雄性不育基因OsDPW2的應(yīng)用及水稻育性恢復(fù)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雄性不育基因OsDPW2的應(yīng)用及水稻育性恢復(fù)的方法；采用常規(guī)基因工程方法或基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，敲除、改變或抑制OsDPW2基因，在粳稻背景野生型水稻中使得OsDPW2基因表達(dá)水降低，進(jìn)而獲得水稻雄性不育系。本發(fā)明還涉及一種水稻育性恢復(fù)的方法，通過(guò)引物擴(kuò)增OsDPW2基因，使用遺傳轉(zhuǎn)化的手段轉(zhuǎn)化突變體植株，能夠使突變體恢復(fù)到野生型表型。本發(fā)明制備的水稻雄性不育株系在水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期無(wú)異常表型出現(xiàn)，但在生殖生長(zhǎng)時(shí)期的花藥發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)異常。如果應(yīng)用于雜交育種中，可以免除母本去雄的工作，大大提高生產(chǎn)效率，降低人工成本，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】
雄性不育基因0sDPW2的應(yīng)用及水稻育性恢復(fù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及的是一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的水稻株系創(chuàng)制的方法，具體設(shè)及一種雄 性不育基因 0SDPW2的應(yīng)用及水稻育性恢復(fù)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是全世界重要的糧食作物，世界上約有50%的人口 W水稻為主食，大米也是 加工許多食品的原材料。由于水稻的基因組較小，且水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)非常成熟，可W作為單子 葉研究的模式植物，人們對(duì)水稻生殖發(fā)育機(jī)制還有待了解。水稻雄性不育系的發(fā)現(xiàn)及其利 用開創(chuàng)了水稻雜交育種的新時(shí)代，對(duì)提高水稻產(chǎn)量發(fā)揮了巨大作用。由于目前水稻雜交過(guò) 程中使用的不育系存在育性不穩(wěn)定、細(xì)胞質(zhì)負(fù)效應(yīng)等缺點(diǎn)，因此深入開展水稻雄性不育調(diào) 控機(jī)制的研究，對(duì)獲得新型水稻不育系，提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量等具有重要意義。同時(shí)對(duì)掲示植物生 殖發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理等方面也具有重要的理論意義。
[0003] 雄性不育系：是指一種雄性退化（主要是花粉退化)但雌蕊正常的母水稻，由于花 粉無(wú)力生活，不能自花授粉結(jié)實(shí)，只有依靠外來(lái)花粉才能受精結(jié)實(shí)，因此借助運(yùn)種母水稻作 為遺傳工具，通過(guò)人工輔助授粉的方法，就能產(chǎn)生大量雜交種子。從育種戰(zhàn)略上看，雜交水 稻的發(fā)展可W分為Ξ系法、兩系法和一系法Ξ個(gè)發(fā)展階段。每進(jìn)入一個(gè)新階段，都是育種上 的一次突破，從而會(huì)把水稻的產(chǎn)量提高到一個(gè)新臺(tái)階?，F(xiàn)在生產(chǎn)上用的雜交水稻屬于Ξ系 法品種間雜交優(yōu)勢(shì)利用的范疇，運(yùn)種Ξ系雜交稻一般要比常規(guī)水稻增產(chǎn)20%左右，當(dāng)前仍 處于方興未艾時(shí)期。但是，Ξ系法雜交水稻種子優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)復(fù)雜，受恢復(fù)系和保持系關(guān)系限 審IJ，使優(yōu)良組合的篩選比較困難。因此，科學(xué)家一直在篩選和培育新的不育系，W期擴(kuò)展細(xì) 胞質(zhì)背景，為遠(yuǎn)緣雜交和雜種優(yōu)勢(shì)的利用奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種雄性不育基因 0SDPW2的應(yīng)用及水 稻育性恢復(fù)（即，恢復(fù)水稻雄性不育）的方法。本發(fā)明利用0SDPW2基因及其蛋白參與調(diào)控水 稻雄性生殖的特點(diǎn)，及其利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)控制水稻雄性生殖發(fā)育，通過(guò)突變?cè)摰鞍仔蛄谢?抑制該蛋白的表達(dá)產(chǎn)生新的水稻雄性不育株系，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 第一方面，本發(fā)明設(shè)及一種雄性不育基因 0SDPW2的應(yīng)用，所述的雄性不育基因 0SDPW2編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的應(yīng)用是：采用常規(guī)方法或基于 CRISPR/化s9系統(tǒng)，敲除、改變或抑制0sDPW2基因，使得常規(guī)水稻品種中的0sDPW2基因表達(dá) 水平降低，進(jìn)而獲得水稻雄性不育株系。
[0007] 第二方面，本發(fā)明還設(shè)及一種水稻不育株系創(chuàng)制的方法，包括如下步驟:選擇常規(guī) 水稻品種，處理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述處理為，采用常規(guī)方法或基于 CRISPR/化s9系統(tǒng)，使得水稻中編碼如SEQ ID No. 1所示氨基酸的核巧酸序列發(fā)生缺失，變 異或抑制，進(jìn)而使得所述氨基酸序列對(duì)應(yīng)多膚的表達(dá)水平降低或活性喪失。
[000引優(yōu)選地，所述水稻品種為梗稻品種9522。
[0009] 優(yōu)選地，所述核巧酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0010] 優(yōu)選地，所述水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法包括如下步驟:采用物理誘變的方法， 使常規(guī)水稻品種中如SEQ ID No.2所示核巧酸序列突變?yōu)镾EQ ID No.9,進(jìn)而獲得所述水稻 雄性不育株系，即〇sdpw2突變體。
[0011] 優(yōu)選地，所述水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法包括如下步驟:采用物理誘變的方法， 使常規(guī)水稻品種中如SEQ ID No.1所示氨基酸序列突變?yōu)镾EQ ID No.10,進(jìn)而獲得所述水 稻雄性不育株系，即osdpw2突變體。
[0012] 優(yōu)選地，所述基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)具體包括:采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)敲除的 方法，敲除0SDPW2基因，抑制編碼如SEQ ID No. 1所示氨基酸序列的核巧酸序列的表達(dá)。
[0013] 更優(yōu)選地，所述CRISPR/tas9系統(tǒng)定點(diǎn)敲除的方法包括如下步驟：
[0014] a)合成單核巧酸序列引物如沈Q ID No.3和沈Q ID No.4所示；
[0015] 0sDPW2CRISPRUP(SEQ ID No.3)：TGTGTGGCGGCGCCGGCGACGCACTG
[0016] 0sDPW2CRISP畑0WN(SEQ ID No.4):AAACCAGTGCGTCGCCGGCGCCGCCA
[0017] b)通過(guò)退火反應(yīng)使合成的單核巧酸序列形成二聚體結(jié)構(gòu)，與載體片段(載體來(lái)自 百格公司，貨號(hào)861(〇3)進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建含有水稻〇3〇?胖2基因祀序列（如560 1〇齡.5所 示）的0SDPW2-BGK03質(zhì)粒；
[001引C)用含0SDPW2-BGK03質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌侵染水稻品種；
[0019] d)通過(guò)利用如沈Q ID No.l巧日沈Q ID齡.12所示的〇3〇?胖2基因的特異性引物，擴(kuò) 增基因組片段進(jìn)行測(cè)序，篩選突變植株。
[0020] Identify-F(SEQ ID No.11)：GTGGAGCTTGGAGTGAAGCGA [00別]Identify-R(SEQ ID No.l2):GGGGTCGGGGCGGGTGATGTC
[0022] 所述水稻0sDPW2基因祀序列如下所示：
[0023] 沈Q ID No.5:GCGGCGCCGGCGACGCACTG
[0024] 第Ξ方面，本發(fā)明還設(shè)及一種所述水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法獲得的水稻雄性 不育株系在水稻制種中的用途，所述用途包括：W所述水稻雄性不育株系作為母本，進(jìn)行雜 交育種。
[0025] 第四方面，本發(fā)明還設(shè)及一種恢復(fù)水稻雄性不育株系的雄性不育性狀的方法，包 括如下步驟:采用常規(guī)遺傳手段將所述0SDPW2基因，轉(zhuǎn)入如前述所述應(yīng)用獲得的水稻雄性 不育株系，進(jìn)而使得突變體恢復(fù)野生型表型。
[0026] 優(yōu)選地，所述方法包括如下步驟：將含0SDPW2互補(bǔ)構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens化ΗΑ105轉(zhuǎn)入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中 〇3〇口￥2互補(bǔ)構(gòu)建含有編碼如5日〇10^.6所示的核巧酸序列。
[0027] 更優(yōu)選地，所述方法具體包括如下步驟：
[0028] (a)從野生型9522幼苗葉片中提取基因組DNA作為模板，用堿基序列如SEQ ID 齡.7和569 10齡.8所示的引物擴(kuò)增出〇3〇口胖2基因的如沈9 10^.6所示的59976口的基因 組序列片段；
[0029] (b)提供攜帶表達(dá)0sDPW2互補(bǔ)構(gòu)建載體的根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105；
[0030] (c)將水稻雄性不育株系的細(xì)胞或組織或器官與步驟(b)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使 編碼如SEQ ID NO. 1所示氨基酸的核巧酸轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞，并且整合到水稻細(xì)胞的染色體上；
[0031] (d)選擇轉(zhuǎn)入所述核巧酸的水稻細(xì)胞或組織，再生，獲得恢復(fù)育性的水稻植株。
[0032] 優(yōu)選地，編碼如SEQ ID NO. 1所示氨基酸的核巧酸如SEQ ID No.2所示。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0034] 1、本發(fā)明通過(guò)控制水稻花粉乙酷轉(zhuǎn)移酶0SDPW2基因及其編碼蛋白獲得水稻雄性 生殖發(fā)育的變異株，實(shí)現(xiàn)控制水稻生殖過(guò)程；
[0035] 2、本發(fā)明制備的水稻雄性不育株系在水稻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期無(wú)異常表型出現(xiàn)，與來(lái)源 親本無(wú)明顯差異，但在生殖生長(zhǎng)時(shí)期的花藥發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)異常，花粉敗育，得到完全不育 的植株，如果應(yīng)用于雜交育種中，可W免除母本去雄的工作，大大提高生產(chǎn)效率，降低人工 成本，在雜交水稻構(gòu)建和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0036] 通過(guò)閱讀參照W下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0037] 圖1為OS化w2突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察示意圖；其中，圖1A為野生型9522和OS化w2 突變體整株表型；圖1B為野生型9522和os化w2突變體穗形；圖1C為野生型9522和os化w2突 變體小穗；圖1D為野生型9522和OS化w2突變體小花內(nèi)部結(jié)構(gòu)；圖化為野生型9522和OS化w2 突變體雄蕊；圖IF為野生型9522成熟花粉I2/KI染色結(jié)果；圖1G為osdpw2突變體I2/KI染色結(jié) 果；
[003引圖2為0sDPW2表達(dá)模式示意圖；其中，圖2A為半定量RT-PCR法確定0sDPW2基因的表 達(dá)模式示意圖；圖2B為巧光定量PCR確定0SDPW2基因的表達(dá)模式示意圖；圖2C為GUS染色分 析結(jié)果示意圖；圖2D為染色的StagelO花藥半薄切片示意圖；
[0039] 圖3為互補(bǔ)OS化w2突變體得到野生型表型示意圖；其中，圖3A為野生型9522小花內(nèi) 部結(jié)構(gòu)圖；圖3B為野生型成熟花粉I2/KI染色結(jié)果；圖3C為野生型9522恢復(fù)育性時(shí)小穗種子 圖；圖3D為互補(bǔ)OS化w2突變體后代的小花內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖；圖3E為互補(bǔ)OS化w2突變體后代的成 熟花粉I2/KI染色結(jié)果；圖3F為互補(bǔ)osdpw2突變體后代恢復(fù)育性時(shí)小穗種子圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。W下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不W任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干變形和改進(jìn)。運(yùn)些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0041 ]下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring 化rbor Laboratory Press, 1989)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0042] 所述0sDPW2基因?yàn)榫幋a如SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核巧酸序列SEQ ID NO.2。
[00創(chuàng)實(shí)施例1、水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法
[0044] 1.1通過(guò)常規(guī)育種手段創(chuàng)制os化w2水稻雄性不育株系
[0045] 本實(shí)施例的OS化w2突變材料是由常規(guī)梗稻品種武育梗7號(hào)(又名9522)經(jīng)過(guò)常規(guī)的 基因工程方法突變而得。
[0046] 本領(lǐng)域人員知曉，還可W采用諸如射線照射等其他手段誘變水稻常規(guī)品種進(jìn)行突 變，具體包括經(jīng)過(guò)^Co 丫射線誘變獲得OS化w2突變體，處理劑量為280Gy (參照方法:陳亮，儲(chǔ) 黃偉，袁政，et al. 60CO 丫 -Ray射線誘變水稻突變體的分離和遺傳學(xué)初步分析[J].廈口大 學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006,（S1) :82-85)。對(duì)誘變的突變體回交Ξ代，獲得隱性核單基因控 制的穩(wěn)定遺傳的OS化w2突變體。將OS化w2突變體與9522回交，所有F1代的表型都與9522- 致，表現(xiàn)為可育。突變體與野生型雜交的F1代自交后產(chǎn)生的F2代群體中，可育與不育植株的 分離比約為3:1，表明運(yùn)是一個(gè)由隱性單基因突變導(dǎo)致的突變體不育的表型。
[0047] 1.2水稻育性控制蛋白基因 0sDPW2的克隆
[004引利用發(fā)明人構(gòu)建的包含育性控制蛋白基因0sDPW2(其核巧酸序列如SEQ ID No.2 所示)及其突變基因 os化w2(其核巧酸序列如SEQ ID No.9所示)組成的、本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員 清楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或position cloning)群體，按分子標(biāo)記定 位于1個(gè)小的基因組片段內(nèi)，例如100肺內(nèi)。在此基礎(chǔ)上，用常規(guī)方法分離包含該片段的基因 組DNA克隆。經(jīng)測(cè)序和進(jìn)一步的雜交鑒定確定其中一個(gè)含完整水稻雄性生殖發(fā)育控制蛋白 0sDPW20
[0049] 經(jīng)全核巧酸序列分析結(jié)果表明：水稻雄性育性0sDPW2基因全長(zhǎng)為2129bp(SEQ ID NO. 13,包含調(diào)控區(qū)和內(nèi)含子）。經(jīng)軟件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID NO. 2所示，編碼全 長(zhǎng)為447個(gè)氨基酸的水稻雄性生殖發(fā)育控制蛋白，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0050] 1.3水稻育性控制蛋白基因0sDPW2的點(diǎn)突變
[0051 ]本實(shí)施例的0sdpw2突變材料是由常規(guī)梗稻品種武育梗7號(hào)（又名9522)經(jīng)過(guò)對(duì) 0sDPW2基因的序列變異獲得，經(jīng)過(guò)對(duì)0sDPW2突變基因 OS化w2的序列比較，水稻雄性生殖發(fā) 育控制蛋白的移碼和提前終止會(huì)使得水稻雄性生殖器官不能正常發(fā)育，造成植株不育;本 實(shí)施例0SDPW2突變基因是在編碼區(qū)的1個(gè)堿基對(duì)缺失(其序列如SEQ ID NO.9所示）引起水 稻雄性生殖發(fā)育控制蛋白翻譯得提前終止和功能喪失。
[0052] 1.4通過(guò)CRISPR手段降低水稻品種中的0sDPW2的表達(dá)水平
[0化3] 為了對(duì)0sDPW2蛋白進(jìn)行應(yīng)用，構(gòu)建了0sDPW2基因 CRISPR的載體(載體來(lái)自百格公 司，貨號(hào)BGK03)，并轉(zhuǎn)化野生型9522植株，W降低0SDPW2的表達(dá)，從而達(dá)到改變水稻育性的 目的。
[0054] 合成單核巧酸序列引物
[0055] 0sDPW2CRISPRUP(SEQ ID No.3)：TGTGTGGCGGCGCCGGCGACGCACTG
[0056] 0sDPW2CRISP畑0WN(SEQ ID No.4):AAACCAGTGCGTCGCCGGCGCCGCCA
[0057] 通過(guò)退火反應(yīng)使合成的單核巧酸序列形成二聚體結(jié)構(gòu)，與載體片段(載體來(lái)自百 格公司，貨號(hào)BGK03)進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建含有水稻0sDPW2基因祀序列0SDPW2-BGK03質(zhì)粒； [0化引將含有0SDPW2-BGK03構(gòu)建的農(nóng)桿菌在含有Kan(50ygAU)的Y邸平板上劃線，獲的 單菌落。挑單菌落接種到3ml含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中于28Γ振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，第2天按 1 %接種量轉(zhuǎn)接入50ml含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，20化pm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至0D6日日為0.4至 0.6左右時(shí)，將新鮮的農(nóng)桿菌菌液于5000巧m、離屯、5分鐘，收集并重懸于]V3體積的AAM液體 培養(yǎng)基中，此時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化水稻各種受體材料。
[0059] 本實(shí)施例采用常規(guī)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化水稻9522的幼胚愈傷。取授粉后12-15 天的9522未成熟種子經(jīng)70%乙醇浸泡1分鐘后，于次氯酸鋼溶液中（與水1:3混合，加2-3滴 吐溫20)消毒90分鐘W上，用無(wú)菌水沖洗4-5次，然后用解剖刀和綴子挑出幼胚并轉(zhuǎn)入到 N6D2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，在26± rC、避光條件下培育，4天后可用于轉(zhuǎn)化。將幼胚愈傷 浸泡入新鮮的AAM農(nóng)桿菌菌液中并不時(shí)搖動(dòng)，20分鐘后將水稻材料移出，在無(wú)菌濾紙上吸去 過(guò)多的菌液，隨即轉(zhuǎn)移到N6D2C培養(yǎng)基上，于26Γ共培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)時(shí)，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中 加入乙酷下香酬，使用濃度為1〇〇μΜ"3天后，從共培養(yǎng)培養(yǎng)基上取出愈傷組織，切去胚芽并 轉(zhuǎn)入含有25mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)。7-12天后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)到含有 50mg/L Hyg的選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選。10-12天后生長(zhǎng)旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到預(yù)分化 培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周左右，再移至分化培養(yǎng)基上分化（12小時(shí)光照/天）。再生的小苗在1/ 2MS〇H培養(yǎng)基上生根壯苗，隨后移入人工氣候室營(yíng)養(yǎng)液栽培。
[0060] 陽(yáng)性植株提取葉片總DNA，經(jīng)PCR進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)化植株。測(cè)序檢測(cè)祀位點(diǎn)基因序列， 如果發(fā)生純合突變則為有效的基因敲除植株。
[0061] 1.50SDPW2蛋白活性喪失或表達(dá)水平降低導(dǎo)致水稻雄性發(fā)育異常
[0062] 對(duì)osdpw2突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察。如圖1，野生型和突變型OS化w2的表型在營(yíng)養(yǎng) 生長(zhǎng)時(shí)期沒(méi)有明顯差別，在營(yíng)養(yǎng)生殖生長(zhǎng)時(shí)期，野生型和突變型OS化w2的穗形、穗粒數(shù)均沒(méi) 有明顯差異，但是對(duì)比顯示野生型9522花藥發(fā)育正常，而OS化w2突變型花藥變白變小(D， E);野生型9522艦染正常(F)，突變型OS化w2花藥艦染不上成熟的花粉粒(G)。
[0063] 1.60SDPW2 表達(dá)特征
[0064] 利用OS化w2突變株的來(lái)源親本9522各個(gè)器官組織，提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 第一鏈，利用半定量RT-PCR(圖2A)和巧光定量PCR的方法確定0sDPW2基因的表達(dá)模式（圖 2B)，發(fā)現(xiàn)0SDPW2基因在水稻中是廣泛表達(dá)的，在根、莖、葉和不同發(fā)育時(shí)期的花藥中都有表 達(dá)。在水稻雄性生殖發(fā)育時(shí)期花藥的Stage?至Stagell顯著表達(dá)。用0SDPW2基因自身啟動(dòng)子 融合GUS報(bào)告基因，轉(zhuǎn)化野生型，染色T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，GUS染色分析顯示其在花藥的 51曰旨日7至51日旨日11表達(dá)（圖2〇，對(duì)染色的51日旨日10花藥半薄切片顯示其在花藥的絨拉層和小 抱子中高表達(dá)(圖2D)。
[0065] 1.70SDPW2基因在創(chuàng)制其他水稻品系雄性不育株系中的應(yīng)用
[0066] 將osdpw2突變體與釉稻品種9311、龍?zhí)馗驈V陸矮4號(hào)水稻品系雜交，在F2代中具 有釉型特征的植株中均出現(xiàn)了雄性不育株系，符合3:1分離規(guī)律，進(jìn)而證明0SDPW2基因在其 他水稻品種中發(fā)生核巧酸序列變化時(shí)，同樣可W產(chǎn)生雄性不育植株。
[0067] 實(shí)施例2、os化w2突變體在水稻制種中的用途
[0068] 將OS化w2突變體作為父本與Ξ系或兩系雜交組合中的不育親本雜交，得到F1代。 在F2代中篩選同時(shí)具有雄性不育及不育特征的植株，將該植株與原不育親本對(duì)應(yīng)的保持系 雜交。再次在F2代中篩選同時(shí)具有雄性不育及不育特征的植株與保持系雜交，經(jīng)多代雜交 篩選后獲得新的雄性不育系，適宜作為雜交組合中的母本。
[00~]實(shí)施例3、恢復(fù)OS化w2突變體雄性不育性狀的方法
[0070]將編碼0SDPW2基因的基因組核巧酸序列轉(zhuǎn)入突變體OS化w2突變體植株，能夠使突 變體恢復(fù)到野生型表型。
[0071] 從野生型9522幼苗葉片中提取基因組DM作為模板，用引物：
[0072] 70025曲NAF(其序列如沈Q ID NO.7所示）：
[0073] CCATGATTACGAATTCTATTGCCTGTTTGTGGCTGGAC，
[0074] 70025gDNAR (其序列如 SEQ ID N0.8所示）： ATTCGAGCTGGTCACCGCCGCTTACACGTTACTGTATTGG
[0075] 擴(kuò)增出0sDPW2基因的如沈Q ID ^.6所示的59976口的基因組序列片段；
[0076] 將該片段通過(guò)大連寶生物公司的In-Fusion轉(zhuǎn)化體系將擴(kuò)增的DNA片段插入到用 于轉(zhuǎn)化水稻的雙元載體DCAMBIA1301載體中；測(cè)序驗(yàn)證正確，該載體通過(guò)電擊導(dǎo)入根癌農(nóng)桿 菌（Agrobacterium tumefaciens 化HA105得到0sDPW2互補(bǔ)根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens化HA105,使用遺傳轉(zhuǎn)化手段轉(zhuǎn)化突變體osdpw2突變體營(yíng)養(yǎng)生殖生長(zhǎng)期的幼穗 愈傷，從而使編碼如SEQ ID NO. 1所示氨基酸的核巧酸轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞，并且整合到水稻細(xì)胞 的染色體上;再生，獲得水稻植株;W觀察是否會(huì)使突變體恢復(fù)到野生型表型。
[0077] To代獲得互補(bǔ)植株，圖3顯示To代互補(bǔ)植株可W產(chǎn)生花粉，并被I2/KI染色，即表現(xiàn) 出的野生型表型。
[0078] 綜上所述，本發(fā)明通過(guò)控制水稻BA皿家族HXXXD類型的乙酷轉(zhuǎn)移酶0sDPW2基因及 其編碼蛋白獲得水稻雄性生殖發(fā)育異常的變異株，實(shí)現(xiàn)控制水稻雄性生殖發(fā)育和育性;本 發(fā)明獲得的水稻突變體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期與來(lái)源親本無(wú)明顯差異，進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段后，雄 性生殖器官發(fā)育異常、花粉敗育引起植株不育，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用。
[0079] W上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述 特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，運(yùn)并不影 響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雄性不育基因 OsDPW2的應(yīng)用，其特征在于，所述的雄性不育基因 OsDPW2編碼的 氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的應(yīng)用是：采用常規(guī)基因工程方法或基于CRISPR/ Cas9系統(tǒng)，敲除、改變或抑制0sDPW2基因，在粳稻背景野生型水稻中使得0sDPW2基因表達(dá)水 平降低，進(jìn)而獲得水稻雄性不育株系。2. -種水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征在于，包括如下步驟:選擇常規(guī)水稻品 種，處理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述處理為，采用常規(guī)基因工程方法或基于 CRISPR/Cas9系統(tǒng)，使得水稻中編碼SEQ ID N0.1所示氨基酸的核苷酸序列發(fā)生缺失，變異 或抑制，進(jìn)而使得所述氨基酸序列對(duì)應(yīng)多肽的表達(dá)水平降低或者活性喪失。3. 如權(quán)利要求2所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征是，所述水稻品種為粳稻 品種9522。4. 如權(quán)利要求2所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征是，所述核苷酸序列如 SEQIDN0.2**。5. 如權(quán)利要求2所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征在于，所述基于CRISPR/ Cas9系統(tǒng)具體包括:采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)敲除0sDPW2基因，抑制編碼如SEQ ID No. 1 所示氨基酸序列的核苷酸序列的表達(dá)。6. 如權(quán)利要求5所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9 系統(tǒng)定點(diǎn)敲除的方法包括如下步驟： a) 合成單核苷酸序列引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示； b) 通過(guò)退火反應(yīng)使合成的單核苷酸序列形成二聚體結(jié)構(gòu)，與載體片段進(jìn)行連接反應(yīng)， 構(gòu)建含有水稻0sDPW2基因靶序列的0sDPW2-BGK03質(zhì)粒;所述靶序列如SEQ ID No. 5所示； c) 用含0sDPW2-BGK03質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌侵染水稻品種； d) 通過(guò)利用如SEQIDNo.ll和SEQIDNo.l2所示的0sDPW2基因的特異性引物擴(kuò)增基 因組片段進(jìn)行測(cè)序，篩選突變植株。7. -種如權(quán)利要求2所述的水稻雄性不育株系創(chuàng)制的方法獲得的水稻雄性不育株系在 水稻制種中的用途，其特征在于，所述用途包括：以所述水稻雄性不育株系作為母本，進(jìn)行 雜交育種。8. -種恢復(fù)水稻雄性不育株系的雄性不育性狀的方法，其特征在于，包括如下步驟:采 用常規(guī)遺傳手段將所述0sDPW2基因，轉(zhuǎn)入如權(quán)利要求2所述方法獲得的水稻雄性不育株系， 進(jìn)而使得突變體恢復(fù)野生型表型。9. 如權(quán)利要求8所述的恢復(fù)水稻雄性不育株系的雄性不育性狀的方法，其特征在于，包 括如下步驟:將含0sDPW2互補(bǔ)構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens )EHA105轉(zhuǎn) 入所述水稻雄性不育株系，培育，即得;其中0sDPW2互補(bǔ)構(gòu)建含有編碼如SEQ ID NO.6所示 的核苷酸序列。10. 如權(quán)利要求9所述的恢復(fù)水稻雄性不育株系的雄性不育性狀的方法，其特征在于， 所述方法具體包括如下步驟： (a) 從野生型9522幼苗葉片中提取基因組DNA作為模板，用堿基序列如SEQ ID No.7和 SEQ ID No.8所示的引物擴(kuò)增出0sDPW2基因的如SEQ ID NO.6所示的5997bp的基因組序列 片段； (b) 提供攜帶表達(dá)0sDPW2互補(bǔ)構(gòu)建載體的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105； (c) 將水稻細(xì)胞或組織或器官與步驟(a)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使編碼如SEQ ID NO.1 所示氨基酸的核苷酸轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞，并且整合到水稻細(xì)胞的染色體上； (d) 選擇轉(zhuǎn)入所述核苷酸的水稻細(xì)胞或組織，再生，獲得恢復(fù)育性的水稻植株。
【文檔編號(hào)】C07K14/415GK106011167SQ201610362598
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】梁婉琪, 張大兵, 徐大偉, 袁政, 陳明姣, 羅治靖
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)