一種小的dna分子量標(biāo)準(zhǔn)物、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種小的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒及其制備方法，本發(fā)明是利用重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、限制性內(nèi)切酶酶切和DNA連接等方法將100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp和700bp等長(zhǎng)度的小的DNA序列構(gòu)建到一個(gè)質(zhì)粒上。這種質(zhì)粒經(jīng)單一的限制性酶完全酶切后，可以酶切出七條亮度均一的條帶。本發(fā)明用于制備DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物，用于在瓊脂糖電泳中指示DNA分子量的相對(duì)大小。
【專利說明】
-種小的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域中的一種不可或缺的電泳耗材，具體設(shè)及 一種小的脫氧核糖核酸(DNA)分子量標(biāo)準(zhǔn)物、小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒W及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物是一種用于指示DNA在瓊脂糖電泳中泳動(dòng)速度相對(duì)大小的試劑， 是由已知的特定大小的多個(gè)DNA片段混合而成的。目前主要的制備方法有PCR擴(kuò)增方法，質(zhì) 粒酶切方法或者兩者相結(jié)合的方法。PCR方法是設(shè)計(jì)引物，用體外PCR擴(kuò)增的方法獲得特定 大小的DNA片段，然后通過純化和定量，再按照一定的質(zhì)量比混合在一起制備而成。酶切方 法是將不同大小的片段克隆在一個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒中，提取質(zhì)粒并用限制性酶完全酶切后將運(yùn) 些片段混合在一起。王芳等（王芳等.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物的制備《安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)》，2009， 第15期（15) :6903-6903)用PCR方法制備的多個(gè)片段混合在一起制備成的分子量標(biāo)準(zhǔn)。PCR 方法過程比較麻煩，包括模板制備，引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化、PCR產(chǎn)物定量和PCR產(chǎn) 物混合。片段越多，整個(gè)過程就越復(fù)雜。另一個(gè)方面，由于多數(shù)用于DNA擴(kuò)增的聚合酶具有核 酸外切酶活性，很容易導(dǎo)致擴(kuò)增片段的降解，PCR擴(kuò)增的特異性和擴(kuò)增緩沖液成分、擴(kuò)增的 模板量和引物的使用量等密切相關(guān)。一旦一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，PCR產(chǎn)物的非特性擴(kuò)增，運(yùn)種 非特異性擴(kuò)增得到的條帶對(duì)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)會(huì)產(chǎn)生干擾作用，導(dǎo)致DNA分子量大小的誤判。
[0003] 酶切方法制備DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物是目前DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物生產(chǎn)的發(fā)展趨勢(shì)。DNA在 隧菌體，大腸桿菌等微生物中的體內(nèi)復(fù)制，然后提取DNA，用特定的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。 設(shè)及的制備步驟只有提取和酶切兩步，相對(duì)于PCR制備方法簡(jiǎn)單宜行。早期的酶切分子量標(biāo) 準(zhǔn)物制備是通過用一個(gè)或兩個(gè)限制性內(nèi)切酶對(duì)已知序列的DNA進(jìn)行酶切獲得多條不同長(zhǎng)度 的DNA片段的混合物，如例如Lamda/HindllI分子量標(biāo)準(zhǔn)物。通過提取Lamda隧菌體的DNA，用 Hindlll 限制性內(nèi)切酶將DNA切成 12 化P，564bp，2027bp，232 化P，436 化P，6557bp，9416bp 和 23130bp等八個(gè)不同長(zhǎng)度的的片段。該類分子量標(biāo)準(zhǔn)物的缺點(diǎn)之一是小片段和大片段的分 子量的差異較大導(dǎo)致酶切片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后DNA條帶亮度不均勻。缺點(diǎn)之二是 片段長(zhǎng)度不是整倍數(shù)，不便于記憶。
[0004] 韋柳靜等（韋柳靜等.一種新型可用于DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒構(gòu)建《生物技術(shù)》， 2004,05期（5): 33-35)制備的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物中含有2000bp，1500bp，lOOObp，750bp， 500bp和250bp等六個(gè)片段，在片段長(zhǎng)度上實(shí)現(xiàn)了整倍數(shù)，但是每個(gè)片段只有一個(gè)拷貝， 2000bp和250bp片段長(zhǎng)度相差八倍，亮度相差八倍，在凝膠電泳上指示效果不均一，而且運(yùn) 個(gè)分子量標(biāo)準(zhǔn)物中沒有l(wèi)OObp片段。同樣，王文華等（王文華等.一種簡(jiǎn)便的DNA定量分子量 標(biāo)準(zhǔn)的制備《生物技術(shù)》，2010,第3期（3):62-64)通過定點(diǎn)突變制備的含有由10化9,20化口， 400bp，800bp和1200bp等5個(gè)片段的分子量標(biāo)準(zhǔn)物也存在片段在凝膠中亮度不均一的現(xiàn)象。 運(yùn)個(gè)分子量標(biāo)準(zhǔn)物中1200bp片段的分子量為lOObp片段的12倍，當(dāng)lOObp片段為long時(shí)， 1200bp片段為12化g，電泳后觀察到l(K)bp片段亮度過弱，而1200bp片段亮度過強(qiáng)。James等 (James.et al. genetic reagents for generating plasmids containing multiple copies of DM segments.US Patent 4,403,036)發(fā)明的一個(gè) 123bp小分子的DM標(biāo)準(zhǔn)通過 不完全酶切獲得，組成的DNA條帶是123bp長(zhǎng)度的整倍數(shù)，但是該分子量標(biāo)準(zhǔn)物保留了 2800bp長(zhǎng)度大小的載體DNA，電泳效果中感覺2800bp條帶非常強(qiáng)，與最小的123bp條帶亮度 反差特別大。運(yùn)個(gè)分子量標(biāo)準(zhǔn)物是通過不完全酶切的方法制備的。不完全酶切的時(shí)間不易 控制，一旦酶切時(shí)間夠長(zhǎng)，那么會(huì)缺少多個(gè)條帶，不同批次的質(zhì)粒用不同批次的酶酶切的時(shí) 間是限制生產(chǎn)量和提高質(zhì)量的關(guān)鍵。小分子的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒更不容易構(gòu)建。
[0005] 總之，越來越多的生物技術(shù)和基因工程實(shí)驗(yàn)及研究中需要使用PCR技術(shù)。PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物通常是通過瓊脂糖凝膠電泳或聚丙締酷胺凝膠電泳來檢測(cè)的，為了判定擴(kuò)增產(chǎn)物的大 小，通常為使用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物作為電泳的參照物。不同的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物廣泛地應(yīng)用 于凝膠電泳中。
[0006] 目前小分子DNA標(biāo)準(zhǔn)物通常為PCR產(chǎn)物混合物，穩(wěn)定性不好，目前的小分子DNA標(biāo)準(zhǔn) 存在的問題。PCR方法過程比較麻煩，包括模板制備，引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化、PCR 產(chǎn)物定量和PCR產(chǎn)物混合。片段越多，整個(gè)過程就越復(fù)雜。而且保存過程中容易降解。其它的 酶切分子量標(biāo)準(zhǔn)物，由于克隆的片段較為單一，每種片段均為一個(gè)拷貝，電泳后，條帶的亮 度有弱有強(qiáng)，亮度不均一。運(yùn)些分子量標(biāo)準(zhǔn)物在生產(chǎn)制備和使用過程中都會(huì)產(chǎn)生很多的問 題。
[0007] 然而，鑒定性質(zhì)的PCR擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度通常在100-600bp之間，需求量大。但由 于DNA片段太小，市場(chǎng)上商品化的小于7(K)bp大小的質(zhì)粒酶切小分子DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)很少見， 未見將所有的7個(gè)片段構(gòu)建在單一質(zhì)粒上的分子量標(biāo)準(zhǔn)物。運(yùn)種質(zhì)粒的構(gòu)建方法在國(guó)際國(guó) 內(nèi)的專業(yè)雜志及專利中未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種小的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒及其制備方法，其克 服了【背景技術(shù)】中提到的現(xiàn)有技術(shù)中的不足。本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物，所述小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物為若 干長(zhǎng)短不同的小的脫氧核糖核酸序列，其均為不大于lOOObp的片段，且所述小的脫氧核糖 核酸序列均構(gòu)建于同一個(gè)載體上。一般而言，所述序列或片段至少為7個(gè)片段，所述片段均 為l(K)bp片段的整數(shù)倍。
[0010] 進(jìn)一步地，所述小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物為小的脫氧核糖核酸序列，所述 小的脫氧核糖核酸序列包括10化P、20化P、30化P、40化P、50化P、60化P和70化P的片段，所述 小的脫氧核糖核酸序列均構(gòu)建于同一個(gè)載體上。更進(jìn)一步地，所述小的脫氧核糖核酸序列 包括十個(gè) lOObp、^個(gè) 200bp、兩個(gè) 300bp、兩個(gè)400bp、一個(gè) 500bp、一個(gè) eOObpW 及一個(gè)700bp 的片段。
[0011] 進(jìn)一步地，所述小的脫氧核糖核酸序列還可包括8(K)bp或/和9(K)bp等長(zhǎng)度的片段。
[0012] 進(jìn)一步地，所述小的脫氧核糖核酸序列（即小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物)是通 過重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、限制性內(nèi)切酶酶切法和脫氧核糖核酸連接法構(gòu)建至一個(gè)所述載體 上。該載體優(yōu)選質(zhì)粒，更優(yōu)選為質(zhì)粒PUC19。
[0013] -種小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒，該質(zhì)粒為首尾連接的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，所述 質(zhì)粒包括質(zhì)粒骨架和小的脫氧核糖核酸序列，在所述小的脫氧核糖核酸序列內(nèi)部設(shè)有酶切 位點(diǎn)；所述小的脫氧核糖核酸序列包括10化9、20化9、30化9、40化9、50化9、60化9和70化口的 片段;所述酶切位點(diǎn)包括EcoRI、BamH I、化nd虹、SalIW及Xbal。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述小的脫 氧核糖核酸序列包括十個(gè)10化P、Ξ個(gè)20化P、兩個(gè)30化P、兩個(gè)40化P、一個(gè)50化P、一個(gè)60化P W及一個(gè)70化P的片段，所述小的脫氧核糖核酸序列是通過重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、限制性內(nèi) 切酶酶切法和脫氧核糖核酸連接法構(gòu)建至一個(gè)質(zhì)粒骨架上；
[0014] 進(jìn)一步地，上述酶切位點(diǎn)還包括趾0 及Bgl II，所述趾0巧日Sail為同尾酶， Bglll和BamHI為同尾酶。所述小的脫氧核糖核酸序列還能夠包括700bpW上的片段，優(yōu)選 800bp或同時(shí)包括8(K)bp和9(K)bp，運(yùn)些片段能夠通過同尾酶進(jìn)行添加，當(dāng)然還能夠不斷添加 其他片段。
[0015] 進(jìn)一步地，所述小的脫氧核糖核酸序列W及酶切位點(diǎn)的連接順序依次為:BamHI- EcoRI-200bp-EcoRI-400bp-EcoRI-BamHI-XbaI-BglII-EcoRI-300bp-EcoRI-300bp-EcoRI- Xbal-Hind虹-XhoI-EcoRI-200bp-EcoRI-200bp-EcoRI-Hind虹-500bp-EcoRI-600bp- EcoRI-400bp-EcoRI-700bp-SalI-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp- EcoRI-lOObp-EcoRI-lOObp-EcoRI-lOObp-EcoRI-lOObp-EcoRI-lOObp-EcoRI-lOObp-Sall, 成為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即為小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒能夠進(jìn)行完全酶 切。
[0016] -種小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物的制備方法，所述方法包括分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 粒的構(gòu)建、Μ化質(zhì)粒DNA純化W及Ml E質(zhì)粒DNA酶切。所述分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下：
[0017] S1:M1A的構(gòu)建:A.設(shè)計(jì)PCR引物，WpUC19為模板，在高保真酶P化DNA聚合酶作用 下，分別擴(kuò)增出50化P、60化P、40化P和70化P的DNA條帶;B.然后加入兩端引物，通過重疊 PCR 的方法將擴(kuò)增出的40化P、70化P、60化P和50化P四個(gè)片段拼接在一起，成為DNA長(zhǎng)片段;C.并 在DNA長(zhǎng)片段兩端引入BamHI酶切位點(diǎn);D. W質(zhì)粒為骨架，采用BamHI酶切后將DNA長(zhǎng)片段連 接在骨架質(zhì)粒上，得到的質(zhì)粒為M1A;則M1A含有1個(gè)4(K)bp片段，1個(gè)500bp片段，1個(gè)6(K)bp片 段和1個(gè)7(K)bp片段。
[0018] S2:M1B質(zhì)粒的構(gòu)建:A. W克隆有小鼠 IGF2BP2基因組DNA的一個(gè)細(xì)菌人工染色體 DNA為模板，該模板的DNA序列中只有一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)，且所述EcoRI酶切位點(diǎn)的兩側(cè) lOOObp長(zhǎng)度內(nèi)無 BamHI、化ndll I、Sal I和Xbal等酶切位點(diǎn);B.設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增一 400bp長(zhǎng)度的DNA片段，所述引物的5'端帶有Hindlll和EcoRI酶切位點(diǎn)，Hindlll在EcoRI酶 切位點(diǎn)的外側(cè);所述40化P長(zhǎng)度的DNA片段經(jīng)EcoRI單酶切后獲得兩個(gè)大小一致但序列完全 不同的200bp的片段；C.擴(kuò)增后獲得的400bp長(zhǎng)度的DNA片段用Hindlll單酶切，同時(shí)用 Hindlll單酶切M1A質(zhì)粒，片段和載體連接后獲得一個(gè)插入了2個(gè)200bp片段的質(zhì)粒M1B;則 M1B含有2個(gè)20化P片段，1個(gè)40化P片段，1個(gè)50化P片段，1個(gè)60化P片段和1個(gè)70化P片段。 [0019] S3:M1C質(zhì)粒的構(gòu)建:A.同樣W克隆有小鼠 IGF2BP2基因組DNA的一個(gè)細(xì)菌人工染色 體DNA為擴(kuò)增區(qū)域，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，該引物的5 '端包含BamHI和EcoRI位點(diǎn)，BamHI在EcoRI酶 切位點(diǎn)的外側(cè);B.根據(jù)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后獲得長(zhǎng)度為60化P的PCR產(chǎn)物，該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng) EcoRI單酶切后獲得一個(gè)20化P長(zhǎng)度的片段和一個(gè)400bp長(zhǎng)度的片段;C.獲得的PCR產(chǎn)物用 BamHI單酶切，同時(shí)用BamHI單酶切M1B質(zhì)粒，片段和載體連接，獲得一個(gè)插入了 1個(gè)200bp片 段和一個(gè)4(K)bp片段的質(zhì)粒，即為M1C，該M1C含有3個(gè)20化P片段，2個(gè)4(K)bp片段，1個(gè)5(K)bp片 段，1個(gè)6(K)bp片段和1個(gè)7(K)bp片段。
[0020] S4:M1D質(zhì)粒的構(gòu)建:A.同樣W克隆有小鼠 IGF2BP2基因組DNA的一個(gè)細(xì)菌人工染色 體DNA為擴(kuò)增區(qū)域，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，該引物的5 '端包含有Xba巧蛇coRI位點(diǎn)，Xbal在EcoRI酶 切位點(diǎn)的外側(cè)，根據(jù)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增;B.擴(kuò)增后獲得長(zhǎng)度為600bp左右的PCR產(chǎn)物，但是經(jīng) EcoRI單酶切后獲得兩個(gè)大小一致但序列完全不同的300bp的片段；C.獲得的PCR產(chǎn)物用 Xbal單酶切，同時(shí)用Xbal單酶切M1C質(zhì)粒，片段和載體連接，獲得一個(gè)插入了 2個(gè)30化P片段， 即為M1D，則M1D含有3個(gè)200bp片段，2個(gè)30 Obp片段，2個(gè)400bp片段，1個(gè)500bp片段，1個(gè) 600bp片段和1個(gè)7(K)bp片段。
[0021] S5:M化質(zhì)粒的構(gòu)建，包括步驟A~D，如下：
[0022] A. pUClSAva 質(zhì)粒構(gòu)建:①合序列 ESASHF 和 ESASHR，
[0023] ESASHF為5-AATTCGTCGACCTCGGGGTCGACA-3，
[0024] ESASHR為5-TCGAACAGCTGGGGCTCCAGCTGC-3;
[0025] 合成后進(jìn)行退火，退火后獲得兩端帶EcoRI(GAATTC)和化ndlll(AAGCTT)粘末端的 片段，同時(shí)引進(jìn)了一個(gè)Ava KCTCGGG)酶切位點(diǎn)W及在其兩側(cè)各有一個(gè)Sall(GTCGAC)酶切 位點(diǎn);②用EcoR巧日化nd III雙酶切PUC18質(zhì)粒，獲得線性化的帶有EcoR巧日化nd III粘末 端的載體;③將步驟①中退火后的片段與步驟②中線性化的載體連接，得到pUClSAva質(zhì)粒， 備用；
[00%] B.AvaElOO片段的獲得:①合成引物，并在上游引物中引入Aval和EcoRI酶切位點(diǎn)， 下游引物中只引入Aval酶切位點(diǎn)，然后再WPfu聚合酶基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR產(chǎn) 物，即為AvaElOO片段，其為有l(wèi)OObp長(zhǎng)度的DNA片段；
[0027] C.克隆10個(gè)AvaElOO重復(fù)序列的質(zhì)粒的獲得:①單個(gè)AvaElOO用Aval單酶切，電泳， 回收特異性的lOObp長(zhǎng)度的片段;②建立連接體系，將片段進(jìn)行連接，回收lOOObp長(zhǎng)度大小 的片段，即為Αν址100重復(fù)片段;③測(cè)序準(zhǔn)確的pUClSAva質(zhì)粒用Aval充分酶切，然后進(jìn)行去 憐酸化，獲得Aval線性化的，去憐酸化的pUClSAva質(zhì)粒;④將步驟②中回收的長(zhǎng)度為lOOObp 的AvaElOO重復(fù)片段和步驟③中Aval線性化的、去憐酸化的pUClSAva質(zhì)粒進(jìn)行連接;獲得插 入10個(gè)AvaElOO的克隆在pUClSAva質(zhì)粒上的質(zhì)粒，AvaElOO片段頭尾相連；
[002引 D.Μ化質(zhì)粒構(gòu)建：利用pUClSAva中的Sail酶切位點(diǎn)將Αν址100重復(fù)片段克隆到有 Sail酶切位點(diǎn)的M1D質(zhì)粒中，獲得一個(gè)插入了 10個(gè)lOObp片段，即為Μ1Ε，所述ME含有10個(gè) lOObp片段，3個(gè)20化P片段，2個(gè)30化P片段，2個(gè)40化P片段，1個(gè)50化P片段，1個(gè)60化P片段和1 個(gè)7(K)bp片段。
[0029] 所述mE質(zhì)粒能夠進(jìn)行完全酶切獲得小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物。
[0030] 進(jìn)一步地，步驟S1中：所述M1A質(zhì)粒中包含大腸桿菌DNA復(fù)制起始子和氨節(jié)青霉素 抗性基因；在所述M1A質(zhì)粒中的DNA長(zhǎng)片段連接內(nèi)部引入3個(gè)EcoRI的限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)， 可W將質(zhì)粒最終切成40化P，70化P，60化P和50化P的DNA條帶;在質(zhì)粒BamHI酶切位點(diǎn)兩側(cè)引 入XbaI、HindIII和Salll酶切位點(diǎn)（一側(cè)引入Salll酶切位點(diǎn)，另一側(cè)引入Xba巧陽(yáng)indin酶 切位點(diǎn)插入其它長(zhǎng)度的片段。
[00川進(jìn)一步地，步驟S1中，所述PCR引物為四對(duì)引物，分別為7F1和7R巧I物對(duì)，7F2和7R3 引物，7F3和7R4引物對(duì)，7F4和7R5引物對(duì)，該引物序列如下所示;根據(jù)四對(duì)引物獲得預(yù)期長(zhǎng) 度的4個(gè)特異性擴(kuò)增的DNA片段后（分別為50化p、600bp、400bp和700bp)，切膠回收純化定 量，加入回收的4個(gè)DM片斷，然后加入兩端7F1和7貼引物對(duì)作為兩端引物，通過重疊 PCR方 法將運(yùn)4個(gè)片段拼接在一起。PCR產(chǎn)物用BamHI酶切，在T4DNA連接酶的作用下連接，連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定獲得符合預(yù)期要求的質(zhì)粒。
[0032] 7F1 5-GTCGGATCCTCTAGAAGCTTCCCTTTCGCCAGCTGGCG-3
[00；33] 7F2 5-GATAAATGCTTCAAGAATTCTGAAAAAGGAAG-3
[0034] 7R2 5-CTTCCTTTTTCAGAATTCTTGAAGCATTTATC-3
[0035] 7F3 5-CTATTAACTGGCGAATTCCTTACTCTAGCTTC-3
[00；36] 7R3 5-GAAGCTAGAGTAAGGAATTCGCCAGTTMTAG-3
[0037] 7F4 5-CCCTTAACGTGAGAATTCGTTCCACTGAGC-3
[0038] 7R4 5-GCTCAGTGGAACGAATTCTCACGTTAAGGG-3
[OOW] 7R5 5-GTCGGATCCCGAGTCGACAGAACATGTGAGCAAAAGG-3
[0040]進(jìn)一步地，步驟S2所設(shè)計(jì)的引物序列如下，在該引物的上游引物中引入了一個(gè)化0 I(CTCGAG)酶切位點(diǎn)，用于后續(xù)片段的克隆。
[0041 ] H200EU:5-GTCAAGCTTCTCGAGAATTCTCGATATGGTTATTAATACATA-3
[0042] 肥00?。?-GTCAAGCTTGAATTCCTGCCTTCTTTGCCAATCA-3
[0043] 進(jìn)一步地，步驟S3中所述的引物序列為：
[0044] B200抓：5-GTCGGATCCGAATTCTCGATATGGTTA-3
[0045] B400邸：5-TCGGGATCCGAATTCGAGCTCCGGCGG-3
[0046] 進(jìn)一步地，步驟S4的引物序列如下，在該引物的上游引物中引入一個(gè)Bgl II (AGATCT)酶切位點(diǎn)，用于后續(xù)片段的克隆。
[0047] X300EU:GATCTCTAGATCTGAATTCGATGAAGATATGCG
[0048] X300ED:GATCTCTAGAGAATTCACACCAGCACCGCTCTC
[0049] 進(jìn)一步地，步驟Step2、Step3和Step4中所選的擴(kuò)增區(qū)域或擴(kuò)增模板中的EcoRI酶 切位點(diǎn)的兩側(cè)lOOObp長(zhǎng)度內(nèi)無 BamHI、化ndIII、SalI和甜al等酶切位點(diǎn)。
[0化0] 進(jìn)一步地，步驟S5的B中所述引物的序列如下：
[0化 1 ] AE100U：5-TGAACTCGGGAAAGAATTCCTTC-3
[0052] AE100D:5-AGTACCCGAGACTCTACAAGGTTCCCTGTG-3
[0化3] 根據(jù)該引物得到所述PCR產(chǎn)物即為AvaE100，AvaE100序列如下：
[0054] CTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTT TCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGG
[0055] 本發(fā)明提供了一種小的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒及其制備方法，其主要具有 的有益效果如下：
[0056] ①本發(fā)明的分子量標(biāo)準(zhǔn)物均為小的脫氧核糖核酸片段，重點(diǎn)構(gòu)建不大于lOOObp的 小的片段，滿足市場(chǎng)對(duì)于小的DNA片段的大量需求;且所有DNA片段為l(K)bp的整倍數(shù)，DNA條 帶明確易記。
[0057] ②本發(fā)明組成標(biāo)準(zhǔn)物的DNA片段分子量比較小，且實(shí)現(xiàn)了將十個(gè)lOObp片段，Ξ個(gè) 200bp片段，兩個(gè)30化P片段，兩個(gè)40化P片段，一個(gè)50化P，一個(gè)60化P和一個(gè)70化P等屯個(gè)小 分子DNA片段構(gòu)建到同一個(gè)質(zhì)粒中，滿足市場(chǎng)對(duì)于100-600bp之間DNA片段的極大需求。此 夕h同尾酶的引入可W在運(yùn)個(gè)分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒中不斷插入不同長(zhǎng)度的DNA片段，例如，能 夠插入8(K)bp、90化p等等，使得本發(fā)明能夠獲得其它片段類型的分子量標(biāo)準(zhǔn)物，質(zhì)粒具有可 持續(xù)性增加其它片段的特點(diǎn)。
[0058] ③所有的DNA片段都構(gòu)建在一個(gè)質(zhì)粒上，同類分子量標(biāo)準(zhǔn)物都只是PCR產(chǎn)物的混合 物
[0059] ④本發(fā)明的分子量標(biāo)準(zhǔn)物可W進(jìn)行完全酶切后獲得的屯個(gè)片段之間的亮度差異 在兩倍W內(nèi)，在瓊脂糖凝膠電泳中顯示的DNA條帶亮度均勻，條帶銳利。
[0060] ⑤本發(fā)明的方法容易實(shí)現(xiàn)，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒易于構(gòu)建，且穩(wěn)定性好，不容易 降解，通過本方法構(gòu)建完成便可進(jìn)行反復(fù)的拷貝，易于大規(guī)模標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，滿足市場(chǎng)對(duì)于小 的DNA片段的需求。
[0061] ⑥本發(fā)明的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物通過重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、限制性內(nèi)切酶酶切法和 脫氧核糖核酸連接法構(gòu)建至同一個(gè)載體上，方法簡(jiǎn)單，且克服了其他方法的不足。
[0062] ⑦本發(fā)明的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒能夠進(jìn)行酶切完全，酶切時(shí)間易于控制，且結(jié)果 可按預(yù)期得到不同的DNA片段，使用非常方便，使用過程中同樣具有極好的穩(wěn)定性，不容易 降解。
[0063] ⑧本發(fā)明的分子量標(biāo)準(zhǔn)物的特點(diǎn)使得其可極好的應(yīng)用于瓊脂糖凝膠電泳或聚丙 締酷胺凝膠電泳中，作為DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物指示DNA分子量的相對(duì)大小。
[0064] 綜上，本發(fā)明的產(chǎn)品和方法具有極其重要的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0065] 下面根據(jù)附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0066] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例所述的分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖；
[0067] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例所述的Markerl瓊脂糖電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0068] 本發(fā)明設(shè)及到的概念的解釋如下，需要說明的是，提供W下定義是為了更好的界 定本發(fā)明或指導(dǎo)本發(fā)明的一般技術(shù)人員，除非另外說明，否則術(shù)語(yǔ)應(yīng)該按照相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域 的一般技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解。還要說明的是，W下術(shù)語(yǔ)僅用來更好的理解本發(fā)明而 不用于限定本發(fā)明。
[0069] 1.脫氧核糖核酸:脫氧核糖核酸(Deo巧ribonucleic acid,縮寫為DNA)又稱去氧 核糖核酸，由脫氧核糖核巧酸組成。每一種脫氧核糖核巧酸由Ξ個(gè)部分所組成:一分子含氮 堿基，一分子五碳糖（脫氧核糖），一分子憐酸根。核酸的含氮堿基又可分為四類：腺嚷嶺 (adenine,縮寫為A)，胸腺喀晚(thy分鐘e，縮寫為T)，胞喀晚(c^osine，縮寫為C)和鳥嚷嶺 (guanine,縮寫為G)dDNA的四種含氮堿基組成具有物種特異性。即四種含氮堿基的比例在 同物種不同個(gè)體間是一致的，但在不同物種間則有差異。DNA的四種含氮堿基比例具有規(guī)律 性，每一種生物體DNA中A = T，C = G，即堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。DNA是由許多脫氧核巧酸按一定 堿基順序彼此用3 '，5 '憐酸二醋鍵相連構(gòu)成的長(zhǎng)鏈。大多數(shù)DNA為雙鏈，也有的DNA為單鏈， 如大腸桿菌隧菌體ΦΧ174、Μ13等。DNA有環(huán)形DNA和線狀DNA之分。質(zhì)粒DNA環(huán)形DNA。人基因組 DNA為線狀DNA。
[0070] 2.限制性內(nèi)切酶:限制性核酸內(nèi)切酶是可W識(shí)別特定的核巧酸序列，并在每條鏈 中特定部位的兩個(gè)核巧酸之間的憐酸二醋鍵進(jìn)行切割的一類酶蛋白，簡(jiǎn)稱限制酶。根據(jù)限 制酶的結(jié)構(gòu)，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為Ξ種類型，分別是第一型 (Type I)、第二型(Type II)及第Ξ型(Type 111)。1型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲 基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Π 型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。 III型限制性內(nèi)切酶同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用。本篇中敘述的內(nèi)切酶主要為Π 型限 制性內(nèi)切酶。Π 類酶有EcoR I、BamH I、化ndn、Hind虹等。其分子量小于105道爾頓;反應(yīng)需 要Mgh;最重要的是在所識(shí)別的特定堿基順序上有特異性的切點(diǎn)，因而DNA分子經(jīng)過Π 類酶 作用后，可產(chǎn)生特異性的酶解片斷，運(yùn)些片斷可用凝膠電泳法進(jìn)行分離、鑒別。限制性內(nèi)切 酶識(shí)別DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位點(diǎn)在回文的一偵U(如EcoR I、BamH I、Hind 等），因而可形成粘性末端，例如W下酶的酶切位點(diǎn)所示：
[0071] EcoR I的切割位點(diǎn)如下：
[0072] 5'-G'AATTC-3'
[0073] 3'-CTTAA乂-5'
[0074] BamH I的切割位點(diǎn)如下：
[00巧]5'-G~GATCC-3'
[0076] 3'-CCTAG乂-5'
[0077] Bgl II的切割位點(diǎn)如下：
[007引 5'-A~GATCT-3'
[0079] 3'-TCTAG~A-5'
[0080] Sal I的切割位點(diǎn)如下：
[0081 ] 5'-G'TCGAC-3'
[0082] 3'-CAGCrG-5'
[0083] Xho I的切割位點(diǎn)如下：
[0084] 5'-rCTAGA-3'
[0085] 3，-AGATCT-G-5，
[0086] 另一些Π 類酶如Alu I、EcoR V、Sma I等，切割位點(diǎn)在回文序列中間，形成平整末 端，如下所示：
[0087] Alu I的切割位點(diǎn)如下：
[008引 5'-A G~C T-3'
[0089] 3'-Τ (TG A-5'
[0090] Smal的切割位點(diǎn)如下：
[0091] 5'-CCC~GGG-3'
[0092] 3'-GGG~CCC-5'
[0093] 也有的酶識(shí)別不同的序列，切割后產(chǎn)生相同的粘末端。如BamHI運(yùn)一類的限制酶來 源各異，識(shí)別的祀序列也不相同，但產(chǎn)生相同的粘性末端。由同尾酶（isocaudomer)產(chǎn)生的 DNA片段，是能夠通過其粘性末端之間的互補(bǔ)作用彼此連接起來的。當(dāng)把同尾酶切割的DNA 片斷與原來的限制性內(nèi)切酶切割的DNA片段連接后，原來的酶切位點(diǎn)將不存在，不能被原來 的限制性內(nèi)切酶所識(shí)別。如：
[0094] BamH I的切割位點(diǎn)如下：
[00巧]5'-G~GATCC-3'
[0096] 3'-CCTAG乂-5'
[0097] Bgl II的切割位點(diǎn)如下：
[009引 5'-A~GATCT-3'
[0099] 3'-TCTAG~A-5'
[0100] 兩種酶識(shí)別不同的序列，但是酶切后產(chǎn)生了相同的粘末端。在T4DNA連接酶的作用 下，可W連接在一起。連接后，酶切位點(diǎn)消失，兩種酶都不能識(shí)別。
[0101] 3、質(zhì)粒
[0102] 質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌W及酵母菌等生物中，是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小 的環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒上具抗生素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。質(zhì)粒的大小用堿基對(duì) 表示。質(zhì)粒DNA分子上有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)。不同的限制性內(nèi)切酶可W識(shí)別特異性 的DNA序列。質(zhì)粒用單一內(nèi)切酶酶切可W切出一條
[0103] 4、堿基對(duì)
[0104] 形成DNA編碼遺傳信息的化學(xué)結(jié)構(gòu)。組成堿基對(duì)的堿基包括A-腺嚷嶺、G-鳥嚷 嶺、T-胸腺喀晚、C-胞喀晚。堿基對(duì)是一對(duì)相互匹配的堿基（即A-T，G-C相互作用）被氨 鍵連接起來。通常被用來衡量DNA長(zhǎng)度。堿基對(duì)簡(jiǎn)稱bp (Base化ir，bp)對(duì)于雙鏈核酸?；?千堿基。
[0105] 5、瓊脂糖凝膠電泳
[0106] 瓊脂糖一種線性多糖聚合物，系從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來的。當(dāng)瓊脂糖溶 液加熱到沸點(diǎn)后冷卻凝固便會(huì)形成良好的電泳介質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在pH值 大于8.0的電泳緩沖液中，帶負(fù)電荷的DNA在電場(chǎng)作用下向陽(yáng)極遷移，其遷移速率由下列多 種因素決定：
[0107] (1)瓊脂糖濃度:一個(gè)給定大小的線狀DNA分子，其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖 凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于 DNA分子的大小。分離小于0.化b的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5 %，分離大于10化的DNA分 子所需膠濃度為0.3-0.7%，DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
[0108] (2)DNA的分子大小:線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA 分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越 慢。
[0109] (3)DNA分子的構(gòu)象:DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí)，它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量 有關(guān)，還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速 度是不一樣的，超螺旋DNA移動(dòng)最快，而開環(huán)雙鏈DNA移動(dòng)最慢。
[0110] (4)電源電壓:在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著 電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將W不同的幅度增長(zhǎng)，片段越大，因場(chǎng)強(qiáng) 升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要 使大于沈b的DNA片段有效分離所加電壓不得超過5V/cm。
[0111] (5)嵌入染料的存在:巧光染料漠化乙晚用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DM,染料會(huì)嵌 入到堆積的堿基對(duì)之間會(huì)使線狀DNA遷移率降低。
[0112] 6、細(xì)菌轉(zhuǎn)化
[0113] 指某一受體細(xì)菌通過直接吸收來自另一供體細(xì)菌的含有特定基因的脫氧核糖核 酸(DNA)片段，從而獲得了供體細(xì)菌的相應(yīng)遺傳性狀，運(yùn)種現(xiàn)象稱為細(xì)菌轉(zhuǎn)化。自然界的轉(zhuǎn) 化現(xiàn)象，一般發(fā)生在同一物種或近緣物種中。細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法已被引入其他生物，例如采用原 生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，可將外源DNA注入到不具攝取DNA能力的生物中，使其獲得某些新的特性。質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化是通過制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，使得質(zhì)粒在大 腸桿菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行大量擴(kuò)增。
[0114] 下面W具體實(shí)驗(yàn)案例為例來說明【具體實(shí)施方式】，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí) 施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[011引實(shí)施例1
[0116] -種小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物，所述小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物為小 的脫氧核糖核酸序列，所述小的脫氧核糖核酸序列為1個(gè)或2個(gè)或3個(gè)或4個(gè)或5個(gè)或6個(gè)或7 個(gè)或8個(gè)或9個(gè)或10個(gè)lOObp的片段、1個(gè)或2個(gè)或3個(gè)20化P的片段、1個(gè)或2個(gè)30化P的片段、1 個(gè)或2個(gè)4(K)bp的片段、1個(gè)5(K)bp的片段、1個(gè)6(K)bp的片段W及1個(gè)7(K)bp的片段，W上所有小 的片段或小的脫氧核糖核酸序列均構(gòu)建于同一個(gè)載體上。
[0117] 實(shí)施例2
[0118] -種小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物，所述小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物為小 的脫氧核糖核酸序列，所述小的脫氧核糖核酸序列為1個(gè)或2個(gè)或3個(gè)或4個(gè)或5個(gè)或6個(gè)或7 個(gè)或8個(gè)或9個(gè)或10個(gè)lOObp的片段、1個(gè)或2個(gè)或3個(gè)20化P的片段、1個(gè)或2個(gè)30化P的片段、1 個(gè)或2個(gè)4(K)bp的片段、1個(gè)5(K)bp的片段、1個(gè)6(K)bp的片段、1個(gè)7(K)bp的片段W及1個(gè)8(K)bp的 片段，W上所有小的片段或小的脫氧核糖核酸序列均構(gòu)建于同一個(gè)載體上。
[0119] 實(shí)施例3
[0120] -種小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物，所述小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物為小 的脫氧核糖核酸序列，所述小的脫氧核糖核酸序列為1個(gè)或2個(gè)或3個(gè)或4個(gè)或5個(gè)或6個(gè)或7 個(gè)或8個(gè)或9個(gè)或10個(gè)lOObp的片段、1個(gè)或2個(gè)或3個(gè)20化P的片段、1個(gè)或2個(gè)30化P的片段、1 個(gè)或2個(gè)4(K)bp的片段、1個(gè)500bp的片段、1個(gè)6(K)bp的片段、1個(gè)700bp的片段、1個(gè)8(K)bp的片 段W及1個(gè)9(K)bp的片段，W上所有小的片段或小的脫氧核糖核酸序列均構(gòu)建于同一個(gè)載體 上。
[0121 ]進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式，實(shí)施例1~3所述載體為質(zhì)粒，更優(yōu)選為質(zhì)粒PUC19。
[0122] 實(shí)施例4
[0123] -種載有小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)粒，該質(zhì)粒為首尾連接的環(huán)狀結(jié) 構(gòu)，所述質(zhì)粒包括質(zhì)粒骨架和小的脫氧核糖核酸序列，在所述小的脫氧核糖核酸序列內(nèi)部 設(shè)有酶切位點(diǎn)。所述小的脫氧核糖核酸序列包括W下片段:① l(K)bp的片段的數(shù)量為1個(gè)或2 個(gè)或3個(gè)或4個(gè)或5個(gè)或6個(gè)或7個(gè)或8個(gè)或9個(gè)或10個(gè);②200bp的片段的數(shù)量為1個(gè)或2個(gè)或3 個(gè);③300bp的片段的數(shù)量為1個(gè)或2個(gè);④400bp的片段的數(shù)量為1個(gè)或2個(gè);⑤50化p、600bp 和70化P的片段數(shù)量均為1個(gè);⑥800bp的片段為0個(gè)或1個(gè)。所述酶切位點(diǎn)包括EcoRI、BamH I、Hind 虹、SallW 及甜 al。
[0124] 實(shí)施例5
[0125] -種載有小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)粒，該質(zhì)粒為首尾連接的環(huán)狀結(jié) 構(gòu)，所述質(zhì)粒包括質(zhì)粒骨架和小的脫氧核糖核酸序列，在所述小的脫氧核糖核酸序列內(nèi)部 設(shè)有酶切位點(diǎn)；所述酶切位點(diǎn)包括EcoRI、BamH I、化nd虹、SalI、XbaI、化ο IW及Bgl II;所 述小的脫氧核糖核酸序列包括W下片段:①10化P的片段的數(shù)量為1個(gè)或2個(gè)或3個(gè)或4個(gè)或5 個(gè)或6個(gè)或7個(gè)或8個(gè)或9個(gè)或10個(gè);②2(K)bp的片段的數(shù)量為1個(gè)或2個(gè)或3個(gè);③30化P的片段 的數(shù)量為1個(gè)或2個(gè);④4(K)bp的片段的數(shù)量為1個(gè)或2個(gè);⑤5(K)bp、60化P和7(K)bp的片段數(shù)量 均為1個(gè)。
[0126] 所述小的脫氧核糖核酸序列W及酶切位點(diǎn)的連接順序依次為：BamHI-EcoRI- 200bp-EcoRI-400bp-EcoRI-BamHI-XbaI-BglII-EcoRI-300bp-EcoRI-300bp-EcoRI-XbaI- Hind虹-XhoI-EcoRI-200bp-EcoRI-200bp-EcoRI-Hind虹-500bp-EcoRI-600bp-EcoRI- 400bp-EcoRI-700bp-SalI-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI- lOObp-EcoRI-lOObp-EcoRI-lOObp-EcoRI-lOObp-EcoRI-lOObp-EcoRI-lOObp-Sall，，該序 列首位的BamHI和末端的Sail連接，成為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具體見圖1中制備好的分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 粒。
[0127] 進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式，實(shí)施例5~6所述的載有小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物 的質(zhì)粒（即小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒)能夠進(jìn)行完全酶切，很容易便能得到預(yù)期 的不同類型的小的DNA片段。
[012引實(shí)施例6
[0129] 實(shí)施例1~6中的小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物（即所述小的脫氧核糖核酸序 列）是通過重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、限制性內(nèi)切酶酶切法和脫氧核糖核酸連接法構(gòu)建至一個(gè) 載體上的。
[0130] 實(shí)施例7
[0131] 分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒的構(gòu)建，參見圖1，圖1給出了分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒的構(gòu)建流程W 及不同DNA片段構(gòu)建次序、添加位點(diǎn)和排列順序；圖1中酶切位點(diǎn)的簡(jiǎn)寫如下:E:EcoR I，H: Hind ΙΙΙ,Χ:甜a I，B:BamH I，S:Sal 1，化：化〇 I，Bg:Bgl II。
[0132] 1、骨架質(zhì)粒MIA的構(gòu)建
[013：3] W質(zhì)粒PUC19為骨架，設(shè)計(jì)四對(duì)PCR引物(如下所示其序列），然后WlOng的pUC19為 模板，在高保真酶PfU DNA聚合酶作用下，采用7F1和7R巧I物對(duì)、7F2和7R3引物對(duì)、7F3和7R4 引物對(duì)、7F4和7R5引物對(duì)分別擴(kuò)增4個(gè)PCR產(chǎn)物，即500bp、600bp、400bp和700bp的DNA條帶， 擴(kuò)增條件94 °C預(yù)變性2分鐘，然后擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，94 °C變性30秒，55 °C退火30秒，72 °C變性30 秒72°C后延伸10分鐘。
[0134] 然后加入兩端7F1和7R5引物對(duì)，通過重疊 PCR方法將上述4個(gè)片段（即500bp、 600bp、400bp和700bp的DNA條帶)拼接在一起，得到一個(gè)2227bp長(zhǎng)度的DNA片段，在該DNA片 段的兩端設(shè)計(jì)了BamHI酶切位點(diǎn)，并用BamHI酶切該DNA片段，使其插入至質(zhì)粒PUC19中，即為 M1A質(zhì)粒，其序列如下所示;具體地，在T4DNA連接酶的作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 T0P10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)鑒定獲得符合預(yù)期要求的質(zhì)粒。
[0135] 所述M1A質(zhì)粒滿足條件為：（1)質(zhì)粒中包含大腸桿菌DNA復(fù)制起始子和氨節(jié)青霉素 抗性基因：（2)在插入的運(yùn)個(gè)DNA片段的內(nèi)部引入3個(gè)EcoRI的限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)，通過特 異性的酶切，可W將質(zhì)粒最終切成40化P，70化P，60化P和50化P的DNA條帶；（1)中引入的3個(gè) EcoRI酶切位點(diǎn)不影響質(zhì)粒的自我復(fù)制和氨節(jié)抗性基因的表達(dá)。（3)在M1A質(zhì)粒的BamHI酶切 位點(diǎn)左右引入乂6曰1、化11(1111、5曰111等3個(gè)酶切位點(diǎn)^插入其它長(zhǎng)度的片段，優(yōu)選地，5曰111 酶切位點(diǎn)位于BamHI酶切位點(diǎn)的左側(cè)，Xbal和化ndn I酶切位點(diǎn)位于BamHI酶切位點(diǎn)的右側(cè)， 此處左右W附圖所示的方向?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)。
[0136] 上述的四對(duì)PCR引物序列如下：
[0137] 7F1 5-GTCGGATCCTCTAGAAGCTTCCCTTTCGCCAGCTGGCG-3
[0138] 7F2 5-GATAAATGCTTCAAGAATTCTGAAAAAGGAAG-3
[0139] 7R2 5-CTTCCTTTTTCAGAATTCTTGAAGCATTTATC-3
[0140] 7F3 5-CTATTAACTGGCGAATTCCTTACTCTAGCTTC-3
[0141] 7R3 5-GAAGCTAGAGTAAGGAATTCGCCAGTTAATAG-3
[0142] 7F4 5-CCCTTAACGTGAGAATTCGTTCCACTGAGC-3
[0143] 7R4 5-GCTCAGTGGAACGAATTCTCACGTTAAGGG-3
[0144] 7R5 5-GTCGGATCCCGAGTCGACAGAACATGTGAGCAAAAGG-3
[0145] M1A質(zhì)粒的序列見下：
ATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGC CTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTGTCG AC
[0147] 2、M1B質(zhì)粒構(gòu)建流程
[0148] W克隆有小鼠 IGF2BP2基因組DM的一個(gè)細(xì)菌人工染色體DM為模板，設(shè)計(jì)引物 H200抓和肥00抓，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物為40化P長(zhǎng)度的DNA片段，但是經(jīng)EcoRI 單酶切后獲得兩個(gè)大小一致但序列完全不同的200bp的片段。引物的5'端帶有Hindlll (AAGCTT)和EcoRI(GAATTC)酶切位點(diǎn)，Hindlll在EcoRI酶切位點(diǎn)的外側(cè)。
[0149] 在該引物的上游引物中可優(yōu)選引入一個(gè)化oI(CTCGAG)酶切位點(diǎn)，用于后續(xù)片段的 克?。ó?dāng)然，也可不引入）。
[0150] 選擇上述克隆有小鼠 IGF2BP2基因組DNA的一個(gè)細(xì)菌人工染色體DNA為PCR擴(kuò)增區(qū) 域必須符合兩個(gè)條件，其一選定的DNA序列中只有一個(gè)EcoRI酶切位點(diǎn)；其二在運(yùn)個(gè)EcoRI酶 切位點(diǎn)的兩側(cè)lOOObp長(zhǎng)度內(nèi)無 BamHI、化ndllI、SalI和Xbal等酶切位點(diǎn)，運(yùn)樣是擴(kuò)增出來的 特定片段一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI酶切后就可W獲得兩片段，增加了克隆效率，并且保證 其它的酶切位點(diǎn)可W使用。
[0151] 采用上述引物擴(kuò)增后獲得4(K)bp長(zhǎng)度的DNA片段用化ndin單酶切，同時(shí)用化ndlll 單酶切ΜΙΑ質(zhì)粒，片段和載體連接獲得了一個(gè)插入了 2個(gè)2(K)bp片段的質(zhì)粒，命名為M1B，運(yùn)個(gè) 質(zhì)粒的特點(diǎn)是含有2個(gè)2(K)bp片段，1個(gè)40化P片段，1個(gè)5(K)bp片段，1個(gè)6(K)bp片段和1個(gè)7(K)bp 片段。
[0152]引物序列為：
[015引 肥00EU:5-GTCAAGCTTCTCGAGAATTCTCGATATGGTTATTAATACATA-3
[0154] H200ED：5-GTCAAGCTTGAATTCCTGCCTTCTTTGCCAATCA-3
[0155] 擴(kuò)增后得到的含有40化P長(zhǎng)度的DNA片段的序列為：
[0156] AAGCTTCTCGAGAATTCTCGATATGGTTATTAATACATATGTAATATTTATCAAGATTTTTTTTTTGAT TATATACCCAGAAATTGGGATTGCTGGATTATATGGGATTGTTTTTTCATTTCCTCCGGCCAGGCCTGACAGGTGGA CCCACTTAGCCACCAGAGAGTAGGAAATAGAAGTGGAGTTATCACTGTGTGGCTCCTTTTAGTCAGAATTCATAAGC TGAGGTTGGAAAAGAACTTGAAAAAAAATTGGGTTTCCATTCATAAAGAGTGAGCTTCGTGAGTCTTGGGCGCTAAG TCGGCAGCCGTCCTACTGCTTGCCCCTCTGTCTTTTCAGGGCTGAGGAGGTTCCTCTGAAAATCCTGGCCCACAATG GCTTCGTTGGAAGACTGATTGGCAAAGAAGGCAGGAATTCAAGCTT
[0157] 3、M1C質(zhì)粒構(gòu)建流程
[0158] 同樣用該段區(qū)段（即克隆有小鼠 IGF2BP2基因組DNA的一個(gè)細(xì)菌人工染色體DNA)為 擴(kuò)增區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物B200抓和B400抓，如下所示，該引物包含有BamHI (GGATCC)和EcoRI (GAATTC)位點(diǎn)的，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物的5'端帶有BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)。BamHI在 EcoRI酶切位點(diǎn)的外側(cè)。擴(kuò)增后獲得長(zhǎng)度為6(K)bp的PCR產(chǎn)物(如下所示），該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI 單酶切后可獲得一個(gè)20化P長(zhǎng)度的片段和一個(gè)40化P長(zhǎng)度的片段。
[0159] 獲得的PCR產(chǎn)物用BamHI單酶切，同時(shí)用BamHI單酶切M1B質(zhì)粒，片段和載體連接，獲 得一個(gè)插入了 1個(gè)2(K)bp片段和一個(gè)4(K)bp片段的質(zhì)粒，命名為M1C質(zhì)粒，該M1C質(zhì)粒的特點(diǎn)是 含有3個(gè)20化P片段，2個(gè)40化P片段，1個(gè)50化P片段，1個(gè)60化P片段和1個(gè)70化P片段。
[0160] W上所述的引物序列為：
[0161] B200抓：5-GTCGGATCCGAATTCTCGATATGGTTA-3
[0162] B400邸：5-TCGGGATCCGAATTCGAGCTCCGGCGG-3
[0163] 擴(kuò)增后得到的含有60化P長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物序列：
[01化]4、M1D質(zhì)粒構(gòu)建流程
[0166] 同樣用該段區(qū)段即克隆有小鼠 IGF2BP2基因組DNA的一個(gè)細(xì)菌人工染色體DNA)為 擴(kuò)增區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物X300抓和X300抓，包含有XbaI(5'T~CTAGA 3'）和EcoRI酶切位點(diǎn)， 甜a I在EcoRI酶切位點(diǎn)的外側(cè)。
[0167] 在該引物的上游引物中可優(yōu)選引入一個(gè)Bgl IKAGATCT)酶切位點(diǎn)，用于后續(xù)片段 的克?。ó?dāng)然，也可不引入）。
[0168] 根據(jù)所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后獲得長(zhǎng)度為600bp左右的PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物經(jīng) EcoRI單酶切后獲得兩個(gè)大小一致但序列完全不同的300bp的片段。獲得的PCR產(chǎn)物用Xbal 單酶切，同時(shí)用Xbal單酶切MIC質(zhì)粒，片段和載體連接，獲得一個(gè)插入了 2個(gè)30化P片段，命名 為M1D質(zhì)粒，運(yùn)個(gè)M1D質(zhì)粒的特點(diǎn)是含有3個(gè)200bp片段，2個(gè)300bp片段，2個(gè)400bp片段，1個(gè) 500bp片段，1個(gè)6(K)bp片段和1個(gè)7(K)bp片段。
[0169] W上所述的引物序列如下：
[0170] X300EU:GATCTCTAGATCTGAATTCGATGAAGATATGCG
[0171] X300ED:GATCTCTAGAGAATTCACACCAGCACCGCTCTC
[0172] 擴(kuò)增后得到的含有60化P長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物序列如下：
[0174] 5、M化質(zhì)粒構(gòu)建流程
[0175] 由于lOObp片段比較小，則如果多個(gè)拷貝的lOObp酶切后疊加在一起便能夠使得 lOObp的條帶明顯。所W優(yōu)選將將多個(gè)l(K)bp長(zhǎng)度的片段連接到一起。
[0176] (l)pUC18Ava 質(zhì)粒構(gòu)建
[0177] ①合成下面兩個(gè)序列：
[0178] ESASHF:5-AATTCGTCGACCTCGGGGTCGACA-3
[0179] ESASHR:5-TCGAACAGCTGGGGCTCCAGCTGC-3
[0180] 然后再退火，退火體系如下： 10、anncaling bulTcr 10 μL^ Forward oligo (100 μΜ slock) 10 |_iL
[0181 ] Reverse oligo (100 μΜ stock) 10 μL. dclH.O 70 '1止 Total volume 10(仙
[0182] 混合后，離屯、，放在PCR儀上退火，設(shè)計(jì)循環(huán)為:94 °C變性10分鐘，70°C退火15分鐘。 然后放在室溫10分鐘，置于冰上5分鐘。退火產(chǎn)物補(bǔ)加2(K)yLTE緩沖液，200化酪/氯仿混合 物，混勻，12000rpm離屯、5分鐘，乙醇沉淀DNA。然后用分光光度計(jì)定量退火的DNA片段。獲得 退火成功的ESA甜片段，該片段序列為：
[0183] 5-AATTCGTCGACCTCGGGGTCGACA-3
[0184] 3-GCAGCTGGAGCCCCAGCTGTTCGA-5
[01化]退火后獲得兩端帶EcoRI(GAATTC)和化ndlll(AAGCTT)粘末端的片段(哪兒有運(yùn)兩 個(gè)粘性末端），同時(shí)引進(jìn)了一個(gè)Ava I(CTCGGG)酶切位點(diǎn)（哪兒有）W及在其兩側(cè)各有一個(gè) Sall(GTCGAC)酶切位點(diǎn)。
[01化]②用EcoR I和化nd III雙酶切PUC18質(zhì)粒，獲得線性化的帶有EcoR I和化nd III 粘末端的載體。
[0187]③建立連接體系，將步驟①中退火后的ESA細(xì)片段與步驟②中線性化的帶有EcoR I和化nd III粘末端的載體PUC18質(zhì)粒。連接體系為： !〇x Ligasc bidTcr 1 ,ΟμΙ pUdS/EcoRI+Hindlll 2.0.nL (50ng) ESASH Ji 2.0.UL ( lOOng)
[0W8] T4 DNA Ligai、（<υζμΙ4 1 .Oul ddHiO 4μΙ Total volume lOyL
[0189] 混合后，離屯、，放在PCR儀中，25°C連接60分鐘。常規(guī)方法轉(zhuǎn)化TOPIO大腸桿菌感受 態(tài)細(xì)胞。次日挑取克隆，搖菌，提取質(zhì)粒，用M13F(-47)測(cè)序引物確認(rèn)目的載體構(gòu)建成功，貝1J 得到pUClSAva質(zhì)粒，備用。
[0190] (2)AvaE100 片段的獲得
[0191] 合成W下引物：
[0192] AE100U 5-TGAACTCGGGAAAGAATTCCTTC-3
[0193] AE100D 5-AGTACCCGAGACTCTACAAGGTTCCCTGTG-3
[0194] 在上游引物中同時(shí)引入Aval和EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物中只引入Aval酶切位點(diǎn)； 然后WPfu聚合酶基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物，即為AvaElOO。兩個(gè)Aval (CTCGGG)酶切位點(diǎn)之間的序列如下，序列的5'端包含一個(gè)EcoRI(GAATTC)。
[01巧]AvaElOO序列如下：
[0196] CTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTT TCAAGGTCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGG
[0197] (3)克隆10個(gè)AvaElOO重復(fù)序列的質(zhì)粒
[0198] ①單個(gè)所述Αν址100經(jīng)酪氯仿抽提，乙醇沉淀后用Aval單酶切，充分酶切后，進(jìn)行 2%的瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收特異性的l(K)bp長(zhǎng)度的片段。然后 用分光光度計(jì)定量DNA片段，進(jìn)行片段連接。
[0199] ②建立連接體系，如下所示： l〇x Ligasc buiTcr 4μ1. AvaE 10O/AvaI( 1 ug/ul) 20ul
[0200] T4 DNA Liga說（5U/yL) 2ul ddH2〇 14μΙ. Total volume 40μL_.
[0201] 該體系在37°C下連接60分鐘，然后將連接產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳用瓊脂 糖凝膠DNA回收試劑盒回收lOOObp長(zhǎng)度大小的片段，此為AvaElOO重復(fù)序列/片段
[0202] ③測(cè)序準(zhǔn)確的pUClSAva質(zhì)粒用Aval充分酶切，然后用郵堿性憐酸酶(SAP)對(duì)充分 酶切好的pUClSAva質(zhì)粒進(jìn)行去憐酸化處理，最終獲得Aval線性化的，去憐酸化的pUClSAva 質(zhì)粒。
[0203] ④在T4DNA連接酶的作用下，將步驟②中回收的長(zhǎng)度為lOOObp的AvaElOO重復(fù)片段 和步驟③中Ava I線性化的、去憐酸化的pUCl 8Ava質(zhì)粒進(jìn)行連接。
[0204] 建立連接體系如下： ! 〇χ Ligasc bullTcr 1.0μΙ_. pUClSAva/'Aval 2.0[,iL (50ng '> AvaElOO巾義片段 2化山（lOOng) 5」Τ4 DNA Ligasc (5U/.uL) I.Oul ddH：0 4.uL Total volume ΙΟμL
[0206] 混合后，離屯、，放在PCR儀中，25°C連接60分鐘。常規(guī)方法轉(zhuǎn)化TOPIO大腸桿菌感受 態(tài)細(xì)胞。次日挑取克隆，搖菌，提取質(zhì)粒，用M13F(-47)和M13R(+48)測(cè)序引物確認(rèn)目的載體 構(gòu)建成功。最后獲得插入10個(gè)Αν址100的克隆在PUC18質(zhì)粒上的質(zhì)粒，AvaElOO片段頭尾相 連。用EcoRI酶切可W切出10個(gè)相同大小的l(K)bp長(zhǎng)度的片段。
[0207] 插入PUC18質(zhì)粒中的10個(gè)l(K)bp長(zhǎng)度的片段的序列如下：

[0209] 上述方法利用AvaI(C~TCGGG)的酶切位點(diǎn)的特點(diǎn)，將10個(gè)中間設(shè)計(jì)有EcoRI酶切位 點(diǎn)的l(K)bp長(zhǎng)度的片段構(gòu)建到PUC18載體上，并可W用Sal I單酶切將運(yùn)一段序列酶切下來 構(gòu)建到其它質(zhì)粒上。通過運(yùn)樣的技術(shù)可W增加 l(K)bp片段的數(shù)量。通常l(K)bp條帶泳動(dòng)在瓊 脂糖凝膠的最前面，由于DNA巧光染料漠化乙晚的泳動(dòng)方向和DNA相反，前面的巧光染料的 量減少明顯，DNA條帶會(huì)顯得弱。所W10個(gè)l(K)bp片段的整體亮度基本和7(K)bp條帶一致。
[0210] (4)M化質(zhì)粒構(gòu)建
[0211] 利用pUClSAva質(zhì)粒中的Sail酶切位點(diǎn)可W將運(yùn)個(gè)1006bp長(zhǎng)度的片段克隆到有 Sail酶切位點(diǎn)的M1D質(zhì)粒中，同時(shí)用Sail單酶切M1D質(zhì)粒，片段和載體連接，獲得一個(gè)插入了 10個(gè)lOObp片段的質(zhì)粒，即為ME質(zhì)粒，運(yùn)個(gè)質(zhì)粒的特點(diǎn)是含有10個(gè)l(K)bp片段，3個(gè)2(K)bp片 段，2個(gè)30化P片段，2個(gè)40化P片段，1個(gè)50化P片段，1個(gè)60化P片段和1個(gè)70化P片段。
[0212] Μ化質(zhì)粒序列如下：

GTCTCGGGAAAGAATTCCTTCCAATGGAAATTCAGCTTTCAAGATTAGTTGGACAACCTTTATGGGATGTTTCAAGG TCAAGCACAGGGAACCTTGTAGAGTCTCGGGGTCGAC
[0214] 本發(fā)明中的dm分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒在構(gòu)建片段引入過程中，添加了趾oI(CTCGAG) 和Bglll(AGATCT)酶切位點(diǎn)。Bglll和BamHI為同尾酶，Xhol和Sail為同尾酶。WBgin和 BamHI為例說明。需要添加8(K)bp長(zhǎng)度的片段時(shí)，設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物兩端的兩端分別添加 Bglll 和BamHI酶切位點(diǎn)，800bp擴(kuò)增片段經(jīng)Bgl II和BamHI雙酶切，本發(fā)明中的DM分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 粒Μ化經(jīng)Bgl II酶切作為載體。由于Bgl Π 和BamHI為同尾酶，經(jīng)Bgl II酶切的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 物質(zhì)粒mE可W和經(jīng)Bgin和BamHI雙酶切的80化P長(zhǎng)度擴(kuò)增片段可W連在一起，獲得一個(gè)新 的質(zhì)粒，運(yùn)個(gè)質(zhì)粒中由于BglII和BamHI連接后酶切位點(diǎn)消失，另一個(gè)是BglII和BglII的粘 末端連接，所W構(gòu)建的新質(zhì)粒還保留了一個(gè)Bgin的酶切位點(diǎn)。按照相同的方法可W將其它 片段不停的添加進(jìn)去。質(zhì)粒具有可持續(xù)性增加其它片段的特點(diǎn)。
[0215] 實(shí)施例8
[0216] 質(zhì)粒DNA純化工藝，即從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的具體操作，如下所示。
[0217] -、試劑
[021引 1丄B液體培養(yǎng)基化uria-Bertani ):稱取蛋白腺（TiTptone) lOg，酵母提取物 (化日31糾化日(：1:)5旨，化〔110旨，溶于8001111去離子水中，用化0的周抑至7.5，加去離子水至總 體積1升，高壓下蒸氣滅菌20分鐘。
[0219] 2丄姻體培養(yǎng)基:液體培養(yǎng)基中每升加15g瓊脂粉，高壓滅菌。
[0220] 3.氨節(jié)青霉素(Ampicillin，Amp)母液:配成50mg/ml水溶液，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0221] 4.溶菌酶溶液：用lOmmol/L TrisHCl(抑8.0)溶液配制成lOmg/ml，并分裝成小份 (如1.5ml)保存于-20°C，每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。
[0222] 5.3111〇1/1船4。（9冊(cè).2):501111水中溶解40.81旨船4。.抓20，用冰醋酸調(diào)抑至5.2，加 水定容至100ml，分裝后高壓滅菌，儲(chǔ)存于4°C冰箱。
[0223] 6.溶液 1:50mmo 1 /L葡萄糖，25mmo 1 /L TrisHC 1 (P冊(cè).0)，1 Ommo 1 /LEDTA(P冊(cè).0)。溶 液I可成批配制，每瓶100ml，高壓滅菌15分鐘，儲(chǔ)存于4°C冰箱。
[0224] 7.溶液Π :0.2mol/LNa0H(臨用前用lOmol/LNaOH母液稀釋），1%SDS。
[0225] 8.溶液虹：5111〇1/11^。6〇1111，冰醋酸11.51111，此〇2 8.51111，定容至10〇1111，并高壓滅 菌。溶液終濃度為：3mol/L r，5mol/L Ac-。
[Ο。6] 9.RNA酶A母液：將RNA酶A溶于lOmmol/L TrisHCl(pH7.5)，15mmol/L化Cl中，配成 lOmg/ml
[0227]的溶液，于100°C加熱15分鐘，使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5ml離屯、管分裝成 小份保存于-20°C。
[02%] 10.飽和酪:市售酪中含有釀等氧化物，運(yùn)些產(chǎn)物可引起憐酸二醋鍵的斷裂及導(dǎo)致 RNA和DNA的交聯(lián)，應(yīng)在160°C用冷凝管進(jìn)行重蒸。重蒸酪加入0.1 %的8-徑基哇嘟(作為抗氧 化劑），并用等體積的〇.5mol/LTrisHCl (抑8.0)和O.lmol/LTris肥l(p冊(cè).0)緩沖液反復(fù)抽 提使之飽和并使其抑值達(dá)到7.6 W上，因?yàn)樗嵝詶l件下DNA會(huì)分配于有機(jī)相。
[0229] 11.氯仿:按氯仿:異戊醇= 24:1體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于 液相與有機(jī)相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫。按體積/體積=1:1混合 上述飽和酪與氯仿即得酪/氯仿(1:1)。酪和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)戴手套。
[0230] 12.TE緩沖液：10mmo/LTris · Cl(p冊(cè).0)，lmmol/L抓TA(p冊(cè).0)。高壓滅菌后儲(chǔ)存 于4°C冰箱中。
[0231 ] 13.電泳所用試劑:(1)Τ肥緩沖液(5 X ):稱取Tris54g，棚酸27.5g，并加入0.5MEDTA (P冊(cè).0) 20ml，定溶至 1000ml。間上樣緩沖液(6 X ): 0.1 % 漠酪藍(lán)，60mM EDTA，30 % (w/v)，甘 油。
[02創(chuàng)二、操作步驟
[0233] 1.細(xì)菌的培養(yǎng)和收集
[0234] 將含有質(zhì)粒mE的D冊(cè)α菌種接種在LB固體培養(yǎng)基(含50μg/mlAmp)中，37°C培養(yǎng)12- 24小時(shí)。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5mlLB液體培養(yǎng)基(含50μg/mlAmp)中，37°C振蕩培養(yǎng) 約12小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。
[02巧]2.質(zhì)粒DNA少量快速提取
[0236] 質(zhì)粒DNA小量提取法對(duì)于從大量轉(zhuǎn)化子中制備少量部分純化的質(zhì)粒DNA十分有用。 運(yùn)些方法共同特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，能同時(shí)處理大量試樣，所得DNA有一定純度，可滿足限制酶 切割、電泳分析的需要。
[0237] 使用堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒提取
[0238] (1)取2ml細(xì)菌倒入2ml離屯、管中，4°C下13000巧m離屯、30秒。
[0239] (2)棄上清，將管倒置于吸水上數(shù)分鐘，使液體流盡。
[0240] (3)劇烈振蕩使菌體沉淀重懸浮于10化1溶液I中，室溫下放置5-10分鐘。
[0241] (4)加入20化1新配制的溶液Π ，蓋緊管口，快速溫和顛倒離屯、管數(shù)次，W混勻內(nèi)容 物(千萬不要振蕩）。
[0242] (5)加入15化1預(yù)冷的溶液虹，蓋緊管口，并倒置離屯、管，溫和顛倒離屯、管數(shù)次，此 時(shí)產(chǎn)生大量的白色沉淀，冰浴中5分鐘，使得沉淀完全。4°C下1300化pm離屯、10分鐘。
[0243] (6)上清液移入另一個(gè)干凈離屯、管中，加入等體積的酪/氯仿（1:1)，振蕩混勻，4°C 下13000巧m離屯、離屯、5分鐘。
[0244] (7)將上面的水相移入另一個(gè)干凈離屯、管中，加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻 后4 °C下13000巧m離屯、離屯、10分鐘。
[0245] (8)棄上清，將管口敞開倒置于吸水紙上使所有液體流出，加入lml70%乙醇洗沉 淀一次，13000巧m離屯、離屯、5分鐘。
[0246] (9)吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，室溫干燥。
[0247] (10)將沉淀溶于20μ1 TE緩沖液(PH8.0,含20μg/ml R化seA)中，儲(chǔ)于-20°C冰箱 中。
[0248] 3.質(zhì)粒DNA的大量提取和純化
[0249] 在制作酶譜、測(cè)定序列、制備探針等實(shí)驗(yàn)中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA，為此需 要大量提取質(zhì)粒DNA。大量提取的質(zhì)粒DNA-般需進(jìn)一步純化，常用柱層析法純化。
[0250] (1) 500ml過夜培養(yǎng)細(xì)菌，離屯、收集。
[0251] (2)加入20ml溶液I，充分重懸細(xì)菌沉淀，分散開。
[0252] (3)-次性加入40ml溶液II，顛倒混勻，室溫放置5分鐘。
[0253] (4)一次性加入20ml溶液III，顛倒混勻，冰水浴10分鐘。
[0254] (5)室溫10,000巧m離屯、10分鐘，轉(zhuǎn)移上清到另一個(gè)干凈管中。千萬別將沉淀物倒 到管中。
[0255] (6)加入0.6倍體積的異丙醇(例如6ml上清中需要補(bǔ)力日3.6ml異丙醇）。顛倒混勻， 室溫放置10分鐘。
[0256] (7)室溫10,000巧m離屯、10分鐘，棄上清。涼干沉淀物(大約30分鐘，稍微干，就可W 加 TE buffer了。）
[0257] (8)每個(gè)50ml離屯、管中加入1ml TE buffer P冊(cè).0,一般要4個(gè)50ml離屯、管。充分溶 解沉淀。
[0258] (9)合并所有的液體到一個(gè)管中，再用1ml TE buffer將其它幾個(gè)管子洗一下，再 將運(yùn)些液體合并到前面的液體中。運(yùn)樣總液體量大約為5ml。
[0259] (10)加入5ml 5mol/L的LiCl (需預(yù)先高壓備用），充分混勻，至于冰水浴5分鐘，使 RNA充分沉淀。
[0260] (11)室溫10,000rpm離屯、10分鐘，轉(zhuǎn)移大約10ml上清到另一個(gè)干凈管中。千萬別倒 掉上清(DNA在上清中，RNA則在沉淀中）。
[0%1] (12)倒入25ml左右的無水乙醇，顛倒混勻，室溫放置15分鐘。
[0262] (13)室溫10，000巧m離屯、10分鐘，棄上清。涼干沉淀物(大約30-60分鐘就可W加 TE buffer 了。 惦63] (14)加入含lOOug/ml的RNase A的TE buffer,-般加入的總量為2ml。充分溶解 后，每500ml-個(gè)管分裝到1.5ml離屯、管子中。
[0264] (15)37度消化3酷30分鐘。
[0265] (16)向每管中添加冰水浴后的等體積的PEG/化C1溶液。上面分裝的量為50〇111貝。 需加500U1PEG/化C1溶液。（PEG/化C1溶液：13%陽(yáng)G8000(質(zhì)量/體積），1.6mol/L化C1的溶 液，配制時(shí)先溶解PEG再加 NaCl，等完全溶解后再局壓備用）
[0%6] (17)充分混勻后，4度10，OOOrpm離屯、10分鐘?？梢娪型该鞒恋砦?。
[0267] (18)棄掉上清，用吸頭充分吸掉上清。留透明沉淀物。
[026引 （19)加入500U1TE，用TE充分溶解，可W在50度水浴中加速溶解。
[0269] (20)加入500ul酪/氯仿，充分混勻。室溫10,000rpm離屯、10分鐘，轉(zhuǎn)移上清到另一 個(gè)管中。
[0270] (21)加入500ul酪/氯仿，充分混勻。室溫10，OOOrpm離屯、10分鐘，轉(zhuǎn)移上清到另一 個(gè)管中。
[0271] (22)加入500ul氯仿，充分混勻。室溫10,000rpm離屯、10分鐘，轉(zhuǎn)移上清到另一個(gè)管 中。
[0272] (23)轉(zhuǎn)移上清400ul到一個(gè)新管中，加入1ml無水乙醇，50ul 3M乙酸鋼，P冊(cè).2,混 勻?？梢姵恋沓霈F(xiàn)。（該步可W放到-20度常時(shí)間凍存）
[0273] (24)室溫10,000巧m離屯、10分鐘，棄上清。
[0274] (25)加入500U170 %的乙醇，10，00化pm離屯、2分鐘，棄上清，用吸頭吸掉殘余的乙 醇。
[02巧](26)涼干后，用TE溶解。
[0276] (27)測(cè)00
[0277] 實(shí)施例9:酶切方法
[027引1、小量酶切
[0279] 提取好的質(zhì)粒DNA經(jīng)過精確定量，按照下面的反應(yīng)體系進(jìn)行小量酶切反應(yīng)； 10X EcoRi Burner 2μ1 Μ ΙΕ DNA ( lLig/μΙ) 1μ1
[0280] EgoR I 1 μ,Ι 姑讀水 16μL_. 總體觀 20μ1
[0281] 37°C解育2小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間；酶切完成后，經(jīng)濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，上 述小量酶切完全。
[0282] 2、大量酶切
[0283] 小量酶切成功后，按照小量酶切的體系進(jìn)行放大（一般參考小量酶切的條件判斷 質(zhì)粒和內(nèi)切酶是否合格，再?zèng)Q定進(jìn)行大量酶切）。由于DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒中有多個(gè)EcoR I酶切位點(diǎn)，通常需要更多的內(nèi)切酶，酶切時(shí)間也相應(yīng)增加，通常酶切體系為50ml。 10X EcoRI BuiTcr 5ml
[0284] Μ 1E DN A ( 1 yg /μΙ) 10ml EcoR i !〇ml
[0285] 雙蒸水 25 m! 總體積 50mj
[0286] 在37 °C下解育8小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。
[0287] 3、酶切產(chǎn)物的純化和定量
[0288] (1)大量酶切的產(chǎn)物等體積的酪/氯仿，充分混勻。室溫12,000巧m離屯、10分鐘，轉(zhuǎn) 移上清到另一個(gè)離屯、管中。
[0289] (2)等體積的氯仿，充分混勻。室溫12,000rpm離屯、10分鐘，轉(zhuǎn)移上清到另一個(gè)離屯、 管中。
[0290] (3)轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)新離屯、管中，加入兩倍體積的無水乙醇，十分之一的3M乙酸 鋼，P冊(cè).2，混勻。-20度放置過夜。
[0巧1] (4)室溫12，000巧m離屯、10分鐘，棄上清。
[0292] (5)加入一倍體積的70%乙醇，12,0(K)rpm離屯、2分鐘，棄上清，用吸頭吸掉殘余的 乙醇。
[0293 ] (6)涼干后，用適量TE溶解。
[0294] (7)通過梯度的稀釋，對(duì)照定量好的DNA條帶，確定分子量標(biāo)準(zhǔn)物的稀釋度。
[0巧日](8)補(bǔ)加含有甘油、漠酪藍(lán)和抓TA的10倍濃縮的DNA電泳上樣緩沖液，成為Marker I分子量標(biāo)準(zhǔn)物。如圖2所示，酶切后獲得的屯個(gè)片段之間的亮度差異在兩倍W內(nèi)，在瓊脂糖 凝膠電泳中顯示的DNA條帶亮度均勻、銳利。
[0296] 經(jīng)檢測(cè)，上述大量酶切完全。
[0巧7]實(shí)施例11
[029引本發(fā)明中的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒在構(gòu)建片段引入過程中，添加了趾oI(CTCGAG) 和Bglll(AGATCT)酶切位點(diǎn)。Bglll和BamHI為同尾酶，Xhol和Sail為同尾酶。WBgin和 BamHI為例說明。需要添加 8(K)bp長(zhǎng)度的片段時(shí)，設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物兩端的兩端分別添加 Bglll 和BamHI酶切位點(diǎn)，800bp擴(kuò)增片段經(jīng)Bgl II和BamHI雙酶切，本發(fā)明中的DM分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 粒Μ化經(jīng)Bgl II酶切作為載體。由于Bgl π和BamHI為同尾酶，經(jīng)Bgl II酶切的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 物質(zhì)粒mE可W和經(jīng)Bgin和BamHI雙酶切的80化P長(zhǎng)度擴(kuò)增片段可W連在一起，獲得一個(gè)新 的質(zhì)粒，運(yùn)個(gè)質(zhì)粒中由于BglII和BamHI連接后酶切位點(diǎn)消失，另一個(gè)是BglII和BglII的粘 末端連接，所W構(gòu)建的新質(zhì)粒還保留了一個(gè)Bgin的酶切位點(diǎn)。按照相同的方法可W將其它 片段不停的添加進(jìn)去。質(zhì)粒具有可持續(xù)性增加其它片段的特點(diǎn)。
[0299] 需要注意的是，本發(fā)明所說的一個(gè)酶切位點(diǎn)在另一個(gè)位點(diǎn)的外側(cè)，該外側(cè)均為靠 近5'端的一側(cè);此外，本發(fā)明所述的100~7(K)bp的整數(shù)片段，其可能包含有某個(gè)酶切位點(diǎn)。
[0300] 本發(fā)明不局限于上述最佳實(shí)施方式，任何人在本發(fā)明的啟示下所作的有關(guān)本發(fā)明 的任何修飾或變更，凡是具有與本申請(qǐng)相同或相近似的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物，其特征在于:所述小的脫氧核糖核酸分子量 標(biāo)準(zhǔn)物包括至少7條小的脫氧核糖核酸序列，其均為不大于lOOObp的片段，且所有片段均為 lOObp的整倍數(shù);所有所述片段均構(gòu)建于同一個(gè)載體上。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物，其特征在于:所述小的脫氧 核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物包括lOObp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp和700bp長(zhǎng)度的脫氧 核糖核酸序列；該脫氧核糖核酸序列通過重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、限制性內(nèi)切酶酶切法和脫 氧核糖核酸連接法構(gòu)建至同一個(gè)載體上。3. -種小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒，該質(zhì)粒為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其特征在于:所述標(biāo) 準(zhǔn)物質(zhì)粒包括質(zhì)粒骨架和小的脫氧核糖核酸序列，在所述小的脫氧核糖核酸序列內(nèi)部設(shè)有 酶切位點(diǎn)； 所述小的脫氧核糖核酸序列包括1〇(^口、20(^?、30(^?、40(^?、50(^?、60(^?和70(^?的 片段； 所述酶切位點(diǎn)包括EcoRI、BamH I、Hindm、SalI以及Xbal。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒，其特征在于:所述小的 脫氧核糖核酸序列包括10個(gè)lOObp、3個(gè)200bp、2個(gè)300bp、2個(gè)400bp、1個(gè)500bp、1個(gè)600bp以 及1個(gè)700bp的片段。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒，其特征在于:所述酶切 位點(diǎn)還包括Xho I以及Bgl II，所述Xhol和Sail為同尾酶，Bglll和BamHI為同尾酶。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒，其特征在于:所述小的 脫氧核糖核酸序列以及酶切位點(diǎn)在環(huán)狀的質(zhì)粒骨架上的連接順序依次為4 &111!114(3〇1?1-200bp-EcoRI-400bp-EcoRI-BamHI-XbaI-BglII-EcoRI-300bp-EcoRI-300bp-EcoRI-XbaI-Hindm-XhoI-EcoRI-200bp-EcoRI-200bp-EcoRI-Hindm-500bp-EcoRI-600bp-EcoRI-400bp-EcoRI-700bp-SalI-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-EcoRI-100bp-SalI，成為環(huán) 狀的小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒，其特征在于:該標(biāo)準(zhǔn)物 質(zhì)粒能夠被EcoRI完全酶切。8. -種小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物的制備方法，其特征在于:所述方法包括以下 步驟： (一)分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粒的構(gòu)建方法： Step 1:M1A的構(gòu)建：①以pUC19為模板，設(shè)計(jì)4對(duì)PCR引物，分別擴(kuò)增出500bp、600bp、 400bp和700bp的DNA條帶;②加入兩端引物，通過重疊 PCR的方法將①中的四個(gè)片段拼接在 一起，成為DNA長(zhǎng)片段，并在DNA長(zhǎng)片段兩端引入BamM酶切位點(diǎn)；③以質(zhì)粒PUC19為骨架質(zhì) 粒，BamM酶切DNA長(zhǎng)片段和骨架質(zhì)粒，并將DNA長(zhǎng)片段連接在骨架質(zhì)粒上，即為M1A質(zhì)粒； Step 2:M1B質(zhì)粒的構(gòu)建:①以克隆有小鼠 IGF2BP2基因組DNA的染色體DNA為模板，該模 板的DNA序列中只有一個(gè)EcoR頂每切位點(diǎn)；②設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物的5 '端帶有 Hindlll和EcoR頂每切位點(diǎn)，根據(jù)引物擴(kuò)增一400bp長(zhǎng)度的DNA片段;所述400bp長(zhǎng)度的DNA片 段經(jīng)EcoRI單酶切后能夠獲得兩個(gè)200bp的片段;③Hindlll單酶切400bp長(zhǎng)度的DNA片段和 M1A質(zhì)粒，并將二者連接在一起，即為M1B質(zhì)粒； Step 3:M1C質(zhì)粒的構(gòu)建:①同樣以克隆有小鼠 IGF2BP2基因組DNA的染色體DNA為擴(kuò)增 區(qū)域，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，該引物的5 '端包含BamHI和EcoRI位點(diǎn)；②根據(jù)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物為600bp的片段，該P(yáng)CR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI單酶切后能夠得到一個(gè)200bp和一個(gè)400bp的片段； ③BamHI單酶切PCR產(chǎn)物和M1B質(zhì)粒，將二者連接在一起，即為M1C; Step 4:M1D質(zhì)粒的構(gòu)建:①同樣以克隆有小鼠 IGF2BP2基因組DNA的染色體DNA為擴(kuò)增 區(qū)域，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，該引物的5 '端包含有Xbal和EcoRI位點(diǎn);②根據(jù)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 到長(zhǎng)度為600bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)EcoRI單酶切后能夠獲得兩個(gè)300bp的片段;③Xbal單酶切PCR 產(chǎn)物和M1C質(zhì)粒，并將二者連接在一起，即為M1D; Step 5:M1E質(zhì)粒的構(gòu)建： ① pUCl 8Ava質(zhì)粒構(gòu)建:A.合成序列ESASHF和ESASHR，ESASHF為 5-AATTCGTCGACCTCGGGGTCGACA-3，ESASHR為5-TCGAACAGCTGGG GCTCCAGCTGC-3;合成后進(jìn)行退火，得到兩端帶EcoRI和Hindll I粘末端的片段，同時(shí)引 進(jìn)了一個(gè)Ava I酶切位點(diǎn)以及在其兩側(cè)各有一個(gè)Sail酶切位點(diǎn)；B.用EcoR I和Hind III雙 酶切PUC18質(zhì)粒，獲得線性化的帶有EcoR I和Hind III粘末端的載體;C.將步驟①中退火后 的片段與步驟②中線性化的載體連接，得到pUCISAva質(zhì)粒，備用； ② AvaElOO片段的獲得:合成引物，并在上游引物中引入Aval和EcoR頂每切位點(diǎn)，下游引 物中引入Ava頂每切位點(diǎn)，再以Pfu聚合酶基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR產(chǎn)物，其5 '端包含 一個(gè)EcoRI，該P(yáng)CR產(chǎn)物為含有l(wèi)OObp長(zhǎng)度的AvaElOO片段； ③ 克隆AvaE 100重復(fù)序列的質(zhì)粒:A.單個(gè)AvaE 100用Aval單酶切，電泳，回收特異性的 lOObp長(zhǎng)度的片段;B.建立連接體系，將lOObp長(zhǎng)度的片段進(jìn)行連接，回收lOOObp長(zhǎng)度的片 段，即為AvaElOO重復(fù)片段;C.測(cè)序準(zhǔn)確的pUCISAva質(zhì)粒用Aval充分酶切，然后進(jìn)行去磷酸 化;D.將步驟B中回收的1 OOObp的AvaE 100重復(fù)片段和步驟C中AvaI線性化、去磷酸化的 pUC18Ava質(zhì)粒進(jìn)行連接，得到插入10個(gè)AvaElOO的克隆在pUC18質(zhì)粒上的質(zhì)粒； ④ M1E質(zhì)粒構(gòu)建:利用步驟③pUC18Ava中的Sail酶切位點(diǎn)將AvaElOO重復(fù)片段克隆到含 有Sail酶切位點(diǎn)的M1D質(zhì)粒中，獲得一個(gè)插入了10個(gè)lOObp片段的質(zhì)粒，即為M1E，所述M1E含 有10個(gè)lOObp片段、3個(gè)200bp片段、2個(gè)300bp片段、2個(gè)400bp片段、1個(gè)500bp片段、1個(gè)600bp 片段和1個(gè)700bp片段； (二) M1E質(zhì)粒DNA純化； (三) M1E質(zhì)粒DNA酶切:所述M1E質(zhì)粒能夠進(jìn)行完全酶切獲得小的脫氧核糖核酸分子量 標(biāo)準(zhǔn)物。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物的制備方法，其特征在于:在 Stepl中：①所述的M1A質(zhì)粒中包含大腸桿菌DNA復(fù)制起始子和氨芐青霉素抗性基因；②在所 述M1A質(zhì)粒中的DNA長(zhǎng)片段內(nèi)部引入3個(gè)EcoRI的限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)，能夠?qū)1A質(zhì)粒切成 500bp、600bp、400bp和700bp的DNA條帶;③在M1A質(zhì)粒內(nèi)的BamHI酶切位點(diǎn)兩側(cè)引入Salll、 Xbal和Hindin酶切位點(diǎn)以插入其它長(zhǎng)度的片段。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的小的脫氧核糖核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)物的制備方法，其特征在于： 在Step2中所述引物的上游引物中引入一個(gè)Xho I酶切位點(diǎn)，在步驟Step4中所述引物的上 游引物中引入一個(gè)Bgin酶切位點(diǎn)，用于后續(xù)片段的克隆。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK106011133SQ201610151474
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年3月16日
【發(fā)明人】齊建國(guó), 吳立群
【申請(qǐng)人】北京博邁德基因工程技術(shù)有限公司