大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)化目標(biāo)蛋白質(zhì)的新方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)化蛋白質(zhì)的新方法。首先制備目標(biāo)蛋白質(zhì)分子中特定氨基酸位點(diǎn)的寡核苷酸飽和突變單鏈庫，或制備目標(biāo)蛋白質(zhì)分子的同源雙鏈或單鏈DNA突變庫；將上述突變庫轉(zhuǎn)化含有目標(biāo)基因或已經(jīng)整合目標(biāo)基因的大腸桿菌，通過λ?Red同源重組技術(shù)，建立含目標(biāo)基因突變庫的大腸桿菌菌群；再次將DNA突變庫轉(zhuǎn)化上述得到的大腸桿菌，形成更大庫容量的大腸桿菌突變庫；循環(huán)操作上述過程3?30次，構(gòu)建含有目標(biāo)基因突變的大腸桿菌基因組突變庫；最后通過高效篩選或高通量篩選獲得多種目標(biāo)蛋白質(zhì)突變體。這一技術(shù)可應(yīng)用于微生物單個(gè)基因原位進(jìn)化或多個(gè)目標(biāo)基因的同時(shí)原位進(jìn)化，提高酶催化活性，并應(yīng)用于提高微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。CCTCC NO:M201569220151123 CCTCC NO:M201569120151123
【專利說明】大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)化目標(biāo)蛋白質(zhì)的新方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及一種在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)化蛋白質(zhì)的新方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 定向進(jìn)化技術(shù)是一種在實(shí)驗(yàn)室中模擬達(dá)爾文進(jìn)化，進(jìn)化出在自然界并不存在的或 是具有更優(yōu)性質(zhì)的蛋白質(zhì)，并可W通過改變酶的催化效率改變代謝流，擴(kuò)展或構(gòu)建新的代 謝途徑，弱化或消除不必要或有害的代謝途徑，從而達(dá)到提高某種代謝產(chǎn)物產(chǎn)率或降解有 害物質(zhì)的目的。定向進(jìn)化技術(shù)主要有兩個(gè)步驟:首先利用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法構(gòu)建基因的 突變文庫，然后禪合篩選方法對文庫進(jìn)行篩選。突變文庫的構(gòu)建可W提供足夠的多樣性W 供篩選，是定向進(jìn)化的關(guān)鍵步驟。按照DNA突變發(fā)生的場所，構(gòu)建突變文庫的技術(shù)可W分為 體外突變和體內(nèi)突變。
[0003] 體外突變技術(shù)主要有易錯(cuò)PCR(error prone PCR)，DNA改組（DNA shuffling),交 錯(cuò)延伸過程（Staggered extension process,StEP)，定點(diǎn)飽和突變技術(shù)（Site directed saturation mutagenesis,SDSM)，迭代飽和突變（Iterative saturation mutagenesis， ISM)等。易錯(cuò)PCR(e;r;ror prone PCR)是通過改變聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件而隨機(jī)引入點(diǎn)突變 的;DNA改組(DNA shuffling)是一種DNA分子的體外重組技術(shù)，通過將一組序列相關(guān)的DNA 序列用D化se I隨機(jī)切割成小片段，隨后進(jìn)行PCR重聚實(shí)現(xiàn)基因重排得到突變文庫，再篩選 出有預(yù)期性狀的基因，運(yùn)種方法可W實(shí)現(xiàn)與親本序列有70%同源性序列的重組;而交錯(cuò)延 伸過程（Staggered extension process,S1:EP)是一種簡化了的DNA改組技術(shù)。定點(diǎn)飽和突 變技術(shù)（Site directed saUiration mutagenesis,SDSM)是將目的蛋白祀位點(diǎn)的氨基酸用 分別其他19種氨基酸替代，分析祀位點(diǎn)改造后蛋白的活性；迭代飽和突變（Iterative saturation mutagenesis,ISM)是一種反復(fù)的飽和突變方法，通過選擇結(jié)構(gòu)已知蛋白的幾 個(gè)重要區(qū)域的1-2個(gè)或3個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行反復(fù)飽和突變后獲得突變體文庫，并進(jìn)行篩選W獲 得功能提高的突變體。W上運(yùn)些體外突變技術(shù)雖然突變的效率比較高，但是必須將突變的 基因通過酶切連接到相應(yīng)的載體上轉(zhuǎn)化到生物體內(nèi)，突變基因被轉(zhuǎn)錄翻譯為對應(yīng)的蛋白表 現(xiàn)出一定表型，才可W禪合相應(yīng)的篩選技術(shù)對突變文庫進(jìn)行篩選。酶切連接轉(zhuǎn)化的步驟操 作繁瑣、過程復(fù)雜，不能、連續(xù)進(jìn)化，不能自發(fā)進(jìn)化，需要人工干預(yù)。
[0004] 體內(nèi)突變技術(shù)有物理化學(xué)誘變，PACE(隧菌體輔助持續(xù)進(jìn)化，MAGE(多位點(diǎn)自動(dòng)化 基因組編輯）。物理、化學(xué)誘變是利用物理、化學(xué)等因素處理生物體，W誘發(fā)遺傳物質(zhì)的突 變，從而引起形態(tài)特征的變異。運(yùn)一傳統(tǒng)的誘變方法的突變效率低而且沒有目標(biāo)性。最近， 哈佛大學(xué)化vid R Liu實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一種基于隧菌體生長的連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)，通過在大腸桿 菌體內(nèi)表達(dá)易突變的DNA聚合酶產(chǎn)生突變，并結(jié)合M13隧菌體建立了篩選體系實(shí)現(xiàn)了定向進(jìn) 化的自動(dòng)化。但是PACE技術(shù)的突變效率比較低只有10Λ對一個(gè)1化的基因隨機(jī)的3個(gè)位點(diǎn)實(shí) 現(xiàn)飽和突變幾乎沒有可能，另外PACE技術(shù)只可W對一個(gè)基因進(jìn)行進(jìn)化。
[0005] George化urch實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了MAGE(多重自動(dòng)基因組改造技術(shù)）。它同時(shí)針對基因 組的不同區(qū)域設(shè)計(jì)一系列的單鏈寡核巧酸簡并引物，利用λ-Red同源重組系統(tǒng)將運(yùn)些簡并 引物整合到基因組上，實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞基因組多個(gè)位點(diǎn)的改造或細(xì)胞群體間基因組改造的多 樣性。他們針對該技術(shù)的周期性和可擴(kuò)展性設(shè)計(jì)了可W實(shí)現(xiàn)該過程的自動(dòng)化操作裝置。利 用該技術(shù)定向改造大腸桿菌中番茄紅素合成過程中的20個(gè)基因的RBS區(qū)，設(shè)計(jì)不同的簡并 引物，使他們定向進(jìn)化到認(rèn)為可W提高表達(dá)量的經(jīng)典的SD序列(TAAGGAGGT)模式，最終篩選 得到高產(chǎn)菌株，并對運(yùn)些高產(chǎn)菌株的基因序列分析得出參與番茄紅素合成起始W及末端的 基因的RBS序列趨于相似。MAGE技術(shù)雖然在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對代謝通路中多基因 RBS序列的突變 文庫的構(gòu)建，但是并沒有實(shí)現(xiàn)對代謝途徑中單個(gè)或多個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行原位定 向進(jìn)化。但在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，一個(gè)目標(biāo)基因所編碼的酶蛋白在微生物代謝網(wǎng)絡(luò)中所起到 的代謝調(diào)控作用，往往取決于該基因的體內(nèi)表達(dá)水平和編碼蛋白質(zhì)的酶活性。已報(bào)道，有很 多方法被發(fā)明如何調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)，但還沒有出現(xiàn)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行原位同源重 組進(jìn)化酶蛋白基因的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明設(shè)及一種在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)化蛋白質(zhì)的新方法，并應(yīng)用于一種或多 種酶催化性能的提高，從而提高微生物特定目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。
[0007] 在本發(fā)明中，包括構(gòu)建一個(gè)包含一個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn)的核酸庫，包括體外合成的 寡核巧酸單鏈庫或制備的單鏈DNA庫或雙鏈DNA庫，通過λ-Red同源重組技術(shù)，利用所述核酸 庫對大腸桿菌胞內(nèi)載體上或基因組上的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行原位重組，達(dá)到進(jìn)化酶分子結(jié)構(gòu)提高 酶催化效率的目的。寡核巧酸可W W化學(xué)合成的方式獲取;單鏈核巧酸的獲取方式包括但 不限于T7逆轉(zhuǎn)錄法，核酸外切酶法，變性高效液相色譜法，磁珠捕獲法，不對稱PCR，兩步PCR 法等;雙鏈核巧酸可W通過PCR法合成獲得。
[0008] 寡核巧酸和單鏈核巧酸可W在其5'端的1至4位堿基處進(jìn)行修飾;雙鏈核巧酸在其 中一條鏈的5'端的1至4位堿基處進(jìn)行修飾，W避免在轉(zhuǎn)化入細(xì)胞后被核酸酶所降解。修飾 的方式包括但不限于5 '端漠尿喀晚修飾，5 '端氯尿喀晚修飾，5 '端艦代尿喀晚修飾，憐酸醋 修飾，硫代憐酸修飾等。
[0009] 寡核巧酸、單鏈核巧酸和雙鏈核巧酸可W通過轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 運(yùn)里提到的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染指的是一些成熟地把外源核巧酸導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞的技術(shù)，包括但不限 于憐酸巧法，氯化巧法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔法，光穿孔法等。轉(zhuǎn)染介質(zhì)包括但不限于水，氯 化巧，脂質(zhì)體等。
[0010]在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染之前，大腸桿菌細(xì)胞在3(TC培養(yǎng)至一定濃度，并于42°C進(jìn)行誘導(dǎo)。在 細(xì)胞基因組上的λ-Red同源重組系統(tǒng)在pL啟動(dòng)子控制下，并受到CI857阻遏蛋白的調(diào)控。在 30°C時(shí)化啟動(dòng)子受阻遏不表達(dá)，42°C時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)λ-Red同源重組所需的Ξ個(gè)蛋白。經(jīng)過 15min誘導(dǎo)之后的細(xì)胞放于4°C保存，防止誘導(dǎo)的蛋白降解。
[0011] 培養(yǎng)基需要置換成轉(zhuǎn)染介質(zhì)，去除其中的離子。此過程可W采用的方式包括但不 限于離屯、法，膜過濾法等。
[0012] 在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染過程中，加入核酸庫的同時(shí)，引入抗性回復(fù)核巧酸片段，可W在抗性 平板上進(jìn)行篩選，并提高抗性基因附近位置的重組效率。合適的抗性基因包括但不限于氨 節(jié)抗性基因，四環(huán)素抗性基因，卡那霉素抗性基因，新霉素抗性基因，氯霉素抗性基因等。
[0013] 合適的篩選標(biāo)記可W被應(yīng)運(yùn)于平板篩選，流式細(xì)胞儀篩選，微流控等。篩選標(biāo)記包 括但不限于各種酶，輔助基團(tuán)，巧光標(biāo)記，發(fā)光標(biāo)記，生物發(fā)光基團(tuán)等。巧光標(biāo)記包括但不限 于黃色巧光蛋白，綠色巧光蛋白，青色巧光蛋白，羅丹明等。生物發(fā)光基團(tuán)包括但不限于蛋 光素酶，發(fā)光蛋白質(zhì)等。一些能產(chǎn)生視覺信號的酶包括但不限于半乳糖巧酶，憐酸酶，過氧 化物酶，膽堿醋酶等。
[0014] 本發(fā)明為了在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)較高的突變率并對基因組上的一個(gè)或多個(gè)基因進(jìn)行突變， 提供了一種體內(nèi)突變方法，通過反復(fù)λ-Red同源重組的策略對大腸桿菌的整個(gè)基因組進(jìn)行 突變，尤其是對結(jié)構(gòu)基因的修飾，達(dá)到對功能蛋白所對應(yīng)基因的原位進(jìn)化目的。此方法可W 對基因組上單一基因進(jìn)行進(jìn)化，也可W同時(shí)對多個(gè)基因進(jìn)行修飾，并禪合篩選，尋找出多個(gè) 突變蛋白協(xié)同作用所達(dá)到的最佳效果。
[0015] 本發(fā)明所提供的在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)化蛋白質(zhì)的新方法是一種有效得獲得 所需生物分子或生物物質(zhì)的方法，比W往的方法更加簡便、高效。
[0016] 本發(fā)明所提供的在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)化蛋白質(zhì)的新方法，可W通過大腸桿菌 胞內(nèi)目標(biāo)基因關(guān)鍵氨基酸的原位飽和突變，提高化咯哇嘟依賴型葡萄糖脫氨酶的熱穩(wěn)定性 和催化特異性。
[0017] 本發(fā)明所提供的在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)化蛋白質(zhì)的新方法，所述方法可應(yīng)用于 體內(nèi)原位重組突變番茄紅素合成關(guān)鍵酶1-脫氧-D-木酬糖-5-憐酸合成酶基因，提高其表達(dá) 蛋白的可溶性水平和催化效率。通過篩選得到的5個(gè)1-脫氧-D-木酬糖-5-憐酸合成酶(DXS) 突變體。其中，突變體DXSa (S217P，L22細(xì)），DXSb 化214E，K227E，G512H)，DXSc 化230G)和DXSd (￥115山61824，1^2261?少4355)的可溶表達(dá)相對于野生型0乂5蛋白都提高了2倍^上。0乂5突變 體(DXSa，DXSb，DXSd和DXSeQ 170T K213E，N249S))的比酶活都得到了明顯提高，從而提高 了含相應(yīng)突變基因的大腸桿菌生物合成番茄紅素水平2-5倍。
[0018] 本發(fā)明所提供的在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)化蛋白質(zhì)的新方法，所述方法可采用同 時(shí)突變多個(gè)番茄紅素關(guān)鍵酶基因從而提高大腸桿菌合成番茄紅素的生產(chǎn)水平。
[0019] 本發(fā)明還提供了大腸桿菌菌株EcLY饑，保存編號為CCTCC Μ 2015692的大腸桿菌 菌株，該菌株的可溶性表達(dá)水平和酶催化效率都得到明顯提高。
[0020] 本發(fā)明還提供了大腸桿菌菌株ECLYC246,保存編號為CCTCC Μ 2015692,提高了大 腸桿菌合成番茄紅素的生產(chǎn)水平。
【附圖說明】
[0021] 圖1:本發(fā)明流程與傳統(tǒng)DNA重排技術(shù)對比示意圖。其中，DNA Shuffling Method: DNA重排技術(shù)；DNase I Digestion：DNase I酉每切；cycles of denaturation,annealing, extension:多次變性，連接，延伸；Cloning，Transformation:克隆，轉(zhuǎn)化；Gene :基因； Error-Prone PCR:易錯(cuò)PCR;Asymmet;ric PCR:不對稱PCR; Synthetic Oligos:合成寡聚核 巧酸；cycles of Recombination:多次重組;Genome:基因組;E.coli:大腸桿菌。
[0022] 圖2:野生型及GDH突變體在55°C的熱穩(wěn)定性分析圖。
[0023] 圖3:野生型及DXS突變蛋白的可溶表達(dá)情況對比圖。其中，Comparation of Soluble DXS Expression:可溶DXS蛋白表達(dá)情況對比；Marker:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)大小。
[0024] 圖4:野生型及DXS突變蛋白的比酶活對比圖。其中，Retention time:保留時(shí)間； Specific enzyme activity:t：t酉每活。
[0025] 圖5:野生型及含dxs突變體的大腸桿菌菌株產(chǎn)番茄紅素能力對比圖；其中， Lycopene Production:番茄紅素產(chǎn)量。
[0026] 圖6:野生型及含dxs突變體的大腸桿菌菌株產(chǎn)番茄紅素能力對比圖；其中， Lycopene Production:番茄紅素產(chǎn)量。
[0027] 圖7:野生型及含多個(gè)基因突變的大腸桿菌菌株產(chǎn)番茄紅素能力對比圖；其中， Lycopene Production:番茄紅素產(chǎn)量。
[0028] 圖8:野生型及含多個(gè)基因突變的大腸桿菌菌株產(chǎn)番茄紅素能力對比圖；其中， Lycopene Production:番茄紅素產(chǎn)量。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 本發(fā)明的操作流程如圖1所示，并通過W下五個(gè)例子更好得闡述，分別為提高化咯 哇嘟依賴型葡萄糖脫氨酶熱穩(wěn)定性和催化特異性，提高1-脫氧-D-木酬糖-5-憐酸合成酶的 可溶表達(dá)和催化活性，W及提高大腸桿菌中番茄紅素合成途徑的多個(gè)關(guān)鍵酶的催化活性。
[0030] 實(shí)施例1，大腸桿菌體內(nèi)原位進(jìn)化化咯哇嘟依賴型葡萄糖脫氨酶
[0031] 大腸桿菌EcNR2化arris H.Wang等.2009Nature.460:894-890)在溫度條件誘導(dǎo)下 可W表達(dá)λ-Red重組所需蛋白，表現(xiàn)出對80-100nt寡核巧酸的高重組效率。
[0032] 把化咯哇嘟依賴型葡萄糖脫氨酶基因（g化)通過λ-Red同源重組插入到上述菌株 基因組上，命名為EcGDH。設(shè)計(jì)兩條90nt含兼并堿基的寡核巧酸分別對應(yīng)g化基因的兩個(gè)活 性位點(diǎn)：熱穩(wěn)定性(S231，SEQIDN0.1)和催化特異性(N452，SEQIDN0.2)，構(gòu)成一個(gè)寡核 巧酸突變庫，并用該突變庫在基因組上進(jìn)行點(diǎn)飽和突變。同時(shí)合成一條用于恢復(fù)原本基因 組上被沉默的氯霉素抗性基因的90nt寡核巧酸(SEQ ID NO.3)。
[0033] 在50mL LB培養(yǎng)基的搖瓶中接入從平板上挑取的大腸桿菌EcGDH單菌落，并加入25 yL卡那霉素，30 °C下?lián)u床過夜培養(yǎng)；
[0034] 轉(zhuǎn)接1%的菌液至2mL LB培養(yǎng)基的試管中，置于30°C下?lián)u床培養(yǎng)2.5-化至0D達(dá)到 0.7左右；
[0035] 將試管置于42°C水浴中振蕩培養(yǎng)15min，誘導(dǎo)λ-Red重組蛋白充分表達(dá)；
[0036] 將試管置于冰上5min;
[0037] 取ImL菌液移入1.5血預(yù)冷離屯、管中，4°C下W1300化/min離屯、30s，棄去上清液，加 入預(yù)冷的無菌水1ml重懸洗涂，棄去上清液，并用預(yù)冷的無菌水1ml重懸洗涂2次；
[0038] 去除上清液，并用10化L預(yù)冷無菌水重懸菌體，加入寡核巧酸突變庫和抗性回復(fù)寡 核巧酸；
[0039] 將上述混合物轉(zhuǎn)移到2mm電轉(zhuǎn)杯中，在電容25μΡ，電壓2.化V，電阻200 Ω條件下進(jìn) 行電擊；
[0040] 迅速將準(zhǔn)備好的1ml S0C培養(yǎng)基加入到電擊杯中，輕輕吹打使細(xì)胞懸浮。將電擊杯 中的混合液轉(zhuǎn)移到裝有1ml培養(yǎng)基的試管中，放入3(TC搖床培養(yǎng)，使細(xì)胞復(fù)蘇；
[0041 ]當(dāng)細(xì)胞復(fù)蘇到0D達(dá)到0.7左右時(shí)，重復(fù)上述步驟，進(jìn)行第二輪轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化過程一 共進(jìn)行3-5輪；
[0042]最后一輪電轉(zhuǎn)后，復(fù)蘇12h。在氯霉素抗生素平板上進(jìn)行篩選，通過與一系列底物 的顯色反應(yīng)來篩選熱穩(wěn)定性提高或催化特異性提高的突變子。野生型EcGDH及GDH突變體 化cG畑a，EcGDHb，EcGDHc，EcGD冊，EcGDHe，EcGDHf)的催化特異性對比如表1所示，其在55 °C 的熱穩(wěn)定性分析如圖2所示。
[0043] 表1:各種GDH突變體的氨基酸突變及催化特性總結(jié)
[0044]
[0046] 從表中可W看出，大腸桿菌菌株EcG畑a，EcGDHb，EcGDHc，EcGD冊中的GDH突變體的 底物特異性得到了提高。相對于野生型大腸桿菌中的GDH，其對于乳糖和麥芽糖的相對活性 降低了28%至42%。大腸桿菌菌株EcG畑b和EcGDHf中的GDH突變體的熱穩(wěn)定相對于野生型 GDH分別提高了 1.69和1.6倍。
[0047] 實(shí)施例2用雙鏈核巧酸在大腸桿菌體內(nèi)原位進(jìn)化1-脫氧-D-木酬糖-5-憐酸合成酶 [004引雙鏈核巧酸在大腸桿菌中通過λ-Red同源重組的效率比較低，只有0.01%。研究發(fā) 現(xiàn)，大腸桿菌EcNR2(化rris H.Wang等.（2009)化1:ure.460:894-890)在溫度條件誘導(dǎo)下可 W表達(dá)λ-Red重組所需蛋白，通過與抗性回復(fù)片段共同轉(zhuǎn)化可W顯著提高重組效率。
[0049] 1-脫氧-D-木酬糖-5-憐酸合成酶(dxs)是大腸桿菌中異戊二締合成途徑中一個(gè)關(guān) 鍵酶，W3-憐酸-甘油醒和丙酬酸為底物合成1-脫氧-D-木酬糖-5-憐酸。在大腸桿菌EcNR2 中引入外源基因 crtE，沈tB，crti，使得該大腸桿菌可W產(chǎn)番茄紅素，命名為EcLYC。由于番 茄紅素具有可見的紅色，可W根據(jù)菌落紅色的深淺，高通量的篩選番茄紅素產(chǎn)量提高的菌 株。
[0050] 體外制備帶突變的雙鏈dxs基因：
[0051 ]根據(jù)NCBI上的CCD工具分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DXS蛋白有Ξ個(gè)保守區(qū)域，所W制備了 3條帶 突變的雙鏈核巧酸；
[0化2] 分別用5'端4個(gè)堿基硫代修飾的上引物dxs-1-for(沈Q ID N0.4)，dxs-2-for(SEQ 10顯.5)，扣3-3寸〇^沈9 10^.6)和下引物扣3-1寸6￥(沈9 10^.7)，扣3-2寸6￥(569 ID N0.8)，dxs-3-rev(沈Q ID 側(cè).9)，在添加胞2+的條件下，941：453,541：5〇3,72°(：1111111循 環(huán)30次做易錯(cuò)PCR，割膠純化回收得到的含有突變的雙鏈突變庫。
[0053]在50mL LB培養(yǎng)基的搖瓶中接入從平板上挑取的大腸桿菌EcLYC單菌落，并加入25 yL卡那霉素，30 °C下?lián)u床過夜培養(yǎng)；
[0化4]轉(zhuǎn)接1%的菌液至2mL LB培養(yǎng)基的試管中，置于30°C下?lián)u床培養(yǎng)2.5-化至0D達(dá)到 0.7左右；
[0055]將試管置于42°C水浴中振蕩培養(yǎng)15min，誘導(dǎo)λ-Red重組蛋白充分表達(dá)；
[0化6] 將試管置于冰上5min;
[0化7] 取ImL菌液移入1.5血預(yù)冷離屯、管中，4Γ下W1300化/min離屯、30s，棄去上清液，加 入預(yù)冷的無菌水1ml重懸洗涂，棄去上清液，并用預(yù)冷的無菌水1ml重懸洗涂2次；
[0058]去除上清液，并用10化L預(yù)冷無菌水重懸菌體，加入帶突變的雙鏈突變庫和抗性回 復(fù)寡核巧酸；
[0化9] 將上述混合物轉(zhuǎn)移到2mm電轉(zhuǎn)杯中，在電容25μΡ，電壓2.化V，電阻200 Ω條件下進(jìn) 行電擊；
[0060] 迅速將準(zhǔn)備好的1ml S0C培養(yǎng)基加入到電擊杯中，輕輕吹打使細(xì)胞懸浮。將電擊杯 中的混合液轉(zhuǎn)移到裝有1ml培養(yǎng)基的試管中，放入3(TC搖床培養(yǎng)，使細(xì)胞復(fù)蘇；
[0061] 當(dāng)細(xì)胞復(fù)蘇到0D達(dá)到0.7左右時(shí)，重復(fù)上述步驟，進(jìn)行第二輪轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化過程一 共進(jìn)行8輪；
[0062] 最后一輪電轉(zhuǎn)后，復(fù)蘇12h。在平板上篩選出紅色較深的菌落。DXS蛋白的氨基酸突 變情況如表2所示，其可溶性表達(dá)情況如圖3所示，其比酶活情況如圖4所示，W及影響產(chǎn)番 茄紅素能力對比如圖5所示（其中EcLYCb已申請專利菌種保存，菌種保藏號為CCTCC Μ 2015691)。
[0063] 表2DXS突變蛋白的氨基酸突變情況
[0064]
[00化]從圖3中可W看出，DXS突變體DXSa(SEQ ID N0.10)，DXSb(SEQ ID N0.11)，DXSc (569 10^.12)和0乂5(1(569 10^.13)的可溶表達(dá)相對于野生型0乂5蛋白（569 10^.14) 都提高了 2倍W上。可溶表達(dá)的提高使得其在胞內(nèi)的有效蛋白量得到提高。通過體外酶反應(yīng) 可知，DXS突變體DXSa，DXSb，DXSd和DXSe(SEQ ID NO. 15)的比酶活都提到了提高，并最終使 得各株大腸桿菌的番茄紅素積累量相對于野生型菌株提高了 4倍W上。其中，EcLY化已申請 專利菌種保存，菌種保藏號為CCTCC Μ 2015691，此株大腸桿菌中的DXS蛋白突變體可溶表 達(dá)量高，比酶活高，且番茄紅素的積累量是野生型大腸桿菌菌株的5倍W上。
[0066] 實(shí)施例3用單鏈核巧酸在大腸桿菌體內(nèi)原位進(jìn)化1-脫氧-D-木酬糖-5-憐酸合成酶
[0067] 大腸桿菌EcNR2化arris Η.Wang等.（2009)化Uire.460:894-890)在溫度條件誘導(dǎo) 下可W表達(dá)λ-Red重組所需蛋白，對5 '端4個(gè)堿基硫代修飾的長單鏈也有較高的重組效率， 因?yàn)樵谥亟M過程中少了把雙鏈變單鏈的步驟。
[0068] 1 -脫氧-D-木酬糖-5-憐酸合成酶(dxs)是大腸桿菌中異戊二締合成途徑中一個(gè)關(guān) 鍵酶，W3-憐酸-甘油醒和丙酬酸為底物合成1-脫氧-D-木酬糖-5-憐酸。在大腸桿菌EcNR2 中引入外源基因(3的6，(3的8，(3的1，使得該大腸桿菌可^產(chǎn)番茄紅素，作為一種篩選標(biāo)志物， 命名為EcLYC。
[0069] 體外制備帶突變的5'端4個(gè)堿基硫代修飾的dxs基因長單鏈：
[0070] 用5'端4個(gè)堿基硫代修飾的上引物扣3寸〇^569 10^.16)和5'端憐酸化的下引 物dxs-rev(SEQ ID ^.17)兩個(gè)引物^扯3基因?yàn)槟０?，在添加?+的條件下，941：453,541： 50s，72 °C 2min循環(huán)30次做易錯(cuò)PCR，割膠純化回收得到的雙鏈；
[0071] W上述含有突變的雙鏈為模板，在PCR體系中只添加5'端4個(gè)堿基硫代修飾的上引 物dxs-for(沈Q ID 備.16)，941：3〇3,531：3〇3,721：4111111循環(huán)15次，制備得到扯3單鏈；
[0072] 用Lambda EX0外切酶處理上述得到的PCR產(chǎn)物，把其中的dxs雙鏈酶切成單鏈；
[0073] 乙醇沉淀得到5 '端4個(gè)堿基硫代修飾的dxs單鏈突變庫。
[0074] 在50mL LB培養(yǎng)基的搖瓶中接入從平板上挑取的大腸桿菌EcLYC單菌落，并加入25 yL卡那霉素，30 °C下?lián)u床過夜培養(yǎng)；
[00巧]轉(zhuǎn)接1%的菌液至2mL LB培養(yǎng)基的試管中，置于30°C下?lián)u床培養(yǎng)2.5-化至0D達(dá)到 0.7左右；
[0076] 將試管置于42°C水浴中振蕩培養(yǎng)15min，誘導(dǎo)λ-Red重組蛋白充分表達(dá)；
[0077] 將試管置于冰上5min;
[0078] 取ImL菌液移入1.5血預(yù)冷離屯、管中，4°C下W1300化/min離屯、30s，棄去上清液，加 入預(yù)冷的無菌水1ml重懸洗涂，棄去上清液，并用預(yù)冷的無菌水1ml重懸洗涂2次；
[0079] 去除上清液，并用10化L預(yù)冷無菌水重懸菌體，加入5'端4個(gè)堿基硫代修飾的dxs單 鏈突變庫和抗性回復(fù)寡核巧酸；
[0080] 將上述混合物轉(zhuǎn)移到2mm電轉(zhuǎn)杯中，在電容25μΡ，電壓2.化V，電阻200 Ω條件下進(jìn) 行電擊；
[0081 ]迅速將準(zhǔn)備好的1ml S0C培養(yǎng)基加入到電擊杯中，輕輕吹打使細(xì)胞懸浮。將電擊杯 中的混合液轉(zhuǎn)移到裝有1ml培養(yǎng)基的試管中，放入3(TC搖床培養(yǎng)，使細(xì)胞復(fù)蘇；
[0082] 當(dāng)細(xì)胞復(fù)蘇到0D達(dá)到0.7左右時(shí)，重復(fù)上述步驟，進(jìn)行第二輪轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化過程一 共進(jìn)行4-6輪；
[0083] 最后一輪電轉(zhuǎn)后，復(fù)蘇12h。在平板上篩選出紅色較深的菌落。野生型EcLYC及含 DXS突變體的大腸桿菌菌株化化YC-a，E化YC-b，E化YC-c，E化YC-d，E化YC-e)產(chǎn)番茄紅素能 力對比如圖6所示。
[0084] 從圖中可W看出，各株含有DXS突變體的大腸桿菌菌株的番茄紅素積累量相對于 野生型菌株都得到了提高，其中EcLYC-d提高了 1倍W上。
[0085] 實(shí)施例4大腸桿菌胞內(nèi)原位同時(shí)進(jìn)化多個(gè)番茄紅素合成關(guān)鍵基因
[00化]引入外源基因(31'巧，沈113，(31'1:1的大腸桿菌6。^2能夠合成番茄紅素化江￥〇，該合 成過程主要依賴大腸桿菌中的異戊二締合成途徑，同時(shí)對ATP和NADPH都有需求。在此過程 中，存在多個(gè)關(guān)鍵酶可W提升異戊二締代謝流，并提高NADPH的供應(yīng)量，如dxs，dxr，idi， ispA，talB 等。
[0087] 采用兩步PCR和易錯(cuò)PCR獲得上述基因同源帶突變的單鏈核巧酸，Wdxs基因?yàn)槔?說明體外制備帶突變的5'端4個(gè)堿基硫代修飾的dxs基因長單鏈的過程。
[0088] 用5'端4個(gè)堿基硫代修飾的上引物扣3寸〇^569 10^.16)和5'端憐酸化的下引 物dxs-rev(SEQ ID ^.17)兩個(gè)引物^扯3基因?yàn)槟０澹谔砑影?+的條件下，941：453,541： 50s，72 °C 2min循環(huán)30次做易錯(cuò)PCR，割膠純化回收得到的雙鏈；
[0089] W上述易錯(cuò)雙鏈為模板，在PCR體系中只添加5 '端4個(gè)堿基硫代修飾的上引物dxs- for(沈Q ID 備.16)，941：3〇3,531：3〇3,721：4111111循環(huán)15次，制備得到扯3單鏈；
[0090] 用Lambda EXO外切酶處理上述得到的PCR產(chǎn)物，把其中的dxs雙鏈酶切成單鏈；
[0091] 乙醇沉淀得到帶突變的5'端4個(gè)堿基硫代修飾的dxs單鏈。
[0092] 重復(fù)上述方法，獲得dxs，dxr，idi，ispA，talB和巧OS帶突變的5 '端4個(gè)堿基硫代修 飾的單鏈。
[0093] 運(yùn)些單鏈混合在一起成為一個(gè)單鏈DNA突變庫。
[0094] 在50mL LB培養(yǎng)基的搖瓶中接入從平板上挑取的大腸桿菌EcLYC單菌落，并加入25 yL卡那霉素 ，30 °C下?lián)u床過夜培養(yǎng)；
[00M]轉(zhuǎn)接1%的菌液至2mL LB培養(yǎng)基的試管中，置于30°C下?lián)u床培養(yǎng)2.5-化至0D達(dá)到 0.7左右；
[0096] 將試管置于42°C水浴中振蕩培養(yǎng)15min，誘導(dǎo)λ-Red重組蛋白充分表達(dá)；
[0097] 將試管置于冰上5min;
[0098] 取ImL菌液移入1.5血預(yù)冷離屯、管中，4°C下W1300化/min離屯、30s，棄去上清液，加 入預(yù)冷的無菌水1ml重懸洗涂，棄去上清液，并用預(yù)冷的無菌水1ml重懸洗涂2次；
[0099] 去除上清液，并用10化L預(yù)冷無菌水重懸菌體，加入單鏈DNA突變庫和抗性回復(fù)寡 核巧酸；
[0100] 將上述混合物轉(zhuǎn)移到2mm電轉(zhuǎn)杯中，在電容25μρ，電壓2.化V，電阻200 Ω條件下進(jìn) 行電擊；
[0101] 迅速將準(zhǔn)備好的1ml S0C培養(yǎng)基加入到電擊杯中，輕輕吹打使細(xì)胞懸浮。將電擊杯 中的混合液轉(zhuǎn)移到裝有1ml培養(yǎng)基的試管中，放入3(TC搖床培養(yǎng)，使細(xì)胞復(fù)蘇；
[0102] 當(dāng)細(xì)胞復(fù)蘇到0D達(dá)到0.7左右時(shí)，重復(fù)上述步驟，進(jìn)行第二輪轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化過程一 共進(jìn)行10-15輪；
[0103] 最后一輪電轉(zhuǎn)后，復(fù)蘇12h。在平板上篩選紅色較紅的菌落。野生型化cLYC)及含多 個(gè)基因突變的大腸桿菌菌株巧cLYC-l，EcLYC-2，EcLYC-3，EcLYC-4，EcLYC-5)產(chǎn)番茄紅素能 力對比如圖7所示。
[0104] 從圖中可W看出，各株含有DXS突變體的大腸桿菌菌株的番茄紅素積累量相對于 野生型菌株都得到了提高，其中EcLYC-5是原來的1.5倍W上。
[0105] 實(shí)施例5基因組多位點(diǎn)進(jìn)化大腸桿菌番茄紅素代謝相關(guān)基因
[0106] 引入外源基因 crtE，沈tB，crtI的大腸桿菌EcNR2能夠合成番茄紅素化cLYC)，其積 累量受到多方面的影響：1、大腸桿菌中番茄紅素的積累依賴前體物質(zhì)IPP的積累，其通過異 戊二締途徑合成。過量表達(dá)該途徑上的多個(gè)基因（dxs，dx;r，ispD，ispE，ispG，ispH，idi， ispA)都會(huì)提高前體物質(zhì)IPP的積累；2、鳥槍法研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)功能未明確的基因也會(huì)影響番 茄紅素的積累（日卵￥，巧〇5，。1'1，6化4,6化8,7扣0，口11吐[，11114,7邑邑1'，7。拉，7111邑4，日1'110;3、敲 除異戊二締的一些旁路代謝途徑基因（ytjC，f化F，aceE，gdhA)可W提高番茄紅素的產(chǎn)量； 4、大腸桿菌體內(nèi)的能量供應(yīng)也會(huì)影響番茄紅素的積累（sucAB，talB，S化ABCD)。
[0107] 對從上述基因中挑選的二十個(gè)基因（dxs，dx;r，idi，ispA，appY，rpoS，c;rl，e化A， e 化8，;^'10，口11吐[，1']114,7邑邑1'，311。4,311。6，1日113,3化4,3化13,3化〔，3化0)在基因組上進(jìn)行原 位進(jìn)化，并同時(shí)用合成的含兩個(gè)無義突變的寡核巧酸對四個(gè)基因（ytjC，;MhF，aceE，g^A) 進(jìn)行沉默。
[0108] 采用兩步PCR和易錯(cuò)PCR獲得上述基因同源帶突變的單鏈核巧酸，Wdxs基因?yàn)槔?說明體外制備帶突變的5'端4個(gè)堿基硫代修飾的dxs基因長單鏈的過程。
[0109] 用5'端4個(gè)堿基硫代修飾的上引物扣3寸〇^569 10^.16)和5'端憐酸化的下引 物dxs-rev(SEQ ID ^.17)兩個(gè)引物^扯3基因?yàn)槟０澹谔砑影?+的條件下，941：453,541： 50s，72 °C 2min循環(huán)30次做易錯(cuò)PCR，割膠純化回收得到的雙鏈；
[0110] W上述易錯(cuò)雙鏈為模板，在PCR體系中只添加 5'端4個(gè)堿基硫代修飾的上引物dxs- for(沈Q ID 備.10)，941：3〇3,531：3〇3,721：4111111循環(huán)15次，制備得到扯3單鏈；
[0111] 用Lambda EX0外切酶處理上述得到的PCR產(chǎn)物，把其中的dxs雙鏈酶切成單鏈； [0112]乙醇沉淀得到帶突變的5'端4個(gè)堿基硫代修飾的dxs單鏈。
[0113] 重復(fù)上述方法，獲得dxs，dx;r，idi，ispA，a卵Y，;rpoS，c;rl，e化A，e化B，y jiD，pu;rH， rnlA，yggT，sucA，sucB，talB，s化A，s化B，s化C和s化D帶突變的5 '端4個(gè)堿基硫代修飾的單 鏈。
[0114] 運(yùn)些單鏈混合在一起成為一個(gè)單鏈DNA突變庫。
[0115] 把上述單鏈核巧酸庫與合成的帶無義突變的寡核巧酸混合在一起，用于對基因的 重組。
[0116] 在50mL LB培養(yǎng)基的搖瓶中接入從平板上挑取的大腸桿菌EcLYC單菌落，并加入25 yL卡那霉素 ，30 °C下?lián)u床過夜培養(yǎng)；
[0117] 轉(zhuǎn)接1%的菌液至2mL LB培養(yǎng)基的試管中，置于30°C下?lián)u床培養(yǎng)2.5-化至0D達(dá)到 0.7左右；
[011引將試管置于42°C水浴中振蕩培養(yǎng)15min，誘導(dǎo)λ-Red重組蛋白充分表達(dá)；
[0119] 將試管置于冰上5min;
[0120] 取ImL菌液移入1.5血預(yù)冷離屯、管中，4°C下W1300化/min離屯、30s，棄去上清液，加 入預(yù)冷的無菌水1ml重懸洗涂，棄去上清液，并用預(yù)冷的無菌水1ml重懸洗涂2次；
[0121] 去除上清液，并用10化L預(yù)冷無菌水重懸菌體，加入單鏈NDA突變庫和抗性回復(fù)寡 核巧酸；
[0122] 將上述混合物轉(zhuǎn)移到2mm電轉(zhuǎn)杯中，在電容25μΡ，電壓2.化V，電阻200 Ω條件下進(jìn) 行電擊；
[0123] 迅速將準(zhǔn)備好的1ml S0C培養(yǎng)基加入到電擊杯中，輕輕吹打使細(xì)胞懸浮。將電擊杯 中的混合液轉(zhuǎn)移到裝有1ml培養(yǎng)基的試管中，放入3(TC搖床培養(yǎng)，使細(xì)胞復(fù)蘇；
[0124] 當(dāng)細(xì)胞復(fù)蘇到0D達(dá)到0.7左右時(shí)，重復(fù)上述步驟，進(jìn)行第二輪轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化過程一 共進(jìn)行10-15輪；
[0125] 最后一輪電轉(zhuǎn)后，復(fù)蘇12h。在平板上篩選紅色較紅的菌落。野生型化cLYC)及含多 個(gè)基因突變的大腸桿菌菌株巧CLYC20，EcLYC45，EcLYC60，EcLYC139，EcLYC246)產(chǎn)番茄紅素 能力對比如圖8所示（其中EcLYC246已申請專利菌種保存，菌種保藏號為CCTCC Μ 2015692)ο
[0126] 從圖中可W看出，各株含有DXS突變體的大腸桿菌菌株的番茄紅素積累量相對于 野生型菌株都得到了提高。其中，ECLYC246已申請專利菌種保存，菌種保藏號為CCTCC Μ 2015692,此株大腸桿菌中產(chǎn)番茄紅素相關(guān)基因經(jīng)過突變使其番茄紅素的積累量是野生型 大腸桿菌菌株的4倍W上。
[0127] 文中序列
[0128] SEQ ID N0.1 熱穩(wěn)定性飽和突變寡核巧酸
[01 巧]5，-*T*C*A*CACCTATATGGGTAAAGTACTACGCTTAAATCTTGATGGANNNATTCCAAAGGATAATC CAAGTTTTAACGGGGTGGTTAGCCATA-3 '（ *為硫代修飾，下同）
[0130] SEQ ID NO.2 催化特異性飽和突變寡核巧酸
[0131] 5'-
[0132] TCCAGATGGGAATGTCTTATATGTATTAACTGATACTGCCGGANNNGTCCAAAAAGATGATGGCTCAGTAACAAATA CATTAGAAAACC-3，
[0133] SEQ ID NO.3 氯霉素抗性基因的90nt寡核巧酸
[0134] 5 '-*G*C*A*TCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGT-3 '
[0135] 沈Q ID NO.4 5'端4個(gè)堿基硫代修飾的上引物dxs-1-for
[0136] 5 '-*G*A*G*TTTTGATATTGCCAAATACCCGACCCTGGC-3 '
[0137] 沈Q ID NO.5 5'端4個(gè)堿基硫代修飾的上引物dxs-2-for
[0138] 5 '-*T*T*G*CCGAGCTATTCAAAAATCTTTGGCGAC-3 '
[0139] 沈Q ID NO.6 5'端4個(gè)堿基硫代修飾的上引物dxs-3-for
[0140] 5，-*G*G*C*AAAGGCATTGTGAAGCGTCGTG-3 '
[0141] 沈Q ID NO.7 下引物cks-1-rev
[0142] 5 '-GGTCATGATATGCAGGAACTGCGGG-3 '
[0143] 沈Q ID NO.8 下引物dxs-2-rev
[0144] 日 '-CAGTTCCACGCCGACCGCGTTGCCACGCGGGTA-3 '
[0145] 沈Q ID NO.9 下引物dxs-3-rev
[0146] 5 '-TATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTGGC-3 '
[0147] 沈Q ID NO.IO DXSa氨基酸序列 [014 引

[0157] 沈Q ID N0.15 DXSe氨基酸序列 「01581
[0159] 沈Q ID NO. 16 5'端4個(gè)堿基硫代修飾的上引物dxs-for
[0160] 5 '-*G*A*G*TTTTGATATTGCCAAATACCCGACCCTGGC-3 '
[0161] 沈Q ID NO. 17 5'端憐酸化的下引物dxs-rev
[0162] 5' -TTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTG-3'（5' 端憐酸化）
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)化蛋白質(zhì)的新方法，其特征在于所述方法包括構(gòu)建包 含一個(gè)或多個(gè)突變位點(diǎn)的核酸庫，包括體外合成的寡核苷酸單鏈庫或制備的單鏈DNA庫或 雙鏈DNA庫，通過λ-Red同源重組技術(shù)，利用所述核酸庫對大腸桿菌胞內(nèi)載體上或基因組上 的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行原位重組，以較高的突變率達(dá)到進(jìn)化酶分子結(jié)構(gòu)提高酶催化效 率的目的。2. 如權(quán)利要求1所述的一種在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)化蛋白質(zhì)的新方法，其特征在于 所述方法對大腸桿菌基因組上多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行重組突變，應(yīng)用于代謝途徑中多個(gè)關(guān)鍵酶 的進(jìn)化，從而達(dá)到優(yōu)化代謝途徑提高目標(biāo)產(chǎn)物合成產(chǎn)率的目的。3. 如權(quán)利要求1所述的一種在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)化蛋白質(zhì)的新方法，其特征在于 所述方法通過大腸桿菌胞內(nèi)目標(biāo)基因關(guān)鍵氨基酸的原位飽和突變，提高吡咯喹啉依賴型葡 萄糖脫氫酶的熱穩(wěn)定性和催化特異性。4. 如權(quán)利要求1所述的一種在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)化蛋白質(zhì)的新方法，其特征在于 所述方法應(yīng)用于體內(nèi)原位重組突變番茄紅素合成關(guān)鍵酶1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 基因，提尚其表達(dá)蛋白的可溶性水平和催化效率。5. 如權(quán)利要求1所述的一種在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)化蛋白質(zhì)的新方法，其特征在于 所述方法同時(shí)突變多個(gè)番茄紅素關(guān)鍵酶基因從而提高大腸桿菌合成番茄紅素的生產(chǎn)水平。6. 大腸桿菌菌株EcLYCb，保存編號為CCTCC Μ 2015691。7. 大腸桿菌菌株EcLYC246,保存編號為CCTCC Μ 2015692。
【文檔編號】C12R1/19GK106011162SQ201610053310
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年1月27日
【發(fā)明人】徐志南, 濮悅, 黃磊, 杭寶建, 董昌, 蔡瑾
【申請人】浙江大學(xué)