一種重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其應(yīng)用方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其應(yīng)用方法，本發(fā)明首次克隆了木本植物毛果楊的PtABCC1基因，并將其轉(zhuǎn)入擬南芥中。通過(guò)鎘脅迫擬南芥實(shí)驗(yàn)，證明了PtABCC1可以增加擬南芥對(duì)鎘的抗性和富集。本發(fā)明為治理土壤重金屬污染提供了新的思路。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物修復(fù)技術(shù)，尤其是一種重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 前人研究表明，擬南芥的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的ABCC類(lèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCC1和ABCC2， 能將植物馨合膚馨合的重金屬儒、隸運(yùn)入液泡，從而減少其對(duì)植物細(xì)胞的毒害(Park J， Song WY,Ko D,et al.The phytochelatin transporters AtABCCland AtABCC2mediate tolerance to cadmium and mercury.Plant Journal,2012,69(2):278-288)。
[0003] 楊樹(shù)對(duì)儒的富集的研究已經(jīng)較多，但都還不深入。何佳麗等分析了灰楊，美洲黑 楊、歐美楊、84K楊、歐洲黑楊、群眾楊六種楊樹(shù)對(duì)儒脅迫的分子生理響應(yīng)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)運(yùn)六種 楊樹(shù)對(duì)儒都具有較高的耐受性與富集性化e J,Ma C,Ma Y,et al.Cadmium tolerance in six poplar species.Environmental Science and Pollution Research,2013,20(1): 163-174)。吳雁華等研究了京南地區(qū)±壤重金屬污染特征與楊樹(shù)修復(fù)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)棉白楊對(duì) ±壤中儒的吸附含量順序?yàn)槿~〉枝皮〉根皮〉根材〉莖皮〉枝材〉莖材(吳雁華.京南地區(qū)±壤 重金屬污染特征與楊樹(shù)修復(fù)效應(yīng)[碩±學(xué)位論文].中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(北京），2005)?；痠m等將 酵母中的ScYCFl(yeast cadmium factor 1)基因轉(zhuǎn)入到楊樹(shù)（Populus a化a X Populus tr emu la var. g 1 andu 1 ο sa，BHl)中，使得轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)中儒、鋒、鉛的積累量都有所提高 (Shim D,Kim S,Choi ΥΙ,et al.Transgenic poplar trees expressing yeast cadmium factor lexhibit the characteristics necessary for the phytoremediation of mine tailing soil.化emosphere,2013,90(4): 1478-1486)。胎等將細(xì)菌中的谷脫甘膚合 成酶在楊樹(shù)(Popu lus tr emu la X P. al ba)中過(guò)表達(dá)，使得楊樹(shù)對(duì)1 OOjiM的儒的抗性增強(qiáng)化e J,Li H,Ma C,et al.Overexpression of bacterial丫-glutamylcysteine synthetase mediates changes in cadmium influx,allocation and detoxification in poplar.化w Phytologist,2015,205(1):24〇-254)。
[0004] 生物修復(fù)技術(shù)中的植物修復(fù)技術(shù)，因其投資少，不需要大型設(shè)備，可長(zhǎng)久有效的處 理污染±壤，容易進(jìn)行后續(xù)處理等優(yōu)點(diǎn)吸引了我們的關(guān)注。楊樹(shù)是世界范圍內(nèi)種植最為廣 泛的一種速生樹(shù)木，具有一定的重金屬富集能力。我們擬克隆楊樹(shù)中負(fù)責(zé)重金屬富集的相 關(guān)基因，并在擬南芥中驗(yàn)證其功能，培育出富集重金屬能力更加強(qiáng)大的超富集植物材料，為 將來(lái)緩解±壤重金屬污染提供新的思路。
[0005] 本發(fā)明提供了一種木本植物重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其應(yīng)用方法。該基因可W增加 擬南芥對(duì)儒的抗性和富集，是首次將木本植物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因應(yīng)用于重金屬污染修復(fù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了 一種重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其應(yīng)用方法。
[0007] 生物修復(fù)技術(shù)中的植物修復(fù)技術(shù)，因其投資少，不需要大型設(shè)備，可長(zhǎng)久有效的處 理污染±壤，容易進(jìn)行后續(xù)處理等優(yōu)點(diǎn)吸引了我們的關(guān)注。楊樹(shù)是世界范圍內(nèi)種植最為廣 泛的一種速生樹(shù)木，具有一定的重金屬富集能力。我們擬克隆楊樹(shù)中負(fù)責(zé)重金屬富集的相 關(guān)基因，并在擬南芥中驗(yàn)證其功能，培育出富集重金屬能力更加強(qiáng)大的超富集植物材料，為 將來(lái)緩解±壤重金屬污染提供新的思路。
[000引毛果楊（Populus t;richoca;rpa To;r;r.&Gray)PtABCCl基因的克隆方法。
[0009] A、通過(guò)Trizol法從毛果楊(P. trichoca巧a)的嫩葉中提取RNA，利用Takara公司的 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;
[0010] B、W該cDNA作為PCR模板，使用肥B公司Q5高保真酶，W及PtABCCl基因特異引物 PtABCCl_FP4:5 '-GATGGGATTTGAAGCATTGGA、PtABCCl_RP2:5 '-CTACATTTCAACATGGTTCCAG擴(kuò) 增得到PtABCCl片段；
[0011] C、通過(guò)TA克隆方法將PtABCCl連入載體pCXSNeXcml酶切連接載體，會(huì)切除一條 670bp的小條帶。然后將轉(zhuǎn)化后得到的單菌落進(jìn)行菌檢，得到了陽(yáng)性克隆PtAl-25與PtAl- 35。
[0012] 將重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因應(yīng)用于植物中，培育出富集重金屬能力更加強(qiáng)大的植物， 為緩解±壤重金屬污染提供新的思路。
[0013] 將重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因應(yīng)用于植物中，包括W下步驟：
[0014] a、將P巧SN-PtABCCl質(zhì)粒載體通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)入植物中，得到T1代種子；
[0015] b、將T1代種子經(jīng)過(guò)消毒鋪于含有1/2MS潮霉素培養(yǎng)皿上，生長(zhǎng)10天左右可W看到 陽(yáng)性苗的生長(zhǎng)；
[0016] C、將陽(yáng)性植株苗移栽到±壤中生長(zhǎng)，收獲轉(zhuǎn)PtABCCl的T2代種子，T2種子繼續(xù)使用 潮霉素篩選，種植到±壤當(dāng)中，收獲T3代種子；
[0017] T3種子繼續(xù)使用潮霉素篩選，種植到±壤當(dāng)中，收獲T4代種子，利用T4代種子是否 發(fā)生分離比來(lái)確定T3代種子的純合與雜合，或繼續(xù)下一代純合體篩選。
[001引本發(fā)明的有益優(yōu)點(diǎn)：
[0019] (1)本發(fā)明成功克隆了毛果楊PtABCCl基因，是首先在木本植物中克隆得到ABCC類(lèi) 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白并應(yīng)用到植物修復(fù)研究中。通過(guò)儒脅迫擬南芥的實(shí)驗(yàn)，證明了PtABCCl可W增加擬 南芥Atabccl突變體對(duì)儒的抗性、增強(qiáng)野生型擬南芥對(duì)儒的富集作用。
[0020] (2)首先嘗試?yán)媚颈局参镏械腁BC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)χ参镞M(jìn)行操作，培育具有重金 屬超富集能力的植物，為治理上壤重金屬污染提供了新的思路。
【附圖說(shuō)明】
[00別]圖1:毛果楊RNA的提取(A)及PtABCCl的擴(kuò)增(B)，M為Marker。
[0022] 圖2:pCXSN質(zhì)粒的Xcml酶切與BamHI與Hindlll酶切質(zhì)粒pCXSN-PtABCCl的檢測(cè)結(jié) 果。
[0023] 圖3:擬南芥WT、PtABCCl-WT、Atabccl、PtABCCl-Atabccl在含有儒離子培養(yǎng)基中的 生長(zhǎng)情況(標(biāo)尺1.5cm)。
[0024] 圖4:在含有儒的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的不同擬南芥株系地上部分的儒含量。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面列舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明并不僅限于運(yùn)些實(shí)施 例。
[00%]毛果楊（Populus t;richoca;rpa To;r;r.&Gray)PtABCCl基因的克隆方法。
[0027] 通過(guò)Trizol法從毛果楊(P. trichocarpa)的嫩葉中提取RNA，利用Takara公司的逆 轉(zhuǎn)錄試劑盒將其mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA(圖2A);W該cDNA作為PCR模板，使用N邸公司Q5高保真 酶，W及PtABCCl基因特異引物PtABCCl_FP4:5'-GATGGGATTTGAAGCATTGGA、PtABCCl_RP2: 5 ' -CTACATTTCAACATGGTTCCAG擴(kuò)增得到PtABCCl片段，PCR方法與程序如下。
[002引
[0029] 反應(yīng)條件如下:98°C，30s預(yù)變性;33循環(huán):98°C，10s變性;Tm= 51.5°C，30s退火;72 °C延伸200s;最后72°C終延伸SmiruPCR產(chǎn)物W用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)質(zhì)量。
[0030] 擴(kuò)增片段的電泳顯示，該基因片段大小約為化b，與預(yù)測(cè)的片段大小4875bp-致 (圖1B)。圖1A中是毛果楊RNA提取后電泳檢測(cè)結(jié)果，其28S、18S、5s較為清晰明亮，其標(biāo)量是 2000bp的DNA marker。如圖1B中是PtABCCl的擴(kuò)增結(jié)果，圖中可W看到清晰明亮的5000bp左 右的條帶，W及一條模糊的小條帶，該短片段可能是非特異的擴(kuò)增帶。
[0031] 通過(guò)TA克隆方法將PtABCCl連入載體pCXSN(GenBank:FJ905214.1，ChenS等 2009)，連接載體使用Xcml進(jìn)行酶切，會(huì)切除一條67化P的小條帶（圖2A)。然后將轉(zhuǎn)化后得到 的單菌落進(jìn)行菌檢，得到了陽(yáng)性克隆PtAl-25與PtAl-35。提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，使用BamHI 與化ndin內(nèi)切酶分別進(jìn)行酶切（圖2B)，經(jīng)過(guò)分析，如果基因連接正確，BamHI酶切后將產(chǎn)生 4280bp與59化P的條帶，Hindlll酶切后將產(chǎn)生4248bp條帶。
[0032] 圖2中顯示PtAl-25與PtAl-35運(yùn)兩個(gè)克隆的酶切片段與預(yù)測(cè)的一致，說(shuō)明我們得 到了正確連接的克隆。
[0033] 測(cè)序工作由Life technologies測(cè)序部廣州分公司完成，測(cè)序結(jié)果與氨基酸序列 如沈Q ID NO: 1所示。
[0034] Μ 為 Marker;PtAl-25為pCXSN-PtABCCl-25號(hào)克隆，PtAl-35為pCXSN-PtABCCl-35號(hào) 克隆。
[0035] 在擬南芥野生型與Atabccl突變體中進(jìn)行毛果楊PtABCC基因的功能驗(yàn)證。
[0036] 將pCXSN-PtABCCl 質(zhì)粒載體通過(guò)浸花法（Mart inez-Zapater J , Sal inas J.Arabidopsis protocols .Humana Press , 1998)轉(zhuǎn)入野生型（WT)和Atabccl突變擬南芥 中，得到ΤΙ代種子分別命名為PtABCCl-WT和PtABCCl-A化bccl。將ΤΙ代種子經(jīng)過(guò)消毒鋪于含 有1/2MS潮霉素培養(yǎng)皿上，生長(zhǎng)10天左右可W看到陽(yáng)性苗的生長(zhǎng)。陽(yáng)性苗葉子較綠，有較長(zhǎng) 根部，能看到明顯的真葉。將陽(yáng)性植株苗移栽到±壤中生長(zhǎng)，收獲轉(zhuǎn)PtABCCl的Τ2代種子;Τ2 種子繼續(xù)使用潮霉素篩選，種植到±壤當(dāng)中，收獲Τ3代種子;Τ3種子繼續(xù)使用潮霉素篩選， 種植到±壤當(dāng)中，收獲Τ4代種子。利用Τ4代種子是否發(fā)生分離比來(lái)確定Τ3代種子的純合與 雜合，或繼續(xù)下一代純合體篩選。
[0037] 分別將擬南芥株系機(jī)\?148〔(：1-^、41日6(3(31、？148〇：1-4化6(3(31分別種在含有04]\1、 40μΜ、60μΜ儒離子的1/2MS培養(yǎng)基中。結(jié)果顯示如圖3當(dāng)擬南芥缺少了 AtABCCl后，植株對(duì)儒 離子敏感;當(dāng)楊樹(shù)PtABCCl在擬南芥Atabccl中過(guò)表達(dá)時(shí)，能提高植株對(duì)儒離子的耐受性。
[0038] 儒脅迫下1/2MS培養(yǎng)基中擬南芥的地上部分儒含量測(cè)定結(jié)果顯示，隨著儒濃度的 增高，擬南芥地上部分儒含量也增加，在40μΜΚ及eOiiM儒濃度下PtABCCl-WT地上部分儒的 積累都比WT植株顯著增多。PtABCCl可W促進(jìn)WT擬南芥對(duì)儒的吸收(圖4)。
[0039] W上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明掲露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 發(fā)明構(gòu)思加 W等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -種由權(quán)利要求1所述重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因編碼的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其特征在于，其 氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3. -種由權(quán)利要求1所述重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步 驟： A、 通過(guò)Trizol法從毛果楊的嫩葉中提取RNA，利用Takara公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其 mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA; B、 以該cDNA作為PCR模板，使用NEB公司Q5高保真酶，以及PtABCCl基因特異引物 PtABCCl_FP4:5，-GATGGGATTTGAAGCATTGGA、PtABCCl_RP2:5，-CTACATTTCAACATGGTTCCAG擴(kuò) 增得到PtABCCl片段； C、 通過(guò)TA克隆方法將PtABCCl連入載體pCXSN，pCXSN載體使用Xcml進(jìn)行酶切，會(huì)切除一 條670bp的小條帶，然后將轉(zhuǎn)化后得到的單菌落進(jìn)行菌檢，得到了陽(yáng)性克隆PtAl-25與PtAl-35〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在提高植物富集重金屬能力中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在提高擬南芥富集重金屬能力中的應(yīng) 用。6. -種如權(quán)利要求4所述的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因應(yīng)用的方法，其特征在于，包括以下步 驟： a、 將pCXSN-PtABCC1質(zhì)粒載體通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)入植物中，得到T1代種子； b、 將T1代種子經(jīng)過(guò)消毒鋪于含有1/2MS潮霉素培養(yǎng)皿上，生長(zhǎng)10天左右可以看到陽(yáng)性 苗的生長(zhǎng)； c、 將陽(yáng)性植株苗移栽到土壤中生長(zhǎng)，收獲轉(zhuǎn)PtABCCl的T2代種子，T2種子繼續(xù)使用潮霉 素篩選，種植到土壤當(dāng)中，收獲T3代種子。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的應(yīng)用方法，其特征在于，T3種子繼續(xù)使 用潮霉素篩選，種植到土壤當(dāng)中，收獲T4代種子，利用T4代種子是否發(fā)生分離比來(lái)確定T3代 種子的純合與雜合，或繼續(xù)下一代純合體篩選。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK106011151SQ201610624317
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年8月1日
【發(fā)明人】王邦俊, 馬義峰, 孫麗萍, 韓二琴, 王曉珠, 韓麗, 孫萬(wàn)梅
【申請(qǐng)人】西南大學(xué)