節(jié)組織 呼吸，防止疲勞;構(gòu)成血紅素，預(yù)防和治療因缺鐵而引起的貧血;使皮膚恢復(fù)良好的血色。鑒 于鐵對(duì)人體有益的功能，可W添加到食品中，因此可W認(rèn)定Fe3+依賴性脈酶為真正的食品 酶。
[0005] 因此，有必要尋找能夠真正用于食品的食品級(jí)化依賴性脈酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明獲得了化依賴型酸性脈酶，且該酶來(lái)源于食品級(jí)的宿 主(地衣芽抱桿菌），是真正的食品酶，因此可W應(yīng)用于發(fā)酵食品中尿素和EC的消除，且不存 在安全隱患。本發(fā)明是繼于2011年在關(guān)鼠螺桿菌中發(fā)現(xiàn)鐵依賴型脈酶后第二個(gè)所發(fā) 現(xiàn)的鐵依賴型脈酶，而前者發(fā)現(xiàn)在的鐵依賴性脈酶受氧的影響，酶氧化后無(wú)活性，而本發(fā)明 所發(fā)現(xiàn)的Fe3+依賴性脈酶不受氧的影響，從而更加的穩(wěn)定，更有利于在發(fā)酵食品中應(yīng)用，且 能夠降解EC，因此更具有應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脈酶能夠高效的降解黃 酒中的尿素及EC(添加酶量為500U/L時(shí)，可消除黃酒中90%及W的尿素及27%左右的EC)。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種食品級(jí)酸性脈酶在發(fā)酵食品中的應(yīng)用，其特征在 于，所述應(yīng)用是采用Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脈酶。
[000引所述Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脈酶原始來(lái)源于食品級(jí)宿主地衣芽飽桿菌，于重組大 腸桿菌化.coli化21DE3/PRS抑uet-ure化）中表達(dá)，重組菌構(gòu)建過(guò)程已于之前所申請(qǐng)的專 利 CN201510218597.1 中陳述。
[0009] 所述酸性脈酶含有W下特征之一：
[0010] (1)結(jié)構(gòu)亞基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.2、沈Q ID N0.3、 沈Q ID NO.4所示；
[0011] (2)結(jié)構(gòu)亞基的氨基酸序列是在（1)中氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添 加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸得到的，且編碼具有氨基甲酸乙醋水解酶及脈酶活性的由（1)衍生的 蛋白質(zhì)；
[0012] (3)具有SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是用于降低或消除發(fā)酵食品中的尿素和/ 或氨基甲酸乙醋。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵食品包括酒精類飲料、醬油。
[0015] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵食品為黃酒、白酒、葡萄酒等。
[0016] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脈酶來(lái)源于Bacillus licheniformis 9945A。
[0017] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述Fe3+依賴性食品級(jí)酸性脈酶是W大腸桿菌、枯草 芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌或者乳酸菌為生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)得到的。
[0018] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述生產(chǎn)菌株在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中添加化3+。
[0019] 本發(fā)明還提供一種發(fā)酵生產(chǎn)酸性脈酶的方法，其特征在于，所述方法，是在生產(chǎn)菌 株發(fā)酵生產(chǎn)的過(guò)程中添加 Fe3+;所述酸性脈酶為含有W下特征之一 ：（1)結(jié)構(gòu)亞基化eA、 化68、化6(：的氨基酸序列分別如沈9 10^.2、569 10顯.3、沈9 10^.4所示；（2)結(jié)構(gòu)亞 基的氨基酸序列是在（1)中氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基 酸得到的，且編碼具有氨基甲酸乙醋水解酶及脈酶活性的由（1)衍生的蛋白質(zhì)；（3)具有SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列。
[0020] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述生產(chǎn)菌株為食品級(jí)生產(chǎn)菌株。
[0021] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述生產(chǎn)菌株為枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌或者 乳酸菌。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：
[0023] 本發(fā)明通過(guò)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)向培養(yǎng)基中分別添加 NiS〇4及FeCl3,測(cè)定所表達(dá)的 酶活力，確認(rèn)所獲得的酸性脈酶為Fe3+依賴型脈酶，是一個(gè)真正意義上的食品酶。本發(fā)明的 Fe3+依賴型脈酶應(yīng)用于發(fā)酵食品中尿素和EC的消除時(shí)，無(wú)因 Ni依賴性脈酶而帶來(lái)的安全隱 患。本發(fā)明的Fe3+依賴性脈酶可W高效的消除黃酒中的尿素和EC(添加酶量為500U/L時(shí)，可 消除黃酒中90%的尿素及27%左右的EC)，從而實(shí)現(xiàn)從源頭到終端對(duì)氨基甲酸乙醋的控制， 具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1:培養(yǎng)基中添加金屬離子(NiCb及化Cl3)時(shí)，脈酶及EC酶活力；
[0025] 圖2:地衣芽抱桿菌Fe3+依賴性雙功能酸性脈酶純化過(guò)程SDS-PAGE電泳圖；其中M: 標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，1:粗酶液，2:硫酸氨沉淀，3: DEAE離子交換層析，4: Phenyl疏水作用層析， 5: MonoQ離子交換層析，6:凝膠過(guò)濾層析。
【具體實(shí)施方式】 [00%] 材料與方法：
[0027]地衣芽抱桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基：lg/L yeast extract，2g/L(NH4)2S〇4,5g/L EC，0.1% 的礦物鹽混合物，0.24%肥陽(yáng)S，pH 6.0
[002引氯化錠標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用超線水配制0 . Immol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、 0.4mmol/L、0.5mmol/L的NH4+標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管準(zhǔn)確移取ImL NH4+標(biāo)準(zhǔn)梯度液分別置于 序編號(hào)的lOmL比色管中。37 °C下恒溫保溫30min，立即用吸ImL終止劑于比色管中，振蕩混 勻。再依次加入ImL顯色劑I和顯色劑II，強(qiáng)烈振蕩，使之充分混勻，反應(yīng)20min。超純水定容 至lOmL，在625nm下比色測(cè)定0D值，W0D值為縱坐標(biāo)，饑產(chǎn)梯度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0029] 脈酶及氨基甲酸乙醋水解酶酶活測(cè)定方法:取兩支lOmL比色管，分別加入ImL酶液 和ImL滅活的酶液。然后在兩管中分別加入ImL 3%尿素（用20mM pH 4.5的巧樣酸緩沖液配 制），在37°C恒溫水浴箱中反應(yīng)30min后，在兩管各加入ImL終止劑（10%Ξ氯乙酸），混勻后 加入ImL的顯色劑I (15g苯酪和0.625g亞硝基鐵氯化鋼用超純水定容至250mL)和ImL顯色劑 II(13.125g化0H和7.5mLNaC10用超純水定容至250mL)，強(qiáng)烈震蕩，繼續(xù)在37°C恒溫水浴箱 中保溫20min后取出，用超純水稀釋到10血，625nm處比色，測(cè)定0D值，計(jì)算酶活(采用氯化錠 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）。
[0030] 脈酶及氨基甲酸乙醋水解酶酶活單位定義:在常壓，20mM pH4.5巧樣酸-巧樣酸鋼 緩沖液及37°C條件下，每分鐘降解尿素生成2μπιο1 NH4+所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。 [0031 ]氨基甲酸乙醋水解酶酶活單位定義:在常壓，20mM ρΗ4.5巧樣酸-巧樣酸鋼緩沖液 及37°C條件下，每分鐘降解尿素生成?μL?ο? ΝΗ4+所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。
[0032] 實(shí)施例1:化依賴型食品級(jí)酸性脈酶的鑒定
[0033] 挑取-80°C保藏的重組大腸桿菌化21(DE3)/pRS抑uet-ure化菌株在LB固體培養(yǎng)基 (含有5化g/血卡那霉素）上劃線，于37°C培養(yǎng)12h后，取單菌落接種于接種于25mL、含有50μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。第二天按1%接種量轉(zhuǎn)接至含有50μ g/mL卡那霉素的ΤΒ培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌濃OD6〇o = 0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1mmol/L誘導(dǎo)， 同時(shí)分別添加終濃度為2mM的NiCl2及FeCl3，W不添加金屬離子來(lái)作為對(duì)照。30°C培養(yǎng)lOh， 離屯、收集菌體，用20mM pH4.5巧樣酸-巧樣酸緩沖液重懸細(xì)胞，通過(guò)超聲破壁、離屯、取上清， 測(cè)定脈酶及氨基甲酸乙醋水解酶活力。由圖1可得，無(wú) Μ或Fe添加時(shí)，基本上表達(dá)的酶無(wú)活 力，當(dāng)培養(yǎng)基中添加 NiS〇4及FeCl3時(shí)酶活力得到極大的提高，且加 Fe時(shí)脈酶活力是加 Μ時(shí)脈 酶活力的1.7倍，因此該酶認(rèn)定為化依賴性脈酶。
[0034] 實(shí)施例2:地衣芽抱桿菌化依賴型食品級(jí)酸性脈酶的純化
[0035] (1)地衣芽抱桿菌粗酶液的制備
[0036] 挑取-80°C保藏的菌株Bacillus licheniformis 9945Α在營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上 劃線，于3(TC培養(yǎng)20h后，取單菌落接種于新鮮的地衣芽抱桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中在3(TC轉(zhuǎn)速為 20化· min-i的搖床上繼續(xù)培養(yǎng)20h。將菌液4°C1000化pm離屯、5min，棄上清，沖洗菌體并重懸 于50mM pH4.5的巧樣酸緩沖液中，菌體終濃度為0.1 g/ml。將菌體置于冰水浴中進(jìn)行超聲破 碎，超聲破碎的條件為：功率70W，工作2s間隔4s，重復(fù)工作30min，至菌體溶液變清澈為止。 將破碎液于4°C1200化pm離屯、lOmin，轉(zhuǎn)移上清液于干凈的離屯、管中低溫保存。
[0037] 此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果再發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2mM FeCb能夠顯著提高粗酶液中脈 酶的酶活。
[0038] (2)硫酸錠分級(jí)沉淀
[0039] 將固體硫酸錠研磨至細(xì)粉狀，在7(TC烘箱中烘干至恒重。將固體硫酸錠緩慢加入 到粗酶液中，并不斷攬拌至飽和度為40%，4°C靜置4h，10000rpm離屯、20min棄沉淀取上清， 并向上清中繼續(xù)加入固體硫酸錠至飽和度為80%，如上述條件進(jìn)行沉淀離屯、棄上清取沉 淀。然后將蛋白沉淀溶解于適量20mmol -[袖7.0的憐酸鹽緩沖溶液中，用透析袋在相同 的緩沖溶液中對(duì)蛋白樣品透析脫鹽。
[0040] (3)離子交換層析
[0041 ]起始緩沖液A:20mmol · L-ipH 7.0的憐酸鹽緩沖溶液。洗脫緩沖液B:含Imol · L- iNaCl的20mmol .L-1抑7.0的憐酸鹽緩沖溶液。采用化Trap DEAE化5血陰離子交換柱，先 用起始緩沖液平衡柱子，流速為5mL · mirTi，上樣后用洗脫緩沖液梯度洗脫蛋白，采用梯度 20% ,40% ,60% ,80%，100 % B液。合并活性管并透析除鹽。
[0042] (4)疏水層析
[0043] 起始緩沖液C:20mmol · L-ipH 7.0的憐酸鹽緩沖溶液。洗脫緩沖液D:含Imol · L-1 (NH4)2S化的20mmol · [ipH 7.0的憐酸鹽緩沖溶液。向蛋白樣品中緩慢加入固體硫酸錠至終 濃度為Imol -[1，經(jīng)0.22μπι濾膜過(guò)濾，上樣于提前經(jīng)的夜平衡的陸en^ HP 5血疏水柱，采用 梯度洗脫100%0,80%0,60%0,40%0,20%0，流速為51^*111111-1。分別測(cè)定收集各管酶活 性，合并活性管并透析除鹽。
[0044] (5)離子交換層析
[0045] 起始緩沖液E:20mmol · L-ipH 7.0的憐酸鹽緩沖溶液。洗脫緩沖液F:含Imol · L- iNaCl的20mmol?L-ipH 7.0的憐酸鹽緩沖溶液。經(jīng)上步純化的蛋白上樣于Mono Q 5/50化離 子柱，采用線性洗脫方式，流速為ImL · mirfi。測(cè)定各管收集液酶活，合并有活性各管。
[0046] (6)凝膠過(guò)濾層析
[0047] S叩erdex-200 prep grade凝膠柱，進(jìn)樣量為0.5mL，柱體積120mL，緩沖液為 20mmol · L-ipH 7.0的憐酸鹽緩沖溶液，流速ImL · min-i。收集出峰處，測(cè)定不同出峰處酶 活，合并有酶活各管，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0048] 純化相關(guān)數(shù)據(jù)如表1所示（WEC酶酶活為測(cè)定依據(jù)），SDS-PAGE如圖2所示。
[0049] 表1:地衣芽抱桿菌化依賴性雙功能酸性脈酶純化過(guò)程相關(guān)參數(shù)
[(Κ)加 ]
[0051] 實(shí)施例3:地衣芽抱桿菌化3+依賴型食品級(jí)酸性脈酶應(yīng)用于黃酒中EC及尿素的降解
[0052] 向煎酒前黃酒酒樣中分別添加500U/L終濃度的酶量，于37°C水浴反應(yīng)，通過(guò)HPLC 檢測(cè)尿素降解量，通過(guò)GC-MS測(cè)定EC解降解量。結(jié)果如表2所示，由表2可W看出，本發(fā)明的脈 酶可有效降解黃酒中的尿素和EC(添加酶量為500U/L時(shí)，可消除黃酒中90%的尿素及27% 左右的EC)。
[0053] 表2:化依賴性雙功能酸性脈酶應(yīng)用于降解黃酒中EC和尿素的結(jié)果 [0化4]
[0055]雖然本發(fā)明已W較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用W限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該W權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種食品級(jí)酸性脲酶在發(fā)酵食品中的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是采用Fe3+依賴型 食品級(jí)酸性脲酶;所述酸性脲酶含有以下特征之一： (1) 結(jié)構(gòu)亞基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID NO. 4所示； (2) 結(jié)構(gòu)亞基的氨基酸序列是在（1)中氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一 個(gè)或幾個(gè)氨基酸得到的，且編碼具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由（1)衍生的蛋白 質(zhì)； (3) 具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶是Fe3+依賴 型脲酶，F(xiàn)e 3+存在時(shí)表達(dá)的酶具有尿素和氨基甲酸乙酯降解酶活力。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用，是用于降低或消除發(fā)酵食品中 的尿素和/或氨基甲酸乙酯。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵食品包括酒精類飲料、醬油。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵食品為黃酒。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶來(lái)源于 Bacillus licheniformis 9945A〇7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生產(chǎn)菌株在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中添加 Fe3+。8. -種發(fā)酵生產(chǎn)酸性脲酶的方法，其特征在于，所述酸性脲酶為含有以下特征之一： (1) 結(jié)構(gòu)亞基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID NO. 4所示； (2) 結(jié)構(gòu)亞基的氨基酸序列是在（1)中氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一 個(gè)或幾個(gè)氨基酸得到的，且編碼具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由（1)衍生的蛋白 質(zhì)； (3) 具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列； 所述方法，是在生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)的過(guò)程中添加 Fe3+。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述生產(chǎn)菌株為食品級(jí)生產(chǎn)菌株。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述生產(chǎn)菌株為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢 桿菌或者乳酸菌。
【文檔編號(hào)】A23L27/50GK106011118SQ201610397813
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】康振, 陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 劉慶濤
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)