化學(xué)品的制造方法和連續(xù)培養(yǎng)裝置的制造方法
【專利摘要】化學(xué)品的制造方法，其為了以不影響培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)條件的方式控制膜分離槽內(nèi)的培養(yǎng)液流速，而且為了抑制微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的沉淀，提高化學(xué)品的生產(chǎn)效率，培養(yǎng)培養(yǎng)槽中的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，將培養(yǎng)液從培養(yǎng)槽輸送到膜分離槽，通過分離膜過濾，從透過液中回收作為化學(xué)品的發(fā)酵生產(chǎn)物，同時(shí)使未經(jīng)過濾的未過濾培養(yǎng)液以與膜分離槽上游側(cè)的培養(yǎng)液匯合的方式回流，在該方法中由培養(yǎng)槽送液的培養(yǎng)液的一部分根據(jù)膜分離槽的培養(yǎng)液流入側(cè)壓力，繞過膜分離槽。
【專利說明】
化學(xué)品的制造方法和連續(xù)培養(yǎng)裝置
[0001 ]本申請發(fā)明是申請?zhí)枮?00980138605.4、發(fā)明名稱為化學(xué)品的制造方法和連續(xù)培 養(yǎng)裝置、申請日為2009年9月16日的申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及通過微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)制造化學(xué)品的方法。更詳細(xì)的是設(shè)及可 高生產(chǎn)性制造所期望的化學(xué)品的化學(xué)品的制造方法W及培養(yǎng)裝置，該制造方法通過一 邊進(jìn)行培養(yǎng)，一邊用分離膜從微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液中有效過濾含有培養(yǎng)所生產(chǎn)的發(fā) 酵生產(chǎn)物(化學(xué)品）的液體，然后回收發(fā)酵生產(chǎn)物。
【背景技術(shù)】
[0003] 伴隨微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)的物質(zhì)生產(chǎn)方法，可W大致分為（1)分批培養(yǎng)法 (Batch培養(yǎng)法)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)法(Fed-Batch培養(yǎng)法），W及(2)連續(xù)培養(yǎng)法。
[0004] 上述(1)的分批培養(yǎng)法和補(bǔ)料分批培養(yǎng)法的設(shè)備簡單、培養(yǎng)在短時(shí)間內(nèi)結(jié)束，因此 具有雜菌污染導(dǎo)致的損害少的優(yōu)點(diǎn)，一直W來就作為使用微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的物質(zhì)生產(chǎn)方 法來使用。但是，運(yùn)些方法，由于隨時(shí)間經(jīng)過，培養(yǎng)液中的發(fā)酵生產(chǎn)物濃度變高，滲透壓上升 或生產(chǎn)物自身引起的發(fā)酵受到抑制等原因?qū)е律a(chǎn)性和收率降低。因此，采用運(yùn)些培養(yǎng)方 法，難W長時(shí)間穩(wěn)定地維持發(fā)酵生產(chǎn)物高生產(chǎn)性和高收率。
[0005] 另一方面，上述(2)的連續(xù)培養(yǎng)法由于避免了培養(yǎng)槽內(nèi)發(fā)酵生產(chǎn)物高濃度蓄積，因 此具有能夠長時(shí)間維持高收率和高生產(chǎn)性運(yùn)樣的特征。
[0006] 例如，對于k谷氨酸（參照專利文獻(xiàn)1)和心賴氨酸（參照非專利文獻(xiàn)1)的發(fā)酵，公 開了連續(xù)培養(yǎng)法。然而，運(yùn)些例子中，盡管向培養(yǎng)液進(jìn)行了營養(yǎng)素等原料的連續(xù)供給，然而 由于取出含有微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液而稀釋了培養(yǎng)液中的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，因此限 制了生產(chǎn)效率的提高。
[0007] 因此，提出了 W下方法，即在連續(xù)培養(yǎng)法中，用分離膜過濾微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，從 透過液中回收發(fā)酵生產(chǎn)物，同時(shí)使被過濾的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞保持在或回流到培養(yǎng)槽內(nèi)， 將培養(yǎng)液中的微生物和細(xì)胞維持在高濃度。
[000引例如，提出了通過利用分離膜的連續(xù)培養(yǎng)裝置，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)的技術(shù)(參照專利文 獻(xiàn)2)。本提案中，通過使用具有用于培養(yǎng)微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的槽，和用于從培養(yǎng)液中對目的 發(fā)酵生產(chǎn)物與微生物、培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行膜分離的槽的連續(xù)培養(yǎng)裝置，可比分批培養(yǎng)法、補(bǔ) 料分批培養(yǎng)法更高的生產(chǎn)速度生產(chǎn)各種化學(xué)品。
[0009]運(yùn)里，在使用分離膜的連續(xù)培養(yǎng)裝置中，由于使膜分離槽內(nèi)的培養(yǎng)液流速提高不 容易引起膜的堵塞，因此人們認(rèn)為可W使分離膜透過液量增加來進(jìn)一步提高生產(chǎn)速度。但 是，在專利文獻(xiàn)2中，由于無法單獨(dú)控制由培養(yǎng)槽送出的送液量和向膜分離槽的流量，因此 供給到膜分離槽的培養(yǎng)液的流量依賴于由培養(yǎng)槽送液的培養(yǎng)液的流量。因此，為了使膜分 離槽內(nèi)的培養(yǎng)液流速發(fā)生變化，就必須使由培養(yǎng)槽送出的送液量發(fā)生變化，結(jié)果，培養(yǎng)槽中 的液體混合狀態(tài)會(huì)變化，培養(yǎng)條件發(fā)生大變化。此外，隨時(shí)間經(jīng)過，膜發(fā)生堵塞，微生物或培 養(yǎng)細(xì)胞的濃度上升等原因?qū)е履し蛛x槽內(nèi)壓力上升時(shí)，為了使膜分離自身最適化，優(yōu)選降 低供給到膜分離槽的培養(yǎng)液的流量。但是，一旦使供給到膜分離槽的培養(yǎng)液的流量發(fā)生變 化，則培養(yǎng)槽中的培養(yǎng)條件就會(huì)發(fā)生大的變化。因此，不能簡單地使供給到膜分離槽的培養(yǎng) 液的流量發(fā)生變化。此外，要是為了最適當(dāng)?shù)乜刂颇し蛛x槽內(nèi)的壓力而減少由培養(yǎng)槽送出 的培養(yǎng)液量，就會(huì)發(fā)生送液管內(nèi)的培養(yǎng)液流速降低，微生物或培養(yǎng)細(xì)胞沉淀在送液管配管 內(nèi)，生產(chǎn)效率降低運(yùn)樣的問題。另一方面，如果膜分離槽內(nèi)的壓力過高，就會(huì)有由膜分離槽 中向外移動(dòng)的培養(yǎng)液中的微生物由于壓力變動(dòng)而被破壞運(yùn)樣的擔(dān)屯、。
[0010] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0011] 專利文獻(xiàn)
[001^ 專利文獻(xiàn)1:特開平10-150996號公報(bào)
[0013] 專利文獻(xiàn)2:國際公開第07/097260號小冊子
[0014] 非專利文獻(xiàn)
[0015] 非專利文獻(xiàn) 1 :TosMhiko Hirao等人，A卵 1 .Microbiol .Biotechnol.，32,269 - 273(1989)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 發(fā)明要解決的問題
[0017] 本發(fā)明鑒于運(yùn)樣的狀況，提供化學(xué)品的制造方法W及能夠適于運(yùn)種方法的培養(yǎng)裝 置，運(yùn)種制造方法能夠不影響培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)條件地控制膜分離槽內(nèi)的培養(yǎng)液流速，而且 還可W抑制微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的沉淀，提高化學(xué)品的生產(chǎn)效率。
[0018] 用于解決問題的手段
[0019] 本發(fā)明人W利用分離膜的連續(xù)培養(yǎng)裝置中的生產(chǎn)速度的提高W及發(fā)酵培養(yǎng)的穩(wěn) 定化為目的，進(jìn)行了積極的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過W下的（1)~（14)任一項(xiàng)的構(gòu)成，能夠一邊 控制膜分離槽內(nèi)的培養(yǎng)液流速，一邊保持培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)條件(培養(yǎng)液的滯留時(shí)間等），可 W進(jìn)行化學(xué)品的有效制造，從而完成本發(fā)明。
[0020] (1)使由培養(yǎng)槽送液的培養(yǎng)液的一部分，根據(jù)膜分離槽的培養(yǎng)液流入側(cè)壓力，繞過 膜分離槽的化學(xué)品的制造方法，該方法是在培養(yǎng)槽中培養(yǎng)微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，由培養(yǎng)槽向 膜分離槽輸送培養(yǎng)液，再用分離膜過濾，從透過液中回收作為化學(xué)品的發(fā)酵生產(chǎn)物，同時(shí)使 未經(jīng)過濾的未過濾培養(yǎng)液W與膜分離槽上游側(cè)的培養(yǎng)液匯合的方式回流。
[0021] (2)前述（1)中所述的化學(xué)品的制造方法，其W膜分離槽的培養(yǎng)液流入側(cè)的計(jì)示壓 力為IMPaW下那樣，控制繞過膜分離槽的培養(yǎng)液的流量。
[0022] (3)前述（1)或(2)所述的化學(xué)品的制造方法，其使未過濾培養(yǎng)液的一部分W與培 養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液匯合的方式回流，同時(shí)使未過濾培養(yǎng)液的其余部分W與培養(yǎng)槽至膜分離槽 之間的培養(yǎng)液匯合的方式回流。
[0023] (4)前述(3)所述的化學(xué)品的制造方法，其相互獨(dú)立地控制W與培養(yǎng)槽至膜分離槽 之間的培養(yǎng)液匯合方式回流的未過濾培養(yǎng)液的流量，和W與培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液匯合方式回 流的未過濾培養(yǎng)液的流量。
[0024] (5)前述(3)或(4)中所述的化學(xué)品的制造方法，W與培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液匯合方式 回流的未過濾培養(yǎng)液的流量相對于W與培養(yǎng)槽至膜分離槽之間的培養(yǎng)液匯合方式回流的 未過濾培養(yǎng)液的流量之比在1W下。
[0025] (6)前述（1)~（5)任一項(xiàng)所述的化學(xué)品的制造方法，由培養(yǎng)槽向膜分離槽輸送的 培養(yǎng)液的線流速、W由膜分離槽向該膜分離槽上游側(cè)的培養(yǎng)液匯合的方式回流的未過濾培 養(yǎng)液的線流速、W及繞過膜分離槽的培養(yǎng)液的線流速都在2.5cm/秒W上。
[0026] (7)前述（1)~(6)任一項(xiàng)所述的化學(xué)品的制造方法，調(diào)節(jié)流入膜分離槽的培養(yǎng)液 量和/或自分離膜的透過液量，W便自分離膜的透過液量相對于流入膜分離槽的培養(yǎng)液量 的回收率為10.0% W下。
[0027] (8)前述（1)~（7)任一項(xiàng)所述的化學(xué)品的制造方法，培養(yǎng)槽中培養(yǎng)液體積與膜分 離槽中培養(yǎng)液體積之比為4W上100W下。
[0028] (9)具備膜分離槽的旁通管、膜分離槽的培養(yǎng)液流入側(cè)壓力的檢測裝置、和設(shè)置在 旁通管的流量控制裝置的連續(xù)培養(yǎng)裝置，該連續(xù)培養(yǎng)裝置具備用于培養(yǎng)微生物或培養(yǎng)細(xì)胞 的培養(yǎng)槽，具備用于回收來自培養(yǎng)槽的培養(yǎng)液中生產(chǎn)的發(fā)酵生產(chǎn)物的分離膜的膜分離槽， 連接培養(yǎng)槽與膜分離槽并在將培養(yǎng)液輸送到前述膜分離槽的同時(shí)使未經(jīng)分離膜過濾的未 過濾培養(yǎng)液W與膜分離槽上游側(cè)的培養(yǎng)液匯合的方式回流的循環(huán)管，和設(shè)置在循環(huán)管的培 養(yǎng)液送液裝置。
[0029] (10)前述(9)中所述的連續(xù)培養(yǎng)裝置，所述流量控制裝置是由檢測裝置的結(jié)果聯(lián) 動(dòng)而運(yùn)轉(zhuǎn)的。
[0030] (11)前述(9)或（10)中所述的連續(xù)培養(yǎng)裝置，其具備循環(huán)管的線流速檢測裝置，流 量控制裝置和/或前述培養(yǎng)液送液裝置是根據(jù)該線流速檢測裝置的結(jié)果而運(yùn)轉(zhuǎn)的。
[0031] (12)前述(9)~（11)任一項(xiàng)所述的連續(xù)培養(yǎng)裝置，所述膜分離槽安裝在具有與前 述培養(yǎng)液送液裝置不同的送液裝置、且與培養(yǎng)槽獨(dú)立的循環(huán)回路內(nèi)。
[0032] (13)前述(9)~（12)任一項(xiàng)所述的連續(xù)培養(yǎng)裝置，循環(huán)管在浸潰于培養(yǎng)槽中存留 的培養(yǎng)液中的位置開口。
[0033] (14)前述(9)~（13)任一項(xiàng)所述的連續(xù)培養(yǎng)裝置，培養(yǎng)槽體積與膜分離槽體積之 比在4W上100W下。
[0034] 發(fā)明效果
[0035] 根據(jù)本發(fā)明，可W使由培養(yǎng)槽送液的培養(yǎng)液的一部分根據(jù)膜分離槽的培養(yǎng)液流入 側(cè)壓力，繞過膜分離槽，也就是說，可W獨(dú)立控制向膜分離槽供給的培養(yǎng)液的流量，和由培 養(yǎng)槽送出的培養(yǎng)液的流量。其結(jié)果是，可W不改變培養(yǎng)條件地適當(dāng)改變膜分離槽內(nèi)的培養(yǎng) 液流速，而不容易引起膜的堵塞，可W增加分離膜透過液量，從而提高生產(chǎn)速度。此外，如 果，隨時(shí)間經(jīng)過發(fā)生膜的堵塞，微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的濃度上升，則膜分離槽內(nèi)的壓力上升， 培養(yǎng)槽中的培養(yǎng)條件也基本不發(fā)生變化，在將培養(yǎng)液輸送到膜分離槽的同時(shí)回流未經(jīng)分離 膜過濾的未過濾培養(yǎng)液回流的循環(huán)管中，可W-邊維持微生物或培養(yǎng)細(xì)胞難W沉淀的流 速，一邊控制供給到膜分離槽的培養(yǎng)液的流量，W及在膜分離槽內(nèi)作用的壓力，其結(jié)果是可 W防止膜分離槽的破損，防止培養(yǎng)液中的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的壓力變化導(dǎo)致的破壞。而且， 在膜分離槽內(nèi)產(chǎn)生麻煩時(shí)，可W-邊繼續(xù)培養(yǎng)，一邊完全停止培養(yǎng)液向膜分離槽的供給，修 正膜分離槽內(nèi)的麻煩，進(jìn)行膜分離槽的交換或轉(zhuǎn)換。
[0036] 此外，本發(fā)明中，通過一邊使由培養(yǎng)槽送液的培養(yǎng)液的一部分根據(jù)膜分離槽的培 養(yǎng)液流入側(cè)的壓力繞開膜分離槽，一邊將該膜分離槽中透過液的回收率控制在10% W下， 可w進(jìn)一步防止膜的堵塞，可w長期進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。
[0037]如上所述，按照本發(fā)明，可W同時(shí)提高連續(xù)培養(yǎng)產(chǎn)生的發(fā)酵生產(chǎn)物(也就是說所期 望的化學(xué)品）的生產(chǎn)效率和對糖收率，而且通過將膜分離槽中的回收率控制在10% W下，還 可W長期進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。
[003引附圖的簡要說明
[0039] [圖1]是用于說明本發(fā)明中的連續(xù)培養(yǎng)裝置的一個(gè)實(shí)施方案的概要模式圖。
[0040] [圖2]是用于說明本發(fā)明中的連續(xù)培養(yǎng)裝置的其它實(shí)施方案的概要模式圖。
[0041] [圖3]是用于說明本發(fā)明中使用的分離膜元件的一個(gè)實(shí)施方案的概要展開圖。
[0042] [圖4]是用于說明本發(fā)明中使用的分離膜元件的其它實(shí)施方案的概要斜視圖。
[0043] [圖引是表示參考例中使用的酵母用表達(dá)載體pTRSll的物理圖譜的圖。
[0044] [圖6]實(shí)施例2中獲得的循環(huán)管內(nèi)的培養(yǎng)液線流速和沉淀在該管內(nèi)的菌體累積量 的圖。
[0045] [圖7]是用于說明本發(fā)明中的連續(xù)培養(yǎng)裝置的另外的實(shí)施方案的概要模式圖。
[0046] [圖引是用于說明本發(fā)明中的連續(xù)培養(yǎng)裝置的另外的實(shí)施方案的概要模式圖。
[0047] [圖9]是用于說明比較例中使用的連續(xù)培養(yǎng)裝置的方案的概要模式圖。
[004引[圖10]是表示實(shí)施例1中獲得的乳酸濃度、酵母濁度的圖。
[0049] [圖11]是表示比較例1中獲得的乳酸濃度、酵母濁度的圖。
[0050] [圖12]是表示比較例1中獲得的膜分離槽的培養(yǎng)液流入側(cè)的壓力的圖。
[0051] [圖13]是用于說明比較例中使用的連續(xù)培養(yǎng)裝置的方案的概要模式圖。
[0052] [圖14]是用于說明本發(fā)明中的連續(xù)培養(yǎng)裝置的其它實(shí)施方案的概要模式圖。
[0053] [圖1引是用于說明比較例中使用的連續(xù)培養(yǎng)裝置的方案的概要模式圖。
[0054] [圖16]是用于說明本發(fā)明中的連續(xù)培養(yǎng)裝置的其它實(shí)施方案的概要模式圖。
[0055] [圖17]是表示實(shí)施例6~9中獲得的膜間差壓的推移的圖。
[0056] [圖1引是表示實(shí)施例10中獲得的尸胺濃度、棒桿菌濁度的圖。
[0057] [圖19]是表示比較例5中獲得的尸胺濃度、棒桿菌濁度的圖。
[0058] [圖20]是表示比較例5中獲得的膜分離槽的培養(yǎng)液流入側(cè)的壓力的圖。
[0059] [圖21]是表示實(shí)施例11中獲得的心賴氨酸濃度、棒桿菌濁度的圖。
[0060] [圖22]是表示比較例6中獲得的心賴氨酸濃度、棒桿菌濁度的圖。
[0061] [圖23]是表示比較例6中獲得的膜分離槽的培養(yǎng)液流入側(cè)的壓力的圖。
[0062] 用于實(shí)施發(fā)明的最佳方式
[0063] 本發(fā)明的方法是化學(xué)品的制造方法，其在培養(yǎng)槽中培養(yǎng)微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，將培 養(yǎng)液由培養(yǎng)槽連續(xù)輸送到膜分離槽，用分離膜過濾，從透過液中回收作為化學(xué)品的發(fā)酵生 產(chǎn)物，同時(shí)使未經(jīng)過濾的未過濾培養(yǎng)液回流使之與膜分離槽的上游側(cè)的培養(yǎng)液匯合，此時(shí) 由培養(yǎng)槽送液的培養(yǎng)液的一部分，根據(jù)膜分離槽的培養(yǎng)液流入側(cè)壓力，繞開膜分離槽。
[0064] 運(yùn)樣的本發(fā)明在例如圖1所示的培養(yǎng)裝置進(jìn)行。圖1是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中的 運(yùn)種培養(yǎng)裝置的概要模式圖。
[0065] 圖1中所示的培養(yǎng)裝置由進(jìn)行微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)的培養(yǎng)槽1，和具備用于過 濾培養(yǎng)液的分離膜3的膜分離槽2構(gòu)成。膜分離槽2設(shè)置在培養(yǎng)反應(yīng)槽的外部，通過送液管17 和送液管15 (循環(huán)管)與培養(yǎng)槽1連接。
[0066] 培養(yǎng)槽1具有能夠連續(xù)培養(yǎng)微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的功能，只要可W連接循環(huán)管，其可 W是任意結(jié)構(gòu)，可W使用W往一直用于培養(yǎng)微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的罐式發(fā)酵器等。
[0067] 培養(yǎng)槽1按如下方式構(gòu)成，其與培養(yǎng)基供給累6連接，并配備攬拌機(jī)7,通過培養(yǎng)基 供給累6將培養(yǎng)基投入到培養(yǎng)槽1中，根據(jù)需要，可W用攬拌機(jī)7攬拌培養(yǎng)槽1內(nèi)的培養(yǎng)液。并 且，還連接氣體供給裝置8,根據(jù)需要，通過該氣體供給裝置8供給需要的氣體。此時(shí)，還優(yōu)選 例如，在培養(yǎng)槽1的液面上空間化eadspace)與氣體供給裝置8之間連接配管，按液面上空 間、配管、氣體供給裝置8的順序流動(dòng)供給氣體，從而能夠回收和再循環(huán)供給的氣體，再由氣 體供給裝置8進(jìn)行供給。
[0068] 此外，在培養(yǎng)槽1中根據(jù)需要設(shè)置pH傳感器?控制裝置9和抑調(diào)節(jié)液供給累10, W 便能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的抑。當(dāng)然，為了通過培養(yǎng)時(shí)提供酸和堿兩方來控制培養(yǎng)液的抑，優(yōu)選有 多個(gè)抑調(diào)節(jié)液供給累。而且，根據(jù)需要，還設(shè)置溫度調(diào)節(jié)器11W便能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)液溫度從而 進(jìn)行高生產(chǎn)性的化學(xué)品的生產(chǎn)。而且，作為通過儀器檢測和控制裝置進(jìn)行的培養(yǎng)液的物理 化學(xué)條件的調(diào)節(jié)，例示了抑和溫度的調(diào)節(jié)，但根據(jù)需要，還可W進(jìn)行溶解氧和0RP的控制，而 且還可W再用在線化學(xué)傳感器等分析裝置測定培養(yǎng)液中的微生物濃度，控制W其作為指標(biāo) 的物理化學(xué)條件。而且，W上述儀器檢測和控制裝置獲得的培養(yǎng)液的物理化學(xué)環(huán)境的測定 值作為指標(biāo)，可W適當(dāng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基投入量和速度。
[0069] 在膜分離槽2內(nèi)部可W設(shè)置分離膜3,膜分離槽2與培養(yǎng)槽1同樣，只要可W連接循 環(huán)管，其形狀等不限。分離膜3如果可W從微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液中只別濾過微生物或 培養(yǎng)細(xì)胞，無論是無機(jī)還是有機(jī)材料的分離膜都可W，但優(yōu)選具有適于被處理液的性狀和 用途的分離性能和透過性能的后述的多孔性膜，而且優(yōu)選能耐滅菌操作(例如在12(TC30分 鐘）的膜。而且，累4與分離膜3連接，W便在該分離膜的原液側(cè)和透過側(cè)之間能夠產(chǎn)生膜間 差壓。
[0070] 而且，優(yōu)選，膜分離槽2和培養(yǎng)槽1具有培養(yǎng)槽中的培養(yǎng)液與膜分離槽中的培養(yǎng)液 的培養(yǎng)液容積比達(dá)到4W上100W下。也就是說，優(yōu)選地，被設(shè)計(jì)成，在膜分離槽2和培養(yǎng)槽1 各槽中，一般添加膽留它們?nèi)莘e的約80%的培養(yǎng)液，培養(yǎng)槽體積與膜分離槽體積之比達(dá)到4 W上100W下。通過運(yùn)種結(jié)構(gòu)，可W在實(shí)現(xiàn)裝置的緊湊化的同時(shí)，延長培養(yǎng)液的培養(yǎng)槽滯留 時(shí)間，實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件，并且可W減少動(dòng)力費(fèi)用，提高化學(xué)品的生產(chǎn)速度，W及實(shí)現(xiàn)容 易的裝置運(yùn)轉(zhuǎn)管理。
[0071] 在循環(huán)管(送液管17和送液管15)中，設(shè)置由膜分離槽2的培養(yǎng)液流入側(cè)，繞過膜分 離槽，與膜分離槽的培養(yǎng)液流出側(cè)連接的旁通管26,運(yùn)種結(jié)構(gòu)使得能夠由培養(yǎng)槽1輸送的培 養(yǎng)液的一部分不供給到膜分離槽2,使之繞過該膜分離槽2,而與送液管15的未過濾培養(yǎng)液 匯合。另外，在本實(shí)施方案中，旁通管26的一端與送液管17連接，另一端與送液管15連接，但 旁通管26也可W從膜分離槽2的培養(yǎng)液流入側(cè)出發(fā)，繞過膜分離槽2,與培養(yǎng)槽1或與培養(yǎng)槽 1和膜分離槽2的培養(yǎng)液流入側(cè)之間連接。也就是說，為了繞過膜分離槽2的運(yùn)一部分的培養(yǎng) 液直接回流到培養(yǎng)槽1，也可W將旁通管26的一端(上游側(cè))與送液管17連接，另一端（下游 偵U)與培養(yǎng)槽1連接。此外，還可W將旁通管26的兩端與送液管17連接，W便繞過膜分離槽2 的該部分培養(yǎng)液直接與培養(yǎng)槽1供給的送液管17中的培養(yǎng)液匯合。
[0072] 在膜分離槽2的旁通管26內(nèi)具有流量控制裝置25。通過運(yùn)種流量控制裝置，可W控 制向膜分離槽2供給的培養(yǎng)液流量。該流量控制裝置可W是閥，也可W是累，但從成本方面 考慮優(yōu)選閥。當(dāng)選擇閥作為前述流量控制裝置時(shí)，通過開閥可W減少流向膜分離槽2的培養(yǎng) 液量。此外，相反，通過閉閥，可W使所有流過送液管17的培養(yǎng)液流向膜分離槽2。盡管閥的 結(jié)構(gòu)不限，但由于在蒸汽滅菌時(shí)，培養(yǎng)液等在結(jié)構(gòu)上殘留少，因此優(yōu)選使用隔膜閥 (dia地ragm valve)、蝶閥。此外，在選擇累作為流量控制裝置25時(shí)，通過按培養(yǎng)液與流向膜 分離槽2的培養(yǎng)液同方向流動(dòng)那樣送液，增多累送液量，可W減少流向膜分離槽2的培養(yǎng)液 量，相反，通過停止累送液，可W使流過送液管17的培養(yǎng)液全部流向膜分離槽2。
[0073] 向膜分離槽2供給的培養(yǎng)液的流量基本上根據(jù)膜分離槽的培養(yǎng)液流入側(cè)壓力來控 審IJ。為此，在圖1所示的裝置中設(shè)置壓力計(jì)29。用壓力計(jì)29測定膜分離槽的培養(yǎng)液流入側(cè)壓 力，當(dāng)測定值高于所希望的值時(shí)，使流量控制裝置25運(yùn)作起來，使由培養(yǎng)槽1輸送的培養(yǎng)液 的一部分繞過膜分離槽2循環(huán)。
[0074] 此外，在循環(huán)管中設(shè)置了進(jìn)行由培養(yǎng)槽送液的培養(yǎng)液的流量控制的累5。累可W設(shè) 置在送液管17內(nèi)或送液管15(返回培養(yǎng)槽）內(nèi)，也可W設(shè)置在兩者內(nèi)。累的方式、形狀和接液 部材質(zhì)等不限，但優(yōu)選能夠耐循環(huán)管的蒸汽滅菌的物質(zhì)。
[0075] 在本文，圖6中表示了循環(huán)管中的培養(yǎng)液線速度與具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母株的 沉淀量之間的關(guān)系，由此表明，循環(huán)管內(nèi)（送液管17和送液管15)的培養(yǎng)液線速度如果在 2.5cm/秒W上，菌體就可W不沉淀在配管內(nèi)，培養(yǎng)液得W循環(huán)。因此，檢測由培養(yǎng)槽輸送的 送液管17中的培養(yǎng)液和/或送液管15中的未過濾培養(yǎng)液的線流速，優(yōu)選使流量控制裝置25 和累5運(yùn)作起來，W便該線流速達(dá)到2.5cm/秒W上。而且，基于相同的理由，優(yōu)選設(shè)法使旁通 管26中培養(yǎng)液的線流速達(dá)到2.5cm/秒W上。
[0076] 而且，如上所述，在繞過膜分離槽的前述部分培養(yǎng)液與培養(yǎng)槽中的培養(yǎng)液或由培 養(yǎng)槽向膜分離槽輸送的培養(yǎng)液匯合時(shí)，檢測由培養(yǎng)槽送液的培養(yǎng)液的線流速，可W使流量 控制裝置25和累5運(yùn)作起來，W便該線流速達(dá)到2.5cm/秒W上。此外，如后所述，在送液管15 的未過濾培養(yǎng)液既按與培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液匯合的方式環(huán)流，又按與送液管17的培養(yǎng)液的一 部分直接匯合的方式環(huán)流時(shí)，優(yōu)選設(shè)法使任一運(yùn)些管中的培養(yǎng)液的線流速都達(dá)到2.5cm/秒 W上。也就是說，本發(fā)明中，優(yōu)選設(shè)法使從培養(yǎng)槽輸送到膜分離槽的培養(yǎng)液的線流速、W從 膜分離槽向該膜分離槽的上游側(cè)的培養(yǎng)液匯合的方式回流的未過濾培養(yǎng)液的線流速、W及 繞過膜分離槽的培養(yǎng)液的線流速都達(dá)到2.5cm/秒W上。
[0077] 并且，在圖1所示的裝置中，為了調(diào)節(jié)分離膜3中濾過流量和培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液量， 在培養(yǎng)槽1中設(shè)置水位感應(yīng)器12。通過水位感應(yīng)器12檢測培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液量，控制培養(yǎng)基 供給累6。此外，為了調(diào)節(jié)濾過流量，可W控制透過液量?？刂仆高^液量的方法并沒有限制， 但可W設(shè)置例如通過控制水位差壓來改變?yōu)V過流量的水位差壓控制裝置，還可W通過電源 動(dòng)力使累運(yùn)作起來從而改變?yōu)V過流量。此外，理想的是，在本發(fā)明的化學(xué)品的制造方法中使 用的培養(yǎng)裝置中設(shè)置用于給培養(yǎng)槽1、膜分離槽2、送液管15、送液管17滅菌的蒸汽供給管。
[0078] 此外，作為本發(fā)明中使用的各種累，可W列舉例如螺旋累、管累、隔膜累等各種種 類，但優(yōu)選根據(jù)累的輸出設(shè)定，能夠計(jì)算循環(huán)液量或自分離膜的透過液量的累，具體可列舉 隔膜累或管累。
[0079] 在采用W上結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)裝置的化學(xué)品的制造方法中，培養(yǎng)按例如如下方式進(jìn)行。 也就是說，在培養(yǎng)槽1中連續(xù)培養(yǎng)微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)液從培養(yǎng)槽1中，通過循環(huán)管內(nèi)的 累5,經(jīng)送液管17,向膜分離槽2供給，通過累4等在分離膜3的原液側(cè)與透過液側(cè)之間產(chǎn)生壓 力差，過濾該培養(yǎng)液，回收含有作為微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的發(fā)酵生產(chǎn)物的乳酸等(化學(xué)品）的 透過液。另一方面，未過濾培養(yǎng)液經(jīng)送液管15,回流到培養(yǎng)槽1中。此時(shí)，累5的流量W微生物 或培養(yǎng)細(xì)胞不沉淀在送液管17和送液管15內(nèi)的速度(例如如上所述的線流速在2.5cm/秒W 上)送液。
[0080] 然而，如果連續(xù)地繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)、膜分離，培養(yǎng)液的粘度上升，分離膜堵塞、和膜分 離槽內(nèi)微生物或培養(yǎng)細(xì)胞累積，流路閉塞等原因?qū)е履し蛛x槽內(nèi)的壓力上升。膜分離槽內(nèi) 壓力一旦上升，增大了膜分離槽的破損和對微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的負(fù)擔(dān)。因此，膜分離槽內(nèi)的 壓力優(yōu)選在IMPaW下。另一方面，如果為了抑制膜分離槽內(nèi)壓力上升，從而減少通過累5由 培養(yǎng)槽1提供的培養(yǎng)液送液量，培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)條件就會(huì)發(fā)生大的變化，而且微生物或培養(yǎng) 細(xì)胞沉淀在循環(huán)管內(nèi)，生產(chǎn)效率降低。
[0081] 因此，本發(fā)明中，使由培養(yǎng)槽1輸送的培養(yǎng)液的一部分，根據(jù)膜分離槽2的培養(yǎng)液流 入側(cè)壓力，繞過膜分離槽2,進(jìn)行回流。優(yōu)選的是，按膜分離槽的培養(yǎng)液流入側(cè)的壓力在IMPa W下，來控制繞過膜分離槽2的培養(yǎng)液的流量。另外，運(yùn)里所謂的運(yùn)種壓力是計(jì)示壓力，本發(fā) 明中所謂壓力，只要沒有特殊說明，就表示計(jì)示壓力。運(yùn)種膜分離槽內(nèi)的壓力變動(dòng)可W通過 設(shè)置在培養(yǎng)液供給側(cè)的壓力計(jì)29進(jìn)行測定，根據(jù)運(yùn)種測定結(jié)果，控制繞過膜分離槽的培養(yǎng) 液的流量，從而控制膜分離槽內(nèi)的壓力上升。其結(jié)果是，可W防止循環(huán)管內(nèi)微生物或培養(yǎng)細(xì) 胞的沉淀，穩(wěn)定地進(jìn)行培養(yǎng)，而且可減少膜分離槽的破損和對微生物、培養(yǎng)細(xì)胞的負(fù)擔(dān)增 大，因此可W獲得高收率W及高生產(chǎn)性。也就是說，與W往的分批發(fā)酵相比，發(fā)酵生產(chǎn)物的 生產(chǎn)速度更高，可W進(jìn)行效率極好的發(fā)酵生產(chǎn)，同時(shí)可W有效回收該發(fā)酵生產(chǎn)物。而且，連 續(xù)培養(yǎng)中的生產(chǎn)速度用下式(1)計(jì)算。
[0082] [數(shù)1]
[0083]
[0084] 此外，分批培養(yǎng)中的發(fā)酵生產(chǎn)速度通過W下方式求出：用消耗所有原料碳源時(shí)的 生產(chǎn)物量(g)除W碳源消耗所需要的時(shí)間化)和該時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)液量化)。
[0085] 圖1所示的裝置優(yōu)選按例如如下方式進(jìn)行變化。也就是說，例如，如圖2所示，優(yōu)選 按流量控制裝置25與壓力計(jì)29的測定結(jié)果聯(lián)動(dòng)，進(jìn)行運(yùn)作的方式構(gòu)成。另外，優(yōu)選在送液管 17中，在旁通管26的連接點(diǎn)的下游側(cè)W及膜分離層2上游側(cè)的位置，設(shè)置膜分離槽開閉閥 27,在送液管15中，在旁通管26的連接點(diǎn)的上游側(cè)W及膜分離層2下游側(cè)的位置上設(shè)置膜分 離槽開閉閥28。設(shè)置膜分離槽開閉閥27和/或膜分離槽開閉閥2別寸，設(shè)法使得流過送液管17 的所有培養(yǎng)液，根據(jù)需要，流向旁通管26。運(yùn)樣一來，在分離膜的堵塞和膜分離槽內(nèi)微生物 或培養(yǎng)細(xì)胞的累積導(dǎo)致流路閉塞等情況下產(chǎn)生膜分離槽內(nèi)不適的時(shí)候，可W完全停止向膜 分離槽供給的培養(yǎng)液，可w修正或交換膜分離槽內(nèi)不適的地方。
[0086] 而且，還優(yōu)選，如圖7所示，在送液管15的未過濾培養(yǎng)液與培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液匯合 的方式環(huán)流的同時(shí)，按與送液管17的培養(yǎng)液的一部分直接匯合的方式環(huán)流。此時(shí)，控制按與 培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液匯合的方式環(huán)流的未過濾培養(yǎng)液的流速、流量、W及由培養(yǎng)槽送液的培 養(yǎng)液的流速、流量的累5設(shè)置在送液管15的分支點(diǎn)14B的培養(yǎng)槽側(cè)的下游，另外，還在送液管 17的匯合點(diǎn)14A的下游側(cè)設(shè)置累16。運(yùn)樣一來，在膜分離槽2、送液管17的匯合點(diǎn)14A的下游 偵U、和送液管15的分支點(diǎn)14B的上游側(cè)，形成與培養(yǎng)槽1獨(dú)立的循環(huán)線路，可W實(shí)現(xiàn)分別由累 16、5相互獨(dú)立地來控制在膜分離槽2、送液管17的匯合點(diǎn)14A的下游側(cè)W及送液管15的分支 點(diǎn)14B的上游側(cè)形成的循環(huán)回路中的流速、流量，和在送液管15的分支點(diǎn)14B的下游側(cè)、培養(yǎng) 槽及送液管17的匯合點(diǎn)14A的上游側(cè)的流速、流量。因此，即使在調(diào)節(jié)累16,增加該循環(huán) 回路內(nèi)的培養(yǎng)液流速，也就是說，使流過膜分離槽內(nèi)的分離膜3的表面的培養(yǎng)液的線速度 (線流速）的情況下，通過累5也可W使送液管15的分支點(diǎn)14B的下游側(cè)的流速保持一定，使 培養(yǎng)液返回培養(yǎng)槽1內(nèi)的速度保持一定。也就是說，由于可W保持培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)條件地使 膜分離槽內(nèi)的培養(yǎng)液流速提高，因此可W W微生物或培養(yǎng)細(xì)胞不沉淀的速度送液，而且培 養(yǎng)槽內(nèi)可W保持適于培養(yǎng)的條件，可W穩(wěn)定地培養(yǎng)，可W維持高收率和高生產(chǎn)性。
[0087] 另外，返回到培養(yǎng)液的培養(yǎng)槽1內(nèi)的未過濾培養(yǎng)液的速度一旦變快，就會(huì)成為液流 變亂的要因，影響氧移動(dòng)容量系數(shù)化曰，因此可W使培養(yǎng)液返回到培養(yǎng)槽1內(nèi)的速度保持一 定，從而使得發(fā)酵效率穩(wěn)定化。
[0088] 而且，由于本發(fā)明增加流過膜分離槽內(nèi)的分離膜3表面的流速，增加獲得的透過 液、即發(fā)酵生產(chǎn)物的回收量，并且保持培養(yǎng)效率，提高生產(chǎn)速度，因此按與培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng) 液匯合的方式回流的未過濾培養(yǎng)液的流量、流速(也就是，送液管15的分支點(diǎn)14B的下游側(cè) 的流量、流速)α優(yōu)選比按與培養(yǎng)槽到膜分離槽之間的培養(yǎng)液匯合的方式回流的未過濾培養(yǎng) 液的流量、流速(也就是送液管17的分支點(diǎn)14Α的下游側(cè)的流量、流速)β小，它們的比例α/e 優(yōu)選在下。
[0089] 而且，如圖14所示，按未過濾培養(yǎng)液與培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液匯合的方式環(huán)流的送液 管15優(yōu)選在浸潰于儲(chǔ)存在培養(yǎng)槽1的培養(yǎng)液的位置開口。由于送液管15的一個(gè)端部在該位 置開口，培養(yǎng)槽1內(nèi)的氧移動(dòng)容量系數(shù)化a難W由預(yù)期的設(shè)定值變化，可W將自該系數(shù)的設(shè) 定值的減少率抑制在該設(shè)定值的30% W內(nèi)的范圍。
[0090] 此外，如圖8所示，優(yōu)選多個(gè)膜分離槽2并聯(lián)連接。通過運(yùn)種方式，在一個(gè)膜分離槽 內(nèi)產(chǎn)生不合適的時(shí)候，可W調(diào)換膜分離槽再使用，可W不停止用膜分離槽的過濾，繼續(xù)進(jìn)行 培養(yǎng)。此外，在并聯(lián)連接多個(gè)膜分離槽時(shí)，通過將蒸汽供給管連接到各個(gè)膜分離槽上，可W 分別進(jìn)行膜分離槽內(nèi)的滅菌。
[0091] 本發(fā)明中，為了提高發(fā)酵生產(chǎn)物的收率，優(yōu)選防止分離膜的堵塞，穩(wěn)定地長期維持 連續(xù)培養(yǎng)。因此，作為由分離膜3獲得的透過液的流量相對于輸送到膜分離槽的培養(yǎng)液的流 量的比例的回收率(W下，有時(shí)只稱為回收率)優(yōu)選控制在10.0% W下。
[0092] 所謂回收率，是每單位時(shí)間分離膜3的透過液量相對于輸送到膜分離槽的培養(yǎng)液 量(循環(huán)液量)的比例，通過下述的(式2)計(jì)算。但是，在連接多個(gè)膜分離裝置時(shí)，根據(jù)各個(gè)膜 分離裝置中的透過液量和循環(huán)液量計(jì)算。而且，透過液量可W用膜分離裝置中使用的分離 膜面積和可W運(yùn)轉(zhuǎn)控制的濾過流量進(jìn)行替換，（式2)可W轉(zhuǎn)化為下述(式3)。
[0093] [數(shù) 2]
[0094]
[0095] [數(shù) 3]
[0096]
[0097] 為了控制回收率，可W調(diào)節(jié)流入膜分離槽的培養(yǎng)液量和/或由分離膜得到的透過 液量。也就是說，優(yōu)選對選自循環(huán)液量、濾過流量和透過液量中的1種W上進(jìn)行控制。為了控 制循環(huán)液量，優(yōu)選調(diào)節(jié)前述位于膜分離槽上游側(cè)的累5、16的輸出。而且，作為控制濾過流量 或透過液量的方法，優(yōu)選累4的輸出調(diào)節(jié)。
[0098] 因此，在圖1所示的裝置中，例如，在送液管17和分離膜3的透過液取出管中設(shè)置流 量計(jì)，定期監(jiān)控循環(huán)液量和透過液量，用(式2)計(jì)算回收率，優(yōu)選按回收率達(dá)到10.0% W下 那樣，在控制累4、5輸出的同時(shí)進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)。
[0099] 而且，作為控制濾過流量或透過液量的方法，除了累4的輸出調(diào)節(jié)之外，還可W列 舉水位差壓的調(diào)節(jié)、通過液體或氣體等產(chǎn)生的吸引、或膜分離槽內(nèi)的加壓等。
[0100] 通過運(yùn)些方法，就可W實(shí)現(xiàn)例如，W保持一定的循環(huán)液量，同時(shí)只控制濾過流量的 方式進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)。此外，還可W實(shí)現(xiàn)W保持一定的濾過流量，同時(shí)控制循環(huán)液量的方式進(jìn)行運(yùn) 轉(zhuǎn)。
[0101] 回收率更優(yōu)選控制在5.0% W下。另一方面，從提高能量效率運(yùn)種觀點(diǎn)考慮，回收 率越高越好。因此，回收率的下限優(yōu)選至少在0.01% W上。
[0102] 下面，對濾過流量進(jìn)行說明。所謂濾過流量，可W用下述(式4)計(jì)算。
[0103] [數(shù) 4]
[0104]
[0105] 裝置中使用的膜面積可W任意設(shè)定，因此是清楚的。透過液量的體積如^天)優(yōu)選 測定1天透過液量的體積，但還可W通過測定1小時(shí)左右的透過液量的體積來概算1天的透 過液量的體積。本發(fā)明中，優(yōu)選濾過流量在0.500m/天W下，更優(yōu)選0.050m/天W上0.400m/ 天W下。濾過流量一旦超過0.500m/天，有時(shí)難W通過回收率的控制而穩(wěn)定地維持連續(xù)培 養(yǎng)。此外，濾過流量如果不到0.050m/天，運(yùn)就意味著分離膜面積過大，從經(jīng)濟(jì)的觀點(diǎn)考慮， 難W工業(yè)化。
[0106] 下面，用圖1中所示的裝置進(jìn)行化學(xué)品的制造的一個(gè)例子，按如下方式具體說明。
[0107] 首先，微生物和培養(yǎng)原料(培養(yǎng)基)儲(chǔ)存在培養(yǎng)槽1，通過適當(dāng)添加中和劑，將運(yùn)種 培養(yǎng)槽1的內(nèi)部維持在抑4~8的范圍內(nèi)，同時(shí)溫度維持在20~5(TC的范圍。由此，進(jìn)行微生 物的培養(yǎng)，此時(shí)生產(chǎn)出醇、有機(jī)酸、氨基酸和核酸等所希望的發(fā)酵生產(chǎn)物(化學(xué)品）。運(yùn)期間， 為了連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，獲得所希望的發(fā)酵生產(chǎn)物，通過培養(yǎng)基供給累6,向培養(yǎng)槽1連續(xù)的或間 歇地供給培養(yǎng)中使用的含有營養(yǎng)素的培養(yǎng)基。
[0108] 此外，在進(jìn)行培養(yǎng)的同時(shí)，用累5使得循環(huán)管內(nèi)的線流速達(dá)到2.5cm/秒W上，使培 養(yǎng)槽1內(nèi)的培養(yǎng)液在培養(yǎng)槽1和膜分離槽2之間連續(xù)循環(huán)。在膜分離槽2中，通過分離膜將該 培養(yǎng)液過濾和分離成含有微生物的未過濾培養(yǎng)液和含有發(fā)酵生產(chǎn)物的透過液。其結(jié)果是， 從裝置系統(tǒng)中取出含有發(fā)酵生產(chǎn)物的透過液，再濃縮、蒸饋、晶析該透過液，可W得到純度 提高的發(fā)酵生產(chǎn)物。另一方面，經(jīng)過濾和分離的含有微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的未過濾培養(yǎng)液停 留在培養(yǎng)槽1內(nèi)，因此培養(yǎng)槽的微生物可W維持在高濃度，可W進(jìn)行化學(xué)品的高生產(chǎn)性的培 養(yǎng)。
[0109] 而且，循環(huán)管內(nèi)的線流速的計(jì)算可W通過(每個(gè)單位時(shí)間的流量)/(配管的截面 積)進(jìn)行計(jì)算?；蛘呖蒞在配管中連接Corioli式數(shù)字化流量傳感器或電極非接觸型2線式 電磁流量計(jì)等，進(jìn)行測定。探測運(yùn)些數(shù)字化流量計(jì)的輸出，進(jìn)行累5或流量控制裝置25等的 控制。
[0110] 培養(yǎng)槽1中的培養(yǎng)液中的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞濃度，優(yōu)選微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的增殖 變得不適應(yīng)而死亡的比率不變高的范圍內(nèi)，維持在高狀態(tài)，運(yùn)是為了獲得高效率的生產(chǎn)性。 作為一個(gè)例子，通過將濃度維持在干燥重量在5g/LW上，可W獲得良好的生產(chǎn)效率。
[0111] 為了維持運(yùn)種適當(dāng)?shù)臐舛?，還優(yōu)選根據(jù)需要，從培養(yǎng)槽內(nèi)取出微生物或培養(yǎng)細(xì)胞。 如果培養(yǎng)槽內(nèi)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞濃度過高，有時(shí)就會(huì)出現(xiàn)容易發(fā)生分離膜閉塞的情況。 通過取出而維持在合適的濃度，可W回避分離膜的閉塞。而且，由于培養(yǎng)槽內(nèi)的微生物或培 養(yǎng)細(xì)胞的濃度有時(shí)會(huì)導(dǎo)致化學(xué)品的生產(chǎn)性能發(fā)生變化，因此通過W生產(chǎn)性能作為指標(biāo)，取 出微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，還可W將生產(chǎn)性能維持在一定范圍內(nèi)。
[0112] 培養(yǎng)原料的供給和培養(yǎng)液的取出（培養(yǎng)液向膜分離槽的送液)可W從適當(dāng)?shù)臅r(shí)期 開始進(jìn)行。也就是說，培養(yǎng)原料的供給和培養(yǎng)液取出的開始時(shí)期未必需要在同時(shí)。而且，培 養(yǎng)原料的供給和培養(yǎng)液的取出可W是連續(xù)的，也可W是間歇的。
[0113] 而且，根據(jù)需要，還優(yōu)選通過水位感應(yīng)器12,適當(dāng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液量。培養(yǎng) 槽內(nèi)的培養(yǎng)液量的調(diào)節(jié)中，還可W不是測定培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液位，而是測定培養(yǎng)液重量進(jìn) 行調(diào)節(jié)。
[0114] 本發(fā)明中，只要是能夠在微生物或培養(yǎng)細(xì)胞增殖的同時(shí)生成化學(xué)品即可，培養(yǎng)裝 置的數(shù)目不限。連續(xù)培養(yǎng)操作，從培養(yǎng)管理上考慮，通常優(yōu)選在單一的培養(yǎng)槽中進(jìn)行，但由 于培養(yǎng)槽容量小等理由，也可W使用多個(gè)培養(yǎng)槽。此時(shí)，即使用配管并聯(lián)或串聯(lián)連接多個(gè)發(fā) 酵槽，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，也獲得了發(fā)酵生產(chǎn)物的高生產(chǎn)性。
[0115] 而且，本發(fā)明中，所謂培養(yǎng)液，是指培養(yǎng)原料中能夠得到微生物或培養(yǎng)細(xì)胞增殖之 結(jié)果的液體，所謂培養(yǎng)原料，是指促進(jìn)所培養(yǎng)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的生長發(fā)育，能夠良好地 生產(chǎn)目的生產(chǎn)物的化學(xué)品等的營養(yǎng)素等。對于培養(yǎng)原料的組成，為了提高目的化學(xué)品的生 產(chǎn)性，也可W對培養(yǎng)開始時(shí)的培養(yǎng)原料組成進(jìn)行適當(dāng)改變。
[0116] 本發(fā)明中使用的微生物和培養(yǎng)細(xì)胞，可W列舉，例如可W在工業(yè)中常使用的面包 酵母等酵母、大腸桿菌、棒狀桿菌型細(xì)菌等細(xì)菌、絲狀真菌、放線菌、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等。 尤其優(yōu)選，由于分離核內(nèi)壓力差而容易引起細(xì)胞破壞的酵母等真核生物，運(yùn)其中最優(yōu)選酵 母。使用的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞可W是從自然環(huán)境中分離的，而且，還可W是由于突變或基因 重組而導(dǎo)致部分性質(zhì)改變的。運(yùn)些微生物或培養(yǎng)細(xì)胞中，優(yōu)選選擇使用目的化學(xué)品的生產(chǎn) 能力高的。而且，本發(fā)明中，有時(shí)將微生物的培養(yǎng)稱為"發(fā)酵"或"發(fā)酵培養(yǎng)"。
[0117] 作為培養(yǎng)原料，只要是促進(jìn)所培養(yǎng)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的生長發(fā)育，能夠良好地 生產(chǎn)目的化學(xué)品的原料即可。作為培養(yǎng)原料的具體例子，優(yōu)選使用碳源、氮源、無機(jī)鹽類、和 根據(jù)需要適當(dāng)含有氨基酸、維生素等有機(jī)微量營養(yǎng)素的通常的液體培養(yǎng)基。
[0118] 作為碳源，還可W使用葡萄糖、薦糖、果糖、半乳糖、乳糖等糖類、含有運(yùn)些糖類的 淀粉糖化液、甘馨糖蜜、甜菜糖蜜、高級糖蜜化i曲Test MolassesKW及醋酸等有機(jī)酸、乙 醇等醇類和甘油等。
[0119] 作為氮源，可W使用氨氣、氨水、錠鹽類、尿素、硝酸鹽類、其它輔助使用的有機(jī)氮 源例如油巧類、大豆加水分解液、酪蛋白分解物、其它氨基酸、維生素類、玉米漿、酵母或酵 母提取物、肉膏、蛋白腺等膚類、各種發(fā)酵菌體及其加水分解物等。
[0120] 作為無機(jī)鹽類，可W適當(dāng)添加憐酸鹽、儀鹽、巧鹽、鐵鹽、和儘鹽等。在需要微生物 生長發(fā)育所需的特定營養(yǎng)素時(shí)，可W添加作為制品的營養(yǎng)物，或者含有該營養(yǎng)物的天然物。 而且，根據(jù)需要還可W使用消泡劑。
[0121] 本發(fā)明中，優(yōu)選培養(yǎng)液中的糖類濃度保持在5g/lW下。之所W優(yōu)選該糖類濃度保 持在5g/LW下，是為了使得培養(yǎng)液的取出導(dǎo)致的糖類的流失最小化。
[0122] 而且，微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)，通常大多在抑4~8、溫度20~50°C的范圍進(jìn)行。 培養(yǎng)液的抑能夠用無機(jī)酸或有機(jī)酸、堿性物質(zhì)、w及尿素、碳酸巧和氨氣等，調(diào)節(jié)到上述范 圍內(nèi)的預(yù)先確定的值。而且，如果需要提高氧的供給速度，可W采用在空氣中添加氧，將氧 濃度保持在21 % W上，或?qū)ε囵B(yǎng)反應(yīng)槽內(nèi)加壓，提高攬拌速度，提高通氣量等手段。
[0123] 本發(fā)明中，可W在培養(yǎng)初期進(jìn)行分批培養(yǎng)或補(bǔ)料分批培養(yǎng)，在微生物或培養(yǎng)細(xì)胞 的濃度提高后開始連續(xù)培養(yǎng)，也可W接種高濃度的菌體，在培養(yǎng)開始的同時(shí)進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。
[0124] 作為本發(fā)明可W制造的化學(xué)品（發(fā)酵生產(chǎn)物），只要是前述微生物或培養(yǎng)細(xì)胞在培 養(yǎng)液中生產(chǎn)的物質(zhì)即可，沒有限制，可W根據(jù)培養(yǎng)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞適當(dāng)選擇。作為具體 例子，可W列舉醇、有機(jī)酸、氨基酸、核酸等發(fā)酵工業(yè)中可大量生產(chǎn)的物質(zhì)。作為醇，可W列 舉乙醇、1,3-丙二醇、1,4-下二醇、甘油等，作為有機(jī)酸，可W列舉醋酸、乳酸、丙酬酸、班巧 酸、蘋果酸、衣康酸、巧樣酸，如果是核酸，可W列舉次黃巧、鳥巧等核巧、次黃巧酸、鳥巧酸 等核巧酸、W及尸胺等二胺化合物。而且，本發(fā)明還可W適用于生產(chǎn)酶、抗生素、重組蛋白質(zhì) 等物質(zhì)。
[0125] 下面，對用于獲得所希望的化學(xué)品的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，邊列舉具體的化學(xué)品邊 進(jìn)行說明。
[0126] 作為可W在本發(fā)明的生產(chǎn)乳酸時(shí)使用的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，沒有特別限制，但優(yōu) 選可W使用乳酸菌。運(yùn)里所稱的乳酸菌，可W定義為，相對于消耗的葡萄糖，產(chǎn)生對糖收率 50 % W上的乳酸的原核微生物。作為優(yōu)選的乳酸菌，可W列舉，例如，屬于乳桿菌屬 化日。1：〇6日。；[11113)、片球菌屬。6(1；[0。0。。113)、四聯(lián)球菌屬（了6化日邑6]10。0。。113)、肉食桿菌屬 (Carnobacterium)、漫游球菌屬（Vagococcus)、明串珠菌屬化euconostoc)、酒球菌屬 (Oenococcus)、奇異菌屬（Atopobium)、鏈球菌屬（Streptococcus)、腸球菌屬 化nterococcus)、乳球菌屬(Xactococcus)、或芽抱桿菌屬（8日(3；[11113)的乳酸菌。運(yùn)些乳酸 菌中，選擇乳酸的對糖收率高的乳酸菌，可優(yōu)選用于乳酸的生產(chǎn)。
[0127] 進(jìn)而，乳酸之中，還可W選擇乳酸中的レ乳酸的對糖收率高的乳酸菌。所謂レ乳 酸，是乳酸的光學(xué)異構(gòu)體的一種，可與其對映體D-乳酸明確區(qū)分。作為k乳酸的對糖收率高 的乳酸菌，可W列舉例如果汁乳桿菌化actobacillus yamanashiensis)、動(dòng)物乳桿菌 化 actobacillus animalis)、敏捷乳桿菌化 actobacillus agilis)、鳥類乳桿菌 化actobacillus aviaries)、干酪乳桿菌化actobacillus casei)、德氏乳桿菌 (Lactobacillus de化ruekii)、類干酪乳桿菌(Xactobacillus paracasei)、鼠李糖乳桿菌 化actobacillus rhamnosus)、瘤胃乳桿菌化actobacillus ruminis)、唾液乳桿菌 化actobacillus salivarius)、沙氏乳桿菌化actobacillus sharpeae)、糊精片球菌 (Pediococ州S dextrinicus)或乳酸乳球菌(Xactococ州S lactis)等，可W選擇它們，用于 k乳酸的生產(chǎn)。
[0128] 另一方面，作為可用于D-乳酸生產(chǎn)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，可W列舉德氏乳桿菌 化actobacillus delbruekii)、植物乳桿菌化actobacillus plantarum)、乳酸片球菌 (口6(1;[0。0。。113日。1(1;[1日。1:;[。;0、左乳酸芽抱乳桿菌（5901'01日。1:06日。;[11118 1日6￥01日。1:;[。113) 或菊糖芽抱乳桿菌（Sporolactobaci 1 lus inulinus)等。
[0129] 此外，本發(fā)明在制造心乳酸或D-乳酸時(shí)，可W采用人為地給予了或增強(qiáng)了乳酸生 產(chǎn)能力的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞。人為地給予或增強(qiáng)乳酸生產(chǎn)能力的方法可W是W往已知的通 過藥劑變異的方法，但優(yōu)選使用重組微生物。作為重組微生物，優(yōu)選通過導(dǎo)入心乳酸脫氨酶 基因（W下，也稱為心1畑)或D-乳酸脫氨酶基因（w下，也稱為D-L畑），給予或增強(qiáng)了微生物 或培養(yǎng)細(xì)胞的k乳酸或D-乳酸生產(chǎn)能力的重組微生物。
[0130] 作為前述重組微生物的宿主，優(yōu)選作為原核細(xì)胞的大腸桿菌、乳酸菌、和作為真核 細(xì)胞的酵母等，特別優(yōu)選酵母。酵母中優(yōu)選屬于酵母屬（Saccharomyces)的酵母，更優(yōu)選釀 酒酉奉母（Saccharomyces cerevisiae)。
[0131] 作為kLDH或D-LDH，只要是編碼具有將還原型煙酷胺腺嚷嶺二核巧酸(NADH)和丙 酬酸轉(zhuǎn)化為氧化型煙酷胺腺嚷嶺二核巧酸(魁0+)和心乳酸或D-LDH的活性的蛋白質(zhì)的心乳 酸脫氨酶或D-乳酸脫氨酶，則沒有限制。運(yùn)其中，作為^LDH，優(yōu)選可W使用人（Homo sapiens)來源或蛙來源的心0)山蛙來源的心1畑中，優(yōu)選使用屬于負(fù)子贍科(Pipidae)的蛙 來源的kLDH，屬于負(fù)子贍科的蛙中，可優(yōu)選使用非洲爪贍(Xenopus 1 aeVi S)來源的kLDH。 此外，作為D-LDH，優(yōu)選是植物乳桿菌化actobac i 1 lus Plantarum)和乳酸片球菌 (Pediococcus acidilactici)或左乳酸芽抱桿菌（Bacillus laevolacticus)來源的基因， 更優(yōu)選是左乳酸芽抱桿菌來源的基因。
[0132] 本發(fā)明可使用的レLDH或D-LDH中包括由于遺傳的多態(tài)性、誘發(fā)突變等而造成的突 變型的基因。所謂遺傳的多態(tài)性，是由于基因上的自然突變而導(dǎo)致的基因的堿基序列一部 分發(fā)生變化。而且，所謂誘發(fā)突變，是指在基因中人工導(dǎo)入突變。誘發(fā)突變有例如使用部位 特異的突變導(dǎo)入用試劑盒(Mutan-K(takara bio社制））的方法、采用隨機(jī)突變導(dǎo)入用試劑 盒（抓Diversify PCR Random Mutagenesis(化0NTECH公司制））的方法等。而且，本發(fā)明中 使用的kLDH或D-LDH只要編碼具有k乳酸脫氨酶或D-乳酸脫氨酶活性的蛋白質(zhì)，也可W在 堿基序列的一部分中存在缺失或插入。
[0133] 而且，在制造心乳酸時(shí)，從上述的分離膜3獲得的透過液中所含的心乳酸的分離和 純化，可W通過組合W往已知的濃縮、蒸饋和晶析等方法來進(jìn)行。例如，可W列舉通過將分 離膜3的透過液的抑調(diào)節(jié)到下，然后用二乙酸或乙酸乙醋等提取的方法;吸附于離子交 換樹脂，清洗后洗脫的方法;在酸催化劑的存在下使之與醇反應(yīng)，作為醋蒸饋的方法；W及 結(jié)晶為巧鹽或裡鹽的方法等。優(yōu)選地，可W列舉用蒸饋操作處理使分離膜3的透過液的水分 蒸發(fā)的濃縮心乳酸溶液的方法。其中，蒸饋時(shí)，優(yōu)選一邊供給水分一邊蒸饋W便蒸饋原液的 水分濃度固定。心乳酸水溶液在饋出后，通過加熱蒸發(fā)水分而濃縮，可W獲得目的濃度的純 化心乳酸。當(dāng)獲得含有乙醇或醋酸等低沸點(diǎn)成分的k乳酸水溶液作為饋出液時(shí)，在k乳酸 濃縮過程中除去低沸點(diǎn)成分為優(yōu)選的方式。蒸饋操作后，對于饋出液，根據(jù)需要，用離子交 換樹脂、活性碳和色譜分離等去除雜質(zhì)，還可W獲得更高純度的心乳酸。
[0134] 在與制造 D-乳酸時(shí)一樣，從上述分離膜3中獲得的透過液中所含的D-乳酸的分離 和純化可W通過組合W往已知的濃縮、蒸饋和晶析等方法來進(jìn)行。例如，可W列舉通過將分 離膜3的透過液的抑調(diào)節(jié)到下，然后用二乙酸或乙酸乙醋等提取的方法;吸附于離子交 換樹脂，清洗后洗脫的方法;在酸催化劑的存在下使之與醇反應(yīng)，作為醋蒸饋的方法；W及 結(jié)晶為巧鹽或裡鹽的方法等。優(yōu)選地，可W列舉可用蒸饋操作處理使分離膜3的透過液的水 分蒸發(fā)的濃縮D-乳酸溶液的方法。其中，蒸饋時(shí)，優(yōu)選一邊供給水分一邊蒸饋W便蒸饋原液 的水分濃度固定。D-乳酸水溶液在饋出后，通過加熱蒸發(fā)水分而濃縮，可W獲得目的濃度的 純化D-乳酸。當(dāng)獲得含有低沸點(diǎn)成分（乙醇、醋酸等）的D-乳酸水溶液作為饋出液時(shí)，在D-乳 酸濃縮過程中除去低沸點(diǎn)成分為優(yōu)選的方式。蒸饋操作后，對于饋出液，根據(jù)需要，用離子 交換樹脂、活性碳和色譜分離等去除雜質(zhì)，還可W獲得更高純度的D-乳酸。
[0135] 接著，作為本發(fā)明的可W用于制造乙醇的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，沒有特別限制，但可 W使用例如，屬于酵母（Saccharomyces)屬、克魯維酵母化luyveromyces)屬或裂殖酵母菌 (Schizosaccharomyces)屬的酵母。運(yùn)其中可合適地使用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)。而且，還可W優(yōu)選使用屬于乳桿菌屬(Xactobacillus)或 發(fā)酵單胞菌屬（Zymomonas)屬的細(xì)菌。運(yùn)其中，可合適地使用短乳桿菌化actobacillus brevis)、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)。
[0136] 可W在乙醇的生產(chǎn)中使用的微生物或者培養(yǎng)細(xì)胞可W是人為地提高了乙醇生產(chǎn) 能力的微生物或者培養(yǎng)細(xì)胞。具體地也可W是，由于突變或基因重組而導(dǎo)致部分性質(zhì)改變 的微生物或者培養(yǎng)細(xì)胞。作為部分性質(zhì)改變的微生物或者培養(yǎng)細(xì)胞的一例，可W列舉整合 了屬于根霉屬霉菌的葡糖淀粉酶基因而獲得了生淀粉的同化能力的酵母(微生物，3:555- 564(1987))。
[0137] 而且，從上述分離膜3獲得的透過液中所含的乙醇的分離和純化，可合適地使用例 如，通過蒸饋法進(jìn)行的純化法，或使用NF、R0膜、或者沸石制的分離膜的濃縮、純化法。
[0138] 作為可W在本發(fā)明的丙酬酸的生產(chǎn)中使用的微生物或者培養(yǎng)細(xì)胞，沒有特別限 審Ij，優(yōu)選可W使用例如，屬于假單胞菌(Pseudomonas)屬、棒桿菌（Corynebacter ium)屬、埃 希氏菌化scherichia)屬或不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)屬的細(xì)菌。更優(yōu)選可W使用巧光假單 胞菌（Pseudomonas fuluorescens)、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌 (Escherichia coli)等細(xì)菌。
[0139] 可W用于丙酬酸生產(chǎn)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞可W是人為提高了丙酬酸生產(chǎn)能力的 微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，也可W使用由于突變或基因重組而導(dǎo)致部分性質(zhì)發(fā)生改變的微生物或 培養(yǎng)細(xì)胞。例如，還可W優(yōu)選使用突變或缺失了通過氧化憐酸化而直接參與ATP生產(chǎn)的 ATPase基因的細(xì)菌。而且，還可W優(yōu)選使用霉菌、酵母等。例如，可W使用屬于酵母 (Saccharomyces )屬、球擬酵母屬（Torn lops is )、假絲酵母屬（Candida)、裂權(quán)菌屬 (Schizophyllum)的霉菌或酵母。更優(yōu)選，可W使用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、Saccha;romyces copsis、光滑假絲酵母（Candida glabra1:a)、解脂假絲酵母 (Candida lipolytica)、光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata)、裂權(quán)菌（Schizophyllum commune)等霉菌或酵母制備丙酬酸。
[0140] 而且，從上述分離膜3獲得的透過液中所含的丙酬酸的分離和純化，可W通過使用 陰離子交換柱的方法進(jìn)行。例如，可合適地使用特開平6-345683中公開的采用弱堿性離子 交換體的純化法。
[0141] 作為可W在本發(fā)明的班巧酸的生產(chǎn)中使用的微生物或者培養(yǎng)細(xì)胞，可合適地使用 屬于厭氧螺菌(Anaerobiospir ilium)屬或放線桿菌(Act inobacillus)屬的細(xì)菌。具體而 言，可W列舉美國專利第5 1 4 3 8 3 3號說明書中記載的產(chǎn)班巧酸厭氧螺菌 (Anaerobiospirilium succiniciproducens)或由James B.Mckinlay公開的班巧酉細(xì)義線桿 菌（Actinobacillus succinogenes)(Appl.Microbiol.Biotechno 1.,71,6651-6656 (2005)。而且，還可W使用棒桿菌（Corynebacterium)屬或短桿菌(Brevibacterium)屬等棒 狀桿菌型細(xì)菌(Coryneform bacterium)和大腸桿菌等。棒狀桿菌型細(xì)菌中，合適的是谷氨 酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌（Brevibacterium f lavum)和乳發(fā) 酉奉短桿菌（Brevibacterium lactofermentum)等。
[0142] 可W用于班巧酸生產(chǎn)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞可W是人為地提高了乙醇生產(chǎn)能力的 微生物或培養(yǎng)細(xì)胞。作為具體例子，可W使用通過基因重組而導(dǎo)致班巧酸的生產(chǎn)能力得到 了改善的微生物，由此也可使班巧酸生產(chǎn)性提高。作為運(yùn)種微生物，可W使用例如特開 2005-27533號公報(bào)中記載的缺失了乳酸脫氨酶的黃色短桿菌MJ233AB-4U保藏號陽RM BP- 1498) 、上述非專利文獻(xiàn) 1 中記載的谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum) 、美國專 利第5770435號說明書中記載的丙酬酸甲酸裂解酶(pyruvate formate lyase)和乳酸脫氨 酶的缺失株一大腸桿菌AFP111株等。
[0143] 而且，由上述的分離膜3獲得的透過液中含有的班巧酸的分離和純化，可W使用常 規(guī)的班巧酸純化法。例如，可合適地使用特開2005-333886號公報(bào)中公開的組合了水分解電 滲析處理和減壓濃縮、晶析的純化法。
[0144] 作為可W在本發(fā)明的衣康酸的生產(chǎn)中使用的微生物或者培養(yǎng)細(xì)胞，沒有特別限 審IJ，作為具體例子，可W優(yōu)選使用霉菌或者酵母。更優(yōu)選可W列舉采用屬于曲霉屬 (Aspergillus)或者黑粉菌屬Wstilago)的霉菌和屬于假絲酵母屬（Candida)、紅酵母屬 (Rhodotorula)的酵母進(jìn)行衣康酸的生產(chǎn)。運(yùn)其中，在衣康酸的生產(chǎn)中優(yōu)選使用±曲霉 (Aspergillus terreus)、解烏頭酸曲霉（Aspergillus itaconicus)、玉米黑粉菌 (Ustilago maydis)、狗牙根黑粉菌（Ustilago cynodontis)和拉賓黑粉菌（Ustilago rabenhorstina)的霉菌、或者南極假絲酵母Kandia an1:a;rctica)。
[0145] 而且，由上述的分離膜3獲得的透過液中含有的衣康酸的分離和純化優(yōu)選可W采 用超濾或電滲析進(jìn)行。例如，可合適地使用特公昭-50958號公報(bào)中公開的通過采用超濾或 鹽型陽離子交換樹脂膜的電滲析進(jìn)行的純化法。
[0146] 作為可W在本發(fā)明的1,3-丙二醇的生產(chǎn)中使用的微生物或者培養(yǎng)細(xì)胞，沒有特別 限制，作為具體例子，可W列舉，野生型株中，具有由甘油合成1,3-丙二醇的能力的屬于克 雷伯氏菌化lebsiel la)屬、梭菌(Clostridi皿)屬、乳桿菌(Lactobacillus)屬的微生物。
[0147] 在由甘油制造1,3-丙二醇時(shí)，微生物優(yōu)選含有(a)編碼具有甘油脫水酶活性的多 膚的至少一個(gè)基因；（b)編碼甘油脫水酶再活性化因子的至少一個(gè)基因；和(C)編碼具有將 3-徑基丙醒轉(zhuǎn)換成1，3-丙二醇的非特異的催化劑活性的至少一個(gè)基因。
[0148] 更優(yōu)選使用可W由葡萄糖生產(chǎn)1,3-丙二醇的重組微生物。作為重組微生物的宿 主，優(yōu)選為選自于克雷伯氏菌屬（Klebsiella)、梭菌屬（Clostridium)、乳桿菌屬 化日(：1:〇6日(3；[11113)、巧樣酸細(xì)菌屬（〔八1'06日(31日1')、腸桿菌屬化]11日1'〇6日(31日1')、氣桿菌屬 (Aerobacter)、曲霉屬（Aspergillus)、酵母屬（Saccharomyces)、裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces)、接合酵母屬（Zygosaccharomyces)、畢赤酵母屬（Pichia)、克魯維 酵母屬化luyveromyces)、假絲酵母屬（Candida)、漢遜酵母屬（Hansenula)、德己利酵母屬 (Debaryomyces)、毛霉屬（Mucor)、球擬酵母屬（Torulopsis)、甲基細(xì)菌屬 (Methylobacter)、沙口 氏菌屬（Salmonella)、芽抱桿菌屬（Bacillus)、氣桿菌屬 (Aerobacter)、鏈霉菌屬（Streptomyces)、埃希氏菌屬化schericia)和假單胞菌屬 (Pseudomonas)中的重組微生物，更優(yōu)選為大腸桿菌。
[0149] 可W由葡萄糖生產(chǎn)1,3-丙二醇的重組微生物優(yōu)選為含有例如(a)編碼具有甘油- 3-憐酸脫氨酶活性的多膚的至少一個(gè)基因；和(b)編碼具有甘油-3-憐酸酶活性的多膚的至 少一個(gè)基因的重組微生物。進(jìn)而，更優(yōu)選含有甘油脫水酶再活性化因子是由從化a調(diào)節(jié)子中 分離的orfX和orfZ編碼的基因的重組微生物。進(jìn)而，更優(yōu)選地，重組微生物為缺失了甘油激 酶活性和/或甘油脫氨酶活性和/或憐酸丙糖異構(gòu)酶活性的重組微生物。
[0150] 而且，由上述的分離膜3獲得的透過液中含有的1,3-丙二醇的分離和純化可W通 過濃縮、晶析進(jìn)行。例如，可W合適地使用特開平-35785號公報(bào)中公開的采用減壓濃縮、晶 析的純化法。
[0151] 作為可W在本發(fā)明的尸胺的生產(chǎn)中使用的微生物或者培養(yǎng)細(xì)胞，沒有特別限制， 但作為具體例子，優(yōu)選是微生物所具有的賴氨酸脫簇酶和/或賴氨酸.尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 的酶活性增強(qiáng)的微生物。更優(yōu)選地，可W列舉整合了編碼賴氨酸脫簇酶和/或賴氨酸?尸胺 反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的重組微生物。更優(yōu)選地，可W列舉整合了 1種或2種W上的編碼賴氨 酸脫簇酶的基因的微生物。
[0152] 在用重組微生物制造尸胺時(shí)，優(yōu)選W大腸桿菌或棒狀桿菌型細(xì)菌作為宿主的重組 微生物，更優(yōu)選的是具有賴氨酸脫簇酶活性且具有高絲氨酸營養(yǎng)缺陷型或S-(2-氨乙基)- k半脫氨酸耐性中的至少任一種特征的棒狀桿菌型細(xì)菌。而且，棒狀桿菌型細(xì)菌中，更優(yōu)選 選自于棒桿菌屬或短桿菌屬，更優(yōu)選谷氨酸棒桿菌（Corynebacuterium gulutamicum)。進(jìn) 一步地，優(yōu)選微生物缺失高絲氨酸脫氨酶活性，更優(yōu)選由于基因插入突變的發(fā)生而導(dǎo)致缺 失高絲氨酸脫氨酶活性。
[0153] 而且，由上述的分離膜3獲得的透過液中含有的尸胺的分離和純化可W通過組合 了濃縮、蒸饋和晶析等W往已知的方法進(jìn)行。例如，可合適地使用特開2004-222569號公報(bào) 中公開的采用晶析的純化法。本發(fā)明中，可W通過連續(xù)培養(yǎng)時(shí)可使用的酸制成各種聚合物 原料，在需要良好純度的聚合物原料用途中，優(yōu)選使用通過晶析進(jìn)行的純化方法。如果是用 鹽酸維持培養(yǎng)液的pH，則可W從前述透過液中通過晶析回收尸胺二鹽酸鹽。更優(yōu)選地，可W 列舉在連續(xù)培養(yǎng)時(shí)用二簇酸維持培養(yǎng)液的pH，回收尸胺二簇酸鹽。此時(shí)，二簇酸優(yōu)選是官能 團(tuán)只有2個(gè)簇基的脂肪族和/或芳香族的二簇酸，更優(yōu)選是己二酸、癸二酸、1,12-十二燒二 簇酸、班巧酸、間苯二酸或?qū)Ρ蕉嶂械娜我弧?br>[0154] 作為可W在本發(fā)明的核酸的生產(chǎn)中使用的微生物或者培養(yǎng)細(xì)胞，沒有特別限制， 可W是從自然界分離的原來核酸的生產(chǎn)能力就高的微生物或者培養(yǎng)細(xì)胞，也可W是人為地 提高了生產(chǎn)能力的原核微生物。具體地，可W是由于突變或基因重組而導(dǎo)致部分性質(zhì)被改 變的微生物或者培養(yǎng)細(xì)胞。
[0155] 運(yùn)其中，對于前述部分性質(zhì)的改變進(jìn)行說明。為了有效生產(chǎn)核酸，需要生物合成核 酸并累積，釋放到生物體外。因此，通過增強(qiáng)參與核酸的生物合成途徑的酶、降低參與核酸 的分解途徑的酶活性，W及改變與核酸釋放到生物體外相關(guān)的蛋白質(zhì)、或者生物體膜組成 等等、改變微生物或者培養(yǎng)細(xì)胞的性質(zhì)，可有效制備生產(chǎn)核酸的微生物或者培養(yǎng)細(xì)胞。
[0156] 具體而言，在生產(chǎn)次黃巧時(shí)，理想的是微生物或培養(yǎng)細(xì)胞不具有腺巧酸班巧酸合 酶活性或微弱。而且，理想的是不具有次黃巧酸脫氨酶活性或微弱。而且，理想的是不具有 核巧酶活性或微弱。在生產(chǎn)鳥巧時(shí)，理想的是微生物或培養(yǎng)細(xì)胞不具有腺巧酸班巧酸合酶 活性或微弱。而且，理想的是不具有鳥巧酸還原酶活性或微弱。而且，理想的是不具有核巧 酶活性或微弱。而且，理想的是不具有核巧酸酶活性或微弱。在生產(chǎn)尿巧時(shí)，理想的是微生 物或培養(yǎng)細(xì)胞不具有尿巧憐酸化酶活性或微弱。在生產(chǎn)胞巧時(shí)，理想的是不具有胞巧脫氨 酶活性或微弱，理想的是不具有高絲氨酸脫氨酶活性或微弱。
[0157] 作為可W在本發(fā)明制造核酸時(shí)使用的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，可W優(yōu)選使用棒狀桿菌 型細(xì)菌或枯草菌。例如，在生產(chǎn)次黃巧時(shí)，作為棒狀桿菌型細(xì)菌，可W列舉屬于棒桿菌屬 (Genus Corynebacterium)的細(xì)菌，在棒桿菌屬中優(yōu)選使用谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium gulutamicum)、產(chǎn)氨棒桿菌（Corynebacterium ammoniagenes)、 Coryneb曰cterium gu曰nof曰ciens或Coryneb曰cterium Petrophilium〇此夕Κ 作為枯草菌，可 W列舉例如，屬于芽抱桿菌屬(Bacillus)的細(xì)菌，其中優(yōu)選使用枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽抱桿菌（Bacillus liqueniformis)、短小芽抱桿菌（Baci 1 lus pumilus)。而且，在生產(chǎn)鳥巧時(shí)，作為棒狀桿菌型細(xì)菌，可W列舉屬于棒桿菌 (Corynebacterium)屬的細(xì)菌，運(yùn)其中優(yōu)選谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium gulutamicum),作為枯草菌，可W列舉例如屬于芽抱桿菌(Bacillus)屬的細(xì)菌，運(yùn)其中優(yōu)選 使用枯草芽抱桿菌（Bacillus subtil is)、地衣芽抱桿菌（Bacillus liquenif ormis)或短 小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)。此外，在生產(chǎn)尿巧或胞巧時(shí)，作為枯草菌，運(yùn)其中可優(yōu)選 使用屬于芽抱桿菌（Bacillus)屬的細(xì)菌，其中優(yōu)選使用枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)。
[0158] 而且，由上述的分離膜3獲得的透過液中含有的核酸的分離和純化，優(yōu)選通過組合 了離子交換樹脂處理法、濃縮冷卻晶析法、膜分離法和其它方法進(jìn)行。為了除去雜質(zhì)，可W 使用常規(guī)方法的活性碳吸附法和重結(jié)晶法進(jìn)行純化。
[0159] 在本發(fā)明制造氨基酸時(shí)，作為該氨基酸，可W列舉優(yōu)選心蘇氨酸α-賴氨酸α-谷 氨酸、k色氨酸、心異亮氨酸α-谷氨酷胺、k精氨酸α-丙氨酸組氨酸α-脯氨酸、心苯 丙氨酸天冬氨酸、k酪氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸。
[0160] 作為例如制造 L-蘇氨酸時(shí)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，可W使用屬于埃希氏菌屬 化scherichia)、普羅威登斯菌屬（Providencia)、棒桿菌屬（Corynebacterium)、短桿菌屬 (Brevibacterium)或沙雷氏菌屬（Serratia)中的細(xì)菌。運(yùn)其中，特別優(yōu)選的細(xì)菌是大腸桿 菌化scherichia coli)、雷氏普羅威登斯菌（Providencia rettgeri)、谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌（Brevibacterium flavum)、乳發(fā)酵短桿菌 (Brevibacterium lactofermentum)或粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)。
[0161] 作為可W在制造 k賴氨酸或心谷氨酸時(shí)使用的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選谷氨酸棒 桿菌（Corynebacterium gulutami州m)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)或乳發(fā)酵短 桿菌（Brevibacterium lactofermentum)。
[0162] 作為在制造 L -色氨酸時(shí)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium gulutamicum)、黃色短桿菌（Brevibacterium flavum)、乳發(fā)酵短桿菌 (&rev;Lbacte;rium lactofermentum)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、解淀粉芽抱桿 菌(Bacillus amyloliquefaciens)或大腸桿菌化scherichia coli)。
[0163] 作為制造 L -異亮氨酸時(shí)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium gulutamicum)、黃色短桿菌（Brevibacterium flavum)、乳發(fā)酵短桿菌 (Brevibacterium lactofermentum)或粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)。
[0164] 作為制造 L -谷氨酷胺時(shí)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium gulutamicum)、黃色短桿菌（Brevibacterium f lavum)、乳發(fā)酵短桿菌 (Brevibacterium lactofermentum)或里加黃桿菌（Flavobacterium rigense)。
[0165] 作為制造心精氨酸時(shí)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium gulutami cum)、黃色短桿菌（Brevibacterium f lavum)、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)、大腸桿菌化 scherichia col i)或枯草芽抱桿菌（Bacillus subtil is) D
[0166] 作為制造^丙氨酸時(shí)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選黃色短桿菌（Brevibacterium flavum)或氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans)
[0167] 作為制造心組氨酸時(shí)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium gulutamicum)、黃色短桿菌（Brevibacterium f lavum)、產(chǎn)氨短桿菌（Brevibacterium ammoniagenes)、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)、大腸桿菌化scherichia coli)、枯 草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)或天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor)。
[0168] 作為制造心脯氨酸時(shí)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium gulutamicum) ^Kurthia catenaforma、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)或大腸桿菌 (Escherichia coli)〇
[0169] 作為制造^苯丙氨酸或^酷氨酸時(shí)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium gulutamicum)、黃色短桿菌（Brevibacterium f lavum)、乳發(fā)酵短桿菌 (Brevibacterium lactofermentum)或大腸桿菌化scherichia coli) 〇
[0170] 作為制造^天冬氨酸時(shí)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選黃色短桿菌（Brevibacterium flavum)、巨大芽胞桿菌（Bacillus megatherium)、大腸桿菌化scherichia coli)或焚光假 單胞菌（Pseudomonas f luorescens) 〇
[0171] 作為制造蛋氨酸時(shí)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium gulutamicum)〇
[0172] 作為制造絲氨酸時(shí)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium gulutamicum)、黃色短桿菌（Brevibacterium f lavum)、乳發(fā)酵短桿菌（Brevibacterium lactofermentum)或氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxy dans) D
[0173] 作為制造娜氨酸時(shí)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選乳發(fā)酵短桿菌（Brevibacterium lactofermentum)、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)或肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae)〇
[0174] 作為制造亮氨酸時(shí)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium gulutamicum)、乳發(fā)酵短桿菌（Brevibacterium lactofermentum)或粘質(zhì)沙雷氏菌 (Serratia marcescens)〇
[0175] 如上所述的可^用于制造氨基酸的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，可W從自然界中分離原本 氨基酸生產(chǎn)能力就高的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，也可W是對例示的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞人為提高 了其生產(chǎn)能力的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞。此外，還可W是由于突變或基因重組而導(dǎo)致部分性質(zhì) 發(fā)生改變的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞。
[0176] 作為部分性質(zhì)發(fā)生改變的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的一個(gè)例子，有特開平2-219582中 記載的^蘇氨酸生產(chǎn)性提高了的雷氏普羅威登斯菌(Providencia rettgeri)、和特表平 3 -500486中記載的1^-丙氨酸生產(chǎn)性提高了的谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium gulutamicum)等D
[0177] 下面，對本發(fā)明中可作為分離膜優(yōu)選使用的多孔性膜進(jìn)行說明。
[0178] 作為多孔性膜，可W使用W陶瓷等無機(jī)材料、樹脂等有機(jī)材料作為原材料的多孔 性膜，但更優(yōu)選使用含有多孔質(zhì)樹脂層的多孔性的分離膜。運(yùn)種多孔性膜，在多孔質(zhì)基材的 表面上具有起分離功能層作用的多孔質(zhì)樹脂層。多孔質(zhì)基材支持多孔質(zhì)樹脂層，給予分離 膜強(qiáng)度。多孔質(zhì)樹脂層可W浸透在多孔質(zhì)基材中，也可W不浸透在多孔質(zhì)基材中，但從強(qiáng)度 方面考慮，優(yōu)選采用浸透在多孔質(zhì)基材中的膜。
[0179] 多孔質(zhì)基材的材質(zhì)由有機(jī)材料和/或無機(jī)材料等構(gòu)成，其中理想使用有機(jī)纖維。優(yōu) 選的多孔質(zhì)基材是使用纖維素纖維、Ξ乙酸纖維素纖維、聚醋纖維、聚丙締纖維和聚乙締纖 維等有機(jī)纖維構(gòu)成的織布或無紡布等。其中優(yōu)選使用密度控制比較容易、制造也容易的便 宜的無紡布。
[0180] 多孔質(zhì)樹脂層，如上所述，起分離功能層的作用，可W合適地使用有機(jī)高分子膜。 作為有機(jī)高分子膜的材質(zhì)，可W列舉例如，聚乙締類樹脂、聚丙締類樹脂、聚氯乙締類樹脂、 聚偏氣乙締類樹脂、聚諷類樹脂、聚酸諷類樹脂、聚丙締臘類樹脂、聚締控類樹脂、纖維素類 樹脂和Ξ乙酸纖維素類樹脂等。有機(jī)高分子膜可W是W運(yùn)些樹脂作為主要成分的樹脂混合 物。運(yùn)其中，作為主要成分，是指含有50重量％^上、優(yōu)選60重量％ W上的該成分。其中，作 為構(gòu)成多孔質(zhì)樹脂層的膜原材料，優(yōu)選由溶液來制膜是容易的、且物理的耐久性和耐藥性 也優(yōu)異的聚氯乙締類樹脂、聚偏氣乙締類樹脂、聚諷類樹脂、聚酸諷類樹脂、聚丙締臘類樹 脂或聚締控類樹脂，更優(yōu)選聚偏氣乙締類樹脂或聚締控類樹脂，最優(yōu)選聚偏氣乙締類樹脂 或W其作為主要成分的樹脂。
[0181] 運(yùn)里，作為聚偏氣乙締類樹脂，優(yōu)選使用偏氣乙締的均聚物或與可W與偏氣乙締 共聚的乙締類單體的共聚體。作為可W與偏氣乙締共聚的乙締類單體，可W列舉四氣乙締、 六氣丙締和Ξ氯一氣乙締等。此外，作為聚締控類樹脂，可W列舉聚乙締、聚丙締、聚氯乙締 或聚氯丙締，但優(yōu)選聚氯乙締。
[0182] W下，例示多孔性膜的制作方法的概要，并進(jìn)行說明。
[0183] 首先，對多孔性膜中的平膜的制作方法的概要進(jìn)行說明。平膜是通過W下方式獲 得的，即在多孔質(zhì)基材的表面上形成含有構(gòu)成多孔質(zhì)樹脂層的樹脂和溶劑的制膜原液的被 膜，同時(shí)使該制膜原液浸潰于多孔質(zhì)基材中，然后，只使具有被膜的多孔質(zhì)基材的被膜側(cè)表 面與含有非溶劑的凝固浴接觸，使樹脂凝固，同時(shí)在多孔質(zhì)基材的表面上形成多孔質(zhì)樹脂 層。此時(shí)，盡管可W根據(jù)用途來選擇，但多孔質(zhì)基材的平均厚度優(yōu)選為50皿W上3000皿W 下，而且多孔質(zhì)樹脂層的平均厚度在上5000ymW下，更優(yōu)選為50ymW上2000ymW下 的范圍。
[0184] 下面，對中空纖維膜的制造方法的概要進(jìn)行說明。中空纖維膜可W通過從二重管 式金屬口外側(cè)的管吐出含有由構(gòu)成多孔質(zhì)樹脂層的樹脂和溶劑構(gòu)成的制膜原液，同時(shí)從二 重管式金屬口內(nèi)側(cè)的管吐出中空部形成用流體，然后在冷卻浴中冷卻固化的方式制作。此 時(shí)，中空纖維的內(nèi)徑優(yōu)選在200ymW上5000ymW下的范圍，多孔質(zhì)樹脂層的膜厚優(yōu)選在20μπι W上2000ymW下的范圍。此外，在中空纖維的內(nèi)部還可W含有由有機(jī)纖維或無機(jī)纖維制成 筒狀的織物或編物。
[0185] 在獲得的中空纖維膜的外表面上還可W涂覆(層疊)新的多孔性樹脂層。運(yùn)種多孔 質(zhì)樹脂層的層疊可W是為了使中空纖維膜的性質(zhì)例如親水性或疏水性、細(xì)孔徑等變化成所 希望的性質(zhì)而進(jìn)行的。
[0186] 運(yùn)種在表面上層疊的多孔質(zhì)樹脂層可W通過W下方式制造，即通過使樹脂溶解于 溶劑中的原液與含有非溶劑的凝固浴接觸，使樹脂凝固。層疊的樹脂的材質(zhì)可優(yōu)選使用例 如與上述多孔質(zhì)樹脂層的材質(zhì)同樣的材質(zhì)。此外，對層疊方法沒有特別限定，可W將中空纖 維膜浸潰于原液中，也可W在中空纖維膜的表面上涂布原液，層疊后，通過擠出付著的原液 的一部分，用氣刀吹跑，來調(diào)節(jié)層疊量。
[0187] 本發(fā)明中使用的多孔性膜的平均細(xì)孔徑優(yōu)選O.OlymW上不到Ιμπι。多孔性膜的平 均細(xì)孔徑如果O.OUimW上且不到him,具有不容易發(fā)生由發(fā)酵時(shí)使用的菌體導(dǎo)致的堵塞，且 長時(shí)間穩(wěn)定地維持過濾性能的性能。而且，如果多孔性膜的平均細(xì)孔徑在O.OlymW上且不 至Ijlym，可W實(shí)現(xiàn)不漏出微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的高排除率，并實(shí)現(xiàn)長時(shí)間保持高透水性。
[0188] 如果接近微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的大小，由于存在微生物或培養(yǎng)細(xì)胞直接堵塞孔的情 況，因此多孔性膜的平均細(xì)孔徑優(yōu)選不到Ιμπι。此外，多孔性膜的平均細(xì)孔徑，為了防止微生 物或培養(yǎng)細(xì)胞的漏出、即排除率降低的運(yùn)種麻煩的發(fā)生，優(yōu)選與微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的大小 相比，不會(huì)過大的孔徑。因此，微生物或培養(yǎng)細(xì)胞中，在使用細(xì)胞小的酵母或細(xì)菌等時(shí)，平均 細(xì)孔徑更優(yōu)選在0.4μπι W下，更優(yōu)選在0.2μπι W下。此外，存在微生物或培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)目的化 學(xué)品W外的物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、多糖類等容易凝集的物質(zhì)的情況，而且還存在由于培養(yǎng)液中 的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的一部分死亡而導(dǎo)致產(chǎn)生細(xì)胞的破碎物的情況。為了避免運(yùn)些物質(zhì)導(dǎo) 致的多孔性膜的堵塞，平均細(xì)孔徑更合適的是在O.lymW下。
[0189] 由W上可見，本發(fā)明的多孔性膜的平均細(xì)孔徑優(yōu)選在0.4ymW下，更優(yōu)選在0.2μπι W下，最優(yōu)選在O.UimW下。
[0190] -方面，平均細(xì)孔徑如果過小，多孔性膜的透水性能則降低，膜即使不被污染，也 無法進(jìn)行有效的運(yùn)轉(zhuǎn)，因此本發(fā)明中多孔性膜的平均細(xì)孔徑優(yōu)選在0.0 lymW上。更優(yōu)選在 0.02ymW上，更合適的是0.04ymW上。
[0191] 運(yùn)里，平均細(xì)孔徑可W通過測定在倍率10,000倍的掃描型電子顯微鏡觀察下，在 9.2皿X 10.4皿的范圍內(nèi)可W觀察到的所有細(xì)孔的直徑，進(jìn)行平均后求得。而且，在細(xì)孔不 成圓狀時(shí)，用圖像處理裝置等，求出與細(xì)孔的面積相同面積的圓（等價(jià)圓），W等價(jià)圓直徑作 為細(xì)孔的直徑。
[0192] 本發(fā)明中可W使用的分離膜的細(xì)孔徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差越小，即細(xì)孔徑大小的分布越 窄，則越好。優(yōu)選細(xì)孔徑的大小的分布窄，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0. lymW下。細(xì)孔徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差小，即 細(xì)孔徑的大小一致的，能夠獲得均一特性的透過液，而且裝置的運(yùn)轉(zhuǎn)管理還變得容易了。
[0193] 細(xì)孔徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差〇可^通過下述（式5)計(jì)算得出，該式中W在上述的9.2μπιΧ 10.4WI1范圍內(nèi)能夠觀察到的細(xì)孔數(shù)作為Ν，W測定的各個(gè)直徑作為Xk，W細(xì)孔直徑的平均值 作為 X(ave)。
[0194] [數(shù)引
[0195]
[0196] 在本發(fā)明使用的分離膜中，含有化學(xué)品的培養(yǎng)液的透過性是重要的性能之一，可 w采用使用前的分離膜的純水透過系數(shù)作為透過性的指標(biāo)。本發(fā)明中，分離膜的純水透過 系數(shù)使用經(jīng)反滲透膜處理的25°C的溫度的純化水，W落差高度Im測定透水量計(jì)算時(shí)，優(yōu)選 為lXl(TiV/V/s/hW上。而且，為了獲得實(shí)用上足夠的透過液量，優(yōu)選純水透過系數(shù)為2 X lO-V/W/s/化 W上6 X l〇-7m3/m2/s/F*aW 下，更優(yōu)選2 X lO-V/W/s/化 W上2 X lO-VV m^s/F*aW下。
[0197] 本發(fā)明中使用的分離膜的膜表面粗糖度是影響分離膜堵塞的因子。為了使分離膜 的剝離系數(shù)和膜抵抗適當(dāng)降低，W更低的膜間差壓進(jìn)行化學(xué)品的制造，分離膜的膜表面粗 糖度優(yōu)選在0 . lymW下。由于通過抑制堵塞，可W實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定地制造化學(xué)品，因此優(yōu)選表面粗 糖度越小越好。
[0198] 而且，膜表面粗糖度是為了使附著于分離膜表面的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞容易由于攬 拌或通過循環(huán)管產(chǎn)生的液流形成的膜面清洗效果而容易剝離的因子之一。根據(jù)運(yùn)種觀點(diǎn)， 優(yōu)選分離膜的膜表面粗糖度越小越好，優(yōu)選在0. lymW下。表面粗糖度如果在0. himW下，附 著于膜上的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞就容易剝離。
[0199] 此外，通過將多孔性膜的膜表面粗糖度達(dá)到O.lymW下，在微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的過 濾中，能夠使膜表面上發(fā)生的剪切力降低，抑制對微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的破壞。其結(jié)果是，由 于分離膜的堵塞也被抑制，因此可W實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定的過濾。
[0200] 運(yùn)里，所謂膜表面粗糖度，是與膜面方向垂直方向的膜表面變動(dòng)的平均值，如下所 述，可W使用下述的原子力顯微鏡裝置(AFM)測定。
[0201 ]裝置:原子力顯微鏡裝置(Digital Instruments(株）制Nanoscope Ilia)
[020^ 條件
[0203] 探針：SiN懸臂（Digital Instruments(株）制）
[0204] 掃描模式接觸模式(氣中測定）
[0205] 水中輕敲(水中測定）
[0206] 掃描范圍10μπι、25μπι四方(氣中測定）
[0207] 5μπι、10μπι四方(水中測定）
[020引掃描分辨率512X512
[0209] 樣品制備:測定時(shí)的膜樣品，常溫下浸潰在乙醇中15分鐘后，浸潰于R0水中24小時(shí) 并洗凈后，風(fēng)干再用。所謂R0水，是采用一種濾膜即反滲透膜(R0膜)進(jìn)行過濾，排除了離子 和鹽類等的雜質(zhì)的水。R0膜的孔的大小大概在2nmW下。
[0210] 根據(jù)上述AFM獲得的各點(diǎn)的Z軸方向的高度，用下述的（式6)計(jì)算膜表面粗糖度 drough 〇
[0211] [數(shù) 6]
[0212]
[0213] Drcmgh:表面粗糖度（皿）
[0214] Zn:Z軸方向的高度(μπι)
[0215] 旁;掃描范圍的平均高度(皿）
[0216] Ν:現(xiàn)憶樣品數(shù)
[0217] 上述運(yùn)種分離膜可W配合膜分離槽的形狀，適當(dāng)加工形狀。例如，平膜形態(tài)的分離 膜可W通過與另外準(zhǔn)備的支持體組合來制成圖3所示的運(yùn)種分離膜元件。此外，通過用樹脂 等材料來粘著、封閉中空纖維膜的中空部，可W制成圖4所示的分離膜元件。另外，本發(fā)明 中，從單位體積的膜面積的設(shè)置有利運(yùn)種觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選使用中空纖維膜。
[0218] W下，采用附圖，對運(yùn)些分離膜元件的概要進(jìn)行說明。
[0219] 圖3是用于說明采用平膜形態(tài)的分離膜的分離膜元件的一個(gè)實(shí)施方案的概要斜視 圖。分離膜元件，如圖3所示，由在具有剛性的支持板18的兩面依次配置流路材料19和分離 膜20而構(gòu)成。支持板18在其兩面具有凹部21。分離膜20過濾培養(yǎng)液。流路材料19是使經(jīng)分離 膜20過濾的透過液有效流到支持板18的材料。流到支持板18的含有生產(chǎn)物的透過液通過支 持板18的凹部21，經(jīng)作為排出設(shè)備的集液管22,被取出到連續(xù)培養(yǎng)裝置外部。運(yùn)里，可W使 用W水位差壓為代表，累、通過液體或氣體等進(jìn)行的吸濾、或?qū)ρb置系統(tǒng)內(nèi)加壓等方法，作 為取出透過液的動(dòng)力。
[0220] 而且，在配合培養(yǎng)槽需要增大膜面積時(shí)，可W通過層疊運(yùn)種分離膜元件來增大膜 面積。
[0221] 圖4是用于說明使用中空纖維形態(tài)的分離膜的分離膜元件的概要斜視圖，其主要 由支持板18,中空纖維形態(tài)的分離膜20,上部樹脂密封層23和下部樹脂密封層24構(gòu)成。分離 膜20被上部樹脂密封層23和下部樹脂密封層24支撐成束狀被粘著和固定在支持板18上。由 下部樹脂密封層24進(jìn)行的粘著和固定化形成了密封中空纖維形態(tài)的分離膜20的中空部，防 止培養(yǎng)液漏出的結(jié)構(gòu)。另一方面，上部樹脂密封層23不密封中空纖維形態(tài)的分離膜20的中 空部，中空部和集液管22連接。該分離膜元件可W通過支持板18設(shè)置在連續(xù)培養(yǎng)裝置內(nèi)。由 分離膜20過濾的透過液通過中空纖維膜的中空部，經(jīng)集液管22,被取出到連續(xù)培養(yǎng)裝置外 部。作為用于取出透過液的動(dòng)力，可W使用水位差壓、累、通過液體或氣體等進(jìn)行的吸濾、或 對裝置系統(tǒng)內(nèi)加壓等方法。
[0222] 具備分離膜的膜分離槽2理想的是可W進(jìn)行高壓蒸汽滅菌的，運(yùn)樣可W避免雜菌 的污染。本發(fā)明的所謂高壓蒸汽滅菌，是通過蒸汽，對膜分離槽進(jìn)行加熱和加壓，使得存在 于槽內(nèi)的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞滅活。作為加熱和加壓條件，優(yōu)選例如在121. rC、蒸汽壓1氣壓 的條件下加壓?加溫20分鐘W上。因此，本發(fā)明的連續(xù)培養(yǎng)裝置的膜分離槽12,和配置在該 膜分離槽12中的分離膜、元件構(gòu)成材料，優(yōu)選使用具有耐受在運(yùn)種條件下的高壓蒸汽滅菌 操作的材料。由此可W進(jìn)行包含分離膜元件的培養(yǎng)槽內(nèi)的滅菌。如果培養(yǎng)槽內(nèi)可W進(jìn)行滅 菌，那么就可W避免在連續(xù)培養(yǎng)時(shí)被不優(yōu)選的微生物污染的危險(xiǎn)，可W實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的連續(xù)培 養(yǎng)。
[0223] 構(gòu)成分離膜元件的分離膜和支持板等材料優(yōu)選在高壓蒸汽滅菌操作的條件即 121. rC、蒸汽壓1氣壓的條件下20分W上運(yùn)樣的條件下有耐性，只要是運(yùn)樣，則對分離膜和 元件構(gòu)成材料的種類則沒有特別限制。作為具有運(yùn)種耐性的分離膜的原材料，可W采用上 述多孔性膜的原材料。此外，作為支持板等元件構(gòu)成材料，可優(yōu)選選擇例如不誘鋼或侶等金 屬、或者聚酷胺類樹脂、氣類樹脂、聚碳酸醋類樹脂、聚縮醒類樹脂、聚對苯二甲酸下二醇醋 類樹脂、PVDF、改性聚苯酸類樹脂和聚諷類樹脂等樹脂。 實(shí)施例
[0224] W下，就本發(fā)明，列舉實(shí)施例、比較例，詳細(xì)進(jìn)行說明。
[0225] 具體地，在實(shí)施例1~9、比較例1~4中，對選擇心乳酸作為化學(xué)品，具有k乳酸生 產(chǎn)能力的酵母(參考例1)作為微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，多孔性膜(參考例2:平膜)作為分離膜，使 用圖2、7、9、13~16任一所示的連續(xù)培養(yǎng)裝置進(jìn)行的連續(xù)的化學(xué)品的制造，進(jìn)行說明。
[0226] 另外，在實(shí)施例10、比較例5中，對選擇尸胺（1,5-戊二胺)作為化學(xué)品，具有尸胺生 產(chǎn)能力的微生物作為微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，多孔性膜(參考例2:平膜)作為分離膜，使用圖2所 示的連續(xù)培養(yǎng)裝置進(jìn)行的連續(xù)的化學(xué)品的制造進(jìn)行說明。
[0227] 而且，在實(shí)施例11、比較例6中，對選擇心賴氨酸作為化學(xué)品，具有k賴氨酸生產(chǎn)能 力的微生物作為微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，多孔性膜(參考例2:平膜)作為分離膜，使用圖2所示的 連續(xù)培養(yǎng)裝置進(jìn)行的連續(xù)的化學(xué)品的制造進(jìn)行說明。
[0228] 并且，在所有的實(shí)施例中，采用蝶閥作為流量控制裝置25,由此調(diào)節(jié)流向膜分離槽 的培養(yǎng)液的流量和流入壓。
[0229] 而且，運(yùn)些實(shí)施例是對本發(fā)明的一個(gè)方案的說明，并不限制本發(fā)明。
[0230] (參考例1)具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母株(SU014株)的制作
[0231] 本實(shí)施例中，作為具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母，使用具有序列號1所述的堿基序列的 非洲爪贍(Xenopus laevis)來源的kldh基因?qū)朐赑DC1啟動(dòng)子下游的酵母。非洲爪贍來 源的レldh基因的克隆通過PCR法進(jìn)行。PCR中，W按照非洲爪贍的腎臟來源的cDNA文庫 (STRATAGE肥公司制）附帶的操作手冊制備的隧菌粒DNA作為模板。
[0232] PCR擴(kuò)增反應(yīng)中使用KOD-Plus聚合酶（東洋紡公司制），反應(yīng)緩沖液、dNTTmix等采 用試劑盒附帶的產(chǎn)品。制備50μ1的反應(yīng)體系，其中如上所述按照附帶的操作規(guī)程制備的隧 菌粒DNA為50ng/樣品、引物為SOpmol/樣品，和KOD-Plus聚合酶為1單位/樣品。用PCR擴(kuò)增裝 置iCycler(BI〇-RAD公司制），使反應(yīng)溶液在94°C溫度熱變性5分鐘后，W94°C(熱變性)30 秒、55°C (引物的退火)30秒、68°C (互補(bǔ)鏈延伸）1分鐘為一個(gè)循環(huán)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，然后冷卻 至|J4°C。并且，基因擴(kuò)增用引物(序列號2,3)在5末端側(cè)添加 Sail識(shí)別序列、3末端側(cè)添加 Notl 識(shí)別序列而制備。
[0233] 純化PCR擴(kuò)增片段，用T4多核巧酸激酶(TakaraBio公司制）對末端憐酸化后，連接 到PUC118載體(用限制性酶化ncll切斷，對切斷面進(jìn)行脫憐酸化處理了的載體）中。用DNA連 接試劑盒Ver. 2 (化karaBio公司制)進(jìn)行連接。用連接溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊α的感受態(tài)細(xì)胞 (TakaraBio公司制），接種到含50yg/mL抗生素氨節(jié)青霉素的LB板上，培養(yǎng)一晚。對生長的菌 落，用小型制備法回收質(zhì)粒DNA，用限制性酶Sail和Notl切斷，選擇出插入了非洲爪贍來源 的Idh基因的質(zhì)粒。運(yùn)一系列操作都按照附帶的操作規(guī)程進(jìn)行。
[0234] 用限制性酶Sail和Notl切斷插入了上述非洲爪贍來源的レl化基因的PUC118載 體，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，按照常規(guī)方法純化含有非洲爪贍來源的kldh基 因的片段。獲得的含有L-1化基因的片段連接到圖5所示的表達(dá)載體pTRSll的趾oI/Notl切 斷部位中，用與上述相同方法回收質(zhì)粒DNA，通過用限制性酶趾〇1和Notl切斷，選擇出插入 了非洲爪贍來源的Idh基因的表達(dá)載體。W后，將運(yùn)樣制作的整合了非洲爪贍來源的kldh 基因的表達(dá)載體稱為PTRS102。
[0235] W該P(yáng)TRS102作為擴(kuò)增模板，通過W寡核巧酸(序列號4,5)作為引物組的PCR，擴(kuò)增 出含有非洲爪贍來源的心1化基因和TDH3終止子序列的1.3化的PCR片段。運(yùn)里，序列號4被 設(shè)計(jì)成添加了對應(yīng)于PDCl基因的起始密碼子上游60bp的序列。
[0236] 然后，W質(zhì)粒PRS424作為擴(kuò)增模板，通過W寡核巧酸（序列號6,7)作為引物組的 PCR，擴(kuò)增出含有作為酵母選擇標(biāo)記的TRP1基因的1.化b的PCR片段。運(yùn)里，序列號7被設(shè)計(jì)成 添加了對應(yīng)于PDC1基因終止密碼子下游60bp的序列。
[0237] 用1%瓊脂糖凝膠電泳分離各個(gè)DNA片段，按常規(guī)方法純化。W混合了此處獲得的 各1.3kb片段、1.2化片段的混合物作為擴(kuò)增模板，通過W寡核巧酸(序列號4,7)作為引物組 的PCR法，擴(kuò)增出了在5末端和3末端分別添加了對應(yīng)于PDC1基因的上游和下游60bp的序列 的連接了非洲爪贍來源的L-1化基因、TD冊終止子和TRP1基因的約2.5化的PCR片段。
[0238] 用1%瓊脂糖凝膠電泳分離上述PCR片段，按常規(guī)方法純化后，轉(zhuǎn)化酵母中的釀酒 酵母（Saccharomyces cerevisae)NBRC10505株，用色氨酸非添加培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，選擇出 非洲爪贍來源的心1化基因?qū)朐谌旧w上的PDC1基因啟動(dòng)子下游的轉(zhuǎn)化株。
[0239] 按下述方式對用上述方式獲得的轉(zhuǎn)化株為非洲爪贍來源的心1化基因?qū)朐谌旧?體上PDC1基因啟動(dòng)子下游的酵母進(jìn)行確認(rèn)。首先，用基因組DNA提取試劑盒"Geni:S<A；' (注冊商標(biāo)）（化karabio公司制）制備轉(zhuǎn)化株的基因組DNA，W其作為擴(kuò)增模板，通過W寡核 巧酸（序列號8,9)作為引物組的PCR，確認(rèn)獲得了約2.8化的擴(kuò)增DNA片段。而且，非轉(zhuǎn)化株 中，通過上述PCR獲得了約2.化b的擴(kuò)增DNA片段。W下，將上述非洲爪贍來源的化基因?qū)?入在染色體上的PDC1基因啟動(dòng)子下游的轉(zhuǎn)化株稱為B2株。而且，PDC1基因的上游和下游序 列可W從酵母屬基因組數(shù)據(jù)庫(URL: ht1:p://www. yeastgenome.org/)獲得。
[0240] 然后，使國際公開W02007/097260號小冊子中記載的pdcl基因置換為TRP1標(biāo)記，且 pdc5基因中具有溫度感受性變異的酵母SW015株與上述獲得的B2株接合，獲得2倍體細(xì)胞。 使該2倍體細(xì)胞在子囊形成培養(yǎng)基中形成子囊。用顯微操作器解剖子囊，獲得各個(gè)單倍體細(xì) 胞，研究各個(gè)單倍體細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷型。從獲得的單倍體細(xì)胞中，選擇出在pdcl基因座中插 入了非洲爪贍(Xenopus laevis)來源的1化基因，且pdc5基因中具有溫度感受性變異的（34 °C不能生長)株。獲得的酵母株稱為SU014株。
[0241] 并且，在下述所示的條件下通過HPLC法測定SC培養(yǎng)基（METHODS IN YEAST GE肥TICS 2000邸口ION,CS化PRESS)中培養(yǎng)了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)上清中所含乳酸，從而確認(rèn) SU014株是否具有乳酸生產(chǎn)能力。
[0242] 柱：Slim-化ck SPR-H(島津社制）
[0243] 移動(dòng)相:5mM對甲苯橫酸(流速0.8mL/分鐘）
[0244] 反應(yīng)液:5mM對甲苯橫酸、20mM Bis-Tris、0.1mM 邸TA · 2Na(流速0.8mL/分鐘）
[0245] 檢測方法:導(dǎo)電性
[0246] 溫度:45°C。
[0247] 此外，心乳酸的光學(xué)純度測定在W下條件下通過HPLC法測定。
[0248] 柱：TSK-gel Enantio L1(東曹株式會(huì)社制）
[0249] 移動(dòng)相:ImM硫酸銅水溶液 [0巧日]流速：1.0ml/分鐘
[0巧1] 檢測方法：UV254nm
[0巧2]溫度：3(TC。
[0253]另外，乳酸的光學(xué)純度用下式計(jì)算。
[0254] 光學(xué)純度（％) = !〇〇 X(L-D)/(L+D)
[0255] 其中，L表示k乳酸的濃度，D表示D-乳酸的濃度。
[0256] HPLC分析的結(jié)果是，檢測到心乳酸，D-乳酸在檢測界限W下。根據(jù)W上研究，確認(rèn) 了該SU014株具有心乳酸生產(chǎn)能力。
[0257] (參考例2)多孔性平膜的制作
[0258] 分別使用聚偏氣乙締(PVDF)樹脂作為樹脂，并且N，N-二甲基乙酷胺(DMAc)作為溶 劑，在9(TC的溫度下將它們充分?jǐn)埌?，獲得了具有W下組成的原液。
[0巧9] · PVDF:13.0重量％
[0260] · DMAc:87.0重量％。
[0261] 接著，上述原液在冷卻到25°C的溫度后，涂布在預(yù)先貼附在玻璃板上的密度為 0.48g/cm3、厚度為220皿的聚醋纖維制無紡布（多孔質(zhì)基材)上，立即浸潰于25°C溫度的具 有下述組成的凝固浴中5分鐘，獲得了在多孔質(zhì)基材上形成了多孔質(zhì)樹脂層的多孔質(zhì)性膜。 [0%2] ?水:30.0 重量 ％
[0%3] · DMAc:70.0重量％。
[0264] 將該多孔質(zhì)性膜從玻璃板上剝離后，浸潰于80°C溫度的熱水中3次，洗出DMAc,獲 得了分離膜（多孔性膜）。用掃描型電子顯微鏡ΚΙΟ,ΟΟΟ倍的倍率觀察多孔質(zhì)樹脂層表面 9.2皿X 10.4μπι的范圍，能夠觀察到的所有細(xì)孔的直徑平均值為0. Ιμπι。然后，對上述分離膜 的純水透過系數(shù)進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果是50Xl(T9m3/m2 · S ·化。純水透水量的測定用通過反滲透 膜獲得的25°C溫度的純化水，Wlm的落差高度進(jìn)行。另外，細(xì)孔徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.035μπι，膜 表面粗糖度為〇.〇6μπι。
[0265] (實(shí)施例1)
[0266] 使用參考例1制備的SU014株，通過圖2所示的連續(xù)培養(yǎng)裝置進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，制造 k 乳酸。并且，使用原料糖培養(yǎng)基(60g/L優(yōu)糖精（厶ッ一株式會(huì)社制）、1.5g/L硫酸錠)作為培 養(yǎng)基。該原料糖培養(yǎng)基在12rC的溫度高壓(2個(gè)大氣壓)蒸汽滅菌處理15分鐘后再使用。分 離膜元件材料使用不誘鋼和聚諷樹脂樹脂的成型品，分離膜使用參考例2制作的多孔性平 膜。使用隔膜式累"A化S-20"(夕夕；十社)作為送液管17內(nèi)的累5,使用蠕動(dòng)累作為用于從膜 分離槽中取出透過液的累4。而且，實(shí)施例中的運(yùn)轉(zhuǎn)條件如下。
[0267] 培養(yǎng)槽容量:20(L)
[026引使用分離膜:PVDF過濾膜(參考例2中制作）
[0269] 膜分離槽容量:5化）
[0270] 膜分離元件有效過濾面積:4000cm2
[0271] 溫度調(diào)節(jié):32(°C)
[0272] 培養(yǎng)槽通氣量:空氣1(L/分鐘）
[0273] 培養(yǎng)槽攬拌速度：100 (rpm)抑調(diào)節(jié):用8N氨氧化巧調(diào)節(jié)到抑5
[0274] 培養(yǎng)基供給速度:用培養(yǎng)槽內(nèi)的水位感應(yīng)器12可變控制
[0275] 滅菌:膜分離槽、培養(yǎng)槽和使用培養(yǎng)基都采用121°(：、0.21?3、20分鐘的加壓蒸汽滅 菌
[0276] 累4的流量:3L/小時(shí)
[0277] 送液管15、17的最大內(nèi)徑:50mm
[027引累5的輸出：5L/分鐘
[02巧]送液管15，17的線流速:4.2cm/秒
[0280] 濾過流量:0.180m/天
[0281] 回收率:非控制（1%W下）。
[0282] 于是，作為前培養(yǎng)，在試管中用5ml的原料糖培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)SU014株一夜(前前前 培養(yǎng)）。在100ml新鮮的原料糖培養(yǎng)基中接種獲得的培養(yǎng)液，用500ml容坂口燒瓶，30°C振蕩 培養(yǎng)24小時(shí)(前前培養(yǎng)）。將獲得的培養(yǎng)液接種在1000ml新鮮的原料糖培養(yǎng)基中，用3000ml 容坂口燒瓶，30°C振蕩培養(yǎng)24小時(shí)(前培養(yǎng)）。
[0283] 將該前培養(yǎng)液接種在培養(yǎng)槽1和膜分離槽內(nèi)的總計(jì)20L的原料糖培養(yǎng)基中，用附帶 的攬拌機(jī)攬拌培養(yǎng)槽內(nèi)，進(jìn)行通氣量的調(diào)節(jié)、溫度調(diào)節(jié)、抑調(diào)節(jié)，在進(jìn)行50小時(shí)培養(yǎng)后，使累 4運(yùn)轉(zhuǎn)，取出含有k乳酸的透過液。此時(shí)，一天一次測定向膜分離槽2流入的培養(yǎng)液的壓力， 調(diào)節(jié)設(shè)置在旁通管26中的流量控制裝置25(蝶閥），使得計(jì)示壓力達(dá)到O.lMPa。
[0284] 進(jìn)行250小時(shí)培養(yǎng)，測定培養(yǎng)槽中的酵母濁度、作為透過液中的生產(chǎn)物質(zhì)的乳酸濃 度、糖濃度，計(jì)算出乳酸的對糖收率。其結(jié)果示于圖10、表1。并且，乳酸濃度用參考例1所示 的方法測定。酵母濁度通過用光度計(jì)在600nm的吸光來測定。此外，所謂乳酸的對糖收率，是 生產(chǎn)出的乳酸重量相對于消耗的糖重量的比例，用下述(式7)計(jì)算。
[0285] [數(shù)7]
[0286]
[0287] 糖濃度的測定在W下條件下通過HPLC法測定。
[0288] 柱：Luna N肥 250x4.6mm(F*henomenex公司制）
[0289] 移動(dòng)相:水：乙臘= 25:75 [0巧日]流速:0.6ml/分鐘
[0291] 檢測方法:RI (差示折射儀）
[0292] 應(yīng)答:4 [029；3]極性:+
[0 巧 4]溫度：30°C。
[0巧5](比較例1)
[0296] 除了使用圖9所示的連續(xù)培養(yǎng)裝置W外，其余與實(shí)施例1 一樣的方式進(jìn)行連續(xù)培 養(yǎng)，測定酵母濁度、作為生產(chǎn)物質(zhì)的乳酸濃度。并且，除圖9所示的裝置不設(shè)置旁通管26、流 量控制裝置25和膜分離槽閥開關(guān)27、28W外，其余與圖2所示裝置的構(gòu)成一樣。
[0297] 結(jié)果示于圖11、表1。并且，對連續(xù)培養(yǎng)中向膜分離槽供給的培養(yǎng)液的壓力測定的 結(jié)果不于圖12。
[0298] 比較例1中，由于不控制向膜分離槽供給的培養(yǎng)液的壓力，因此如圖12所示，壓力 在連續(xù)培養(yǎng)中變化，從培養(yǎng)開始250小時(shí)時(shí)變化到IMPa W上。而且，酵母濁度和生產(chǎn)的乳酸 濃度都低于實(shí)施例1，乳酸的對糖收率在250小時(shí)的連續(xù)培養(yǎng)后為63%。
[0299] 根據(jù)W上內(nèi)容，可W確認(rèn)由于用旁通管26和設(shè)置在其中的流量控制裝置25調(diào)節(jié)培 養(yǎng)液向膜分離槽的流入，產(chǎn)生了酵母的高密度培養(yǎng)、乳酸(化學(xué)品）濃度提高且乳酸對糖收 率提高運(yùn)些無法預(yù)想的效果。
[0300] (實(shí)施例2)
[0301] 使用實(shí)施例1中完成了培養(yǎng)的連續(xù)培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)液，W循環(huán)管內(nèi)的線流速達(dá)到 0.5、1.5、2.5cm/秒，分別進(jìn)行2小時(shí)送液，測定沉淀在配管內(nèi)，累積的菌體的量。其結(jié)果示于 圖6。運(yùn)樣可W說，通過使循環(huán)管內(nèi)的培養(yǎng)液線速度達(dá)到2.5cm/秒W上，可菌體不沉淀 在配管內(nèi)的方式循環(huán)培養(yǎng)液。
[0302] (實(shí)施例3)
[0303] 除了將累5的輸出改變?yōu)?0L/分鐘W外，其余W與實(shí)施例1同樣的方式進(jìn)行連續(xù)培 養(yǎng)。測定進(jìn)行100小時(shí)的培養(yǎng)后和進(jìn)行250小時(shí)的培養(yǎng)后的培養(yǎng)槽中的酵母濁度、作為透過 液中的生產(chǎn)物質(zhì)的乳酸濃度、糖濃度，再計(jì)算乳酸的對糖收率。結(jié)果示于表1。
[0304] 實(shí)施例3比實(shí)施例1的乳酸濃度、乳酸的對糖收率要降低一些。我們認(rèn)為運(yùn)是因?yàn)椋?通過使循環(huán)流量(累5)增加，恐怕培養(yǎng)槽的液體混合狀態(tài)發(fā)生了變化。
[0305] (比較例2)
[0306] 除了使用圖9中所示的連續(xù)培養(yǎng)裝置W外，其余均W與實(shí)施例3相同方式進(jìn)行連續(xù) 培養(yǎng)。
[0307] 由于在比較例2中，沒有控制向膜分離槽供給的培養(yǎng)液的壓力，因此連續(xù)培養(yǎng)中膜 分離槽內(nèi)壓力增加，培養(yǎng)開始70小時(shí)時(shí)達(dá)至iJlMPaW上，如果再繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，培養(yǎng)液就開始從膜 分離槽泄漏，形成了無法實(shí)施連續(xù)培養(yǎng)的狀態(tài)。
[0308] 通過實(shí)施例3和比較例2,清楚了無旁通管26,就無法實(shí)施連續(xù)培養(yǎng)，通過設(shè)置在旁 通管26中的流量控制裝置25調(diào)節(jié)培養(yǎng)液向膜分離槽的流入，可W說具有可W穩(wěn)定地實(shí)施連 續(xù)培養(yǎng)的效果。
[0309] (實(shí)施例4)
[0310] 使用圖7所示的連續(xù)培養(yǎng)裝置，除了累5的輸出為化/分鐘，累16的輸出為lOL/分鐘 W外，其余與實(shí)施例3-樣的方式進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。
[0311] 測定進(jìn)行了 100小時(shí)培養(yǎng)后和250小時(shí)培養(yǎng)后的培養(yǎng)槽中的酵母濁度、作為透過液 中的生產(chǎn)物質(zhì)的乳酸濃度、糖濃度，再計(jì)算出乳酸的對糖收率。結(jié)果示于表1。
[0312] 其結(jié)果，與實(shí)施例1相反，即使通過累16,與實(shí)施例3同樣增加循環(huán)流量，由于通過 累16控制返回培養(yǎng)槽的液體的流量，乳酸濃度、酵母濁度和乳酸的對糖收率也都可W達(dá)到 與循環(huán)流量改變前的實(shí)施例1同等的成績。
[0313] (比較例3)
[0314] 除了使用圖13所示的連續(xù)培養(yǎng)裝置W外，其余與實(shí)施例4相同的方式進(jìn)行連續(xù)培 養(yǎng)。并且，除了圖13所示的裝置沒有設(shè)置旁通管26、流量控制裝置25和膜分離槽閥27、28之 夕h其余結(jié)構(gòu)與圖7所示的裝置相同。
[0315] 由于比較例3中不控制向膜分離槽供給的培養(yǎng)液的壓力，因此連續(xù)培養(yǎng)中壓力增 加，在培養(yǎng)開始的70小時(shí)時(shí)達(dá)到1M化W上，如果再繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，培養(yǎng)液就開始從膜分離槽泄 漏，形成了無法實(shí)施連續(xù)培養(yǎng)的狀態(tài)。
[0316] (實(shí)施例5)
[0317] 除了使用圖14所示的連續(xù)培養(yǎng)裝置W外，其余與實(shí)施例3同樣方式進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。 并且，圖14所示的裝置除了送液管15在浸潰于培養(yǎng)槽1中存儲(chǔ)的培養(yǎng)液中的位置開口 W外， 其余結(jié)構(gòu)和圖2所示裝置相同。
[0318] 測定進(jìn)行了 100小時(shí)培養(yǎng)后和250小時(shí)培養(yǎng)后的培養(yǎng)槽中的酵母濁度、作為透過液 中的生產(chǎn)物質(zhì)的乳酸濃度、糖濃度，再計(jì)算出乳酸的對糖收率。結(jié)果示于表1。
[0319] 其結(jié)果，與實(shí)施例1相反，即使通過累5,與實(shí)施例3同樣增加循環(huán)流量，由于通過將 液體返回到培養(yǎng)槽的位置設(shè)置在浸潰于培養(yǎng)液中的位置，乳酸濃度、酵母濁度和乳酸的對 糖收率也都可W達(dá)到與循環(huán)流量改變前的實(shí)施例1同等的成績。
[0320] (比較例4)
[0321] 除了使用圖15所示的連續(xù)培養(yǎng)裝置W外，其余與實(shí)施例5相同的方式進(jìn)行連續(xù)培 養(yǎng)。并且，除了圖15所示的裝置沒有設(shè)置旁通管26、流量控制裝置25和膜分離槽開關(guān)閥27、 28之外，其余結(jié)構(gòu)與圖14所示的裝置相同。
[0322] 由于比較例4中不控制向膜分離槽供給的培養(yǎng)液的壓力，因此連續(xù)培養(yǎng)中壓力增 加，在培養(yǎng)開始的70小時(shí)時(shí)達(dá)到1M化W上，如果再繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，培養(yǎng)液就開始從膜分離槽泄 漏，形成了無法實(shí)施連續(xù)培養(yǎng)的狀態(tài)。
[0323] [表 1]
[0324]
[0325] (實(shí)施例6)
[0326] 使用圖16所示的連續(xù)培養(yǎng)裝置，根據(jù)流量計(jì)30的值計(jì)算回收率，通過累4調(diào)節(jié)透過 液取出流量使得回收率達(dá)到1.5%，與此同時(shí)進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，并且經(jīng)過250小時(shí)后，繼續(xù)連續(xù) 培養(yǎng)之外，其余與實(shí)施例1 一樣進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。而且，圖16所示的裝置除了設(shè)置流量計(jì)30W 夕h其余與圖2所示的裝置相同。同時(shí)，經(jīng)時(shí)測定作用于分離膜3的膜間差壓，評價(jià)自膜間差 壓的驟然上升引起的膜的閉塞時(shí)間。
[0327]圖17中示出了測定的膜間差壓的推移。自運(yùn)轉(zhuǎn)開始經(jīng)過1000小時(shí)，膜間差壓穩(wěn)定， W1.5%的回收率運(yùn)轉(zhuǎn)，可W實(shí)現(xiàn)長時(shí)間穩(wěn)定地通過連續(xù)培養(yǎng)制造心乳酸。此外，連續(xù)培養(yǎng) 完成時(shí)測定并計(jì)算的培養(yǎng)槽中酵母濁度、作為透過液中的生產(chǎn)物質(zhì)的乳酸濃度、糖濃度、乳 酸的對糖收率的結(jié)果示于表2。
[032引（實(shí)施例7)
[0329] 除了回收率為3.0% W外，其余與實(shí)施例6同樣方式進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。
[0330] 圖17中示出了測定的膜間差壓的推移。自運(yùn)轉(zhuǎn)開始經(jīng)過800小時(shí)，膜間差壓穩(wěn)定， 即使W3.0%的回收率運(yùn)轉(zhuǎn)，也可W實(shí)現(xiàn)長時(shí)間穩(wěn)定地通過連續(xù)培養(yǎng)制造心乳酸。此外，連 續(xù)培養(yǎng)完成時(shí)測定并計(jì)算的培養(yǎng)槽中酵母濁度、作為透過液中的生產(chǎn)物質(zhì)的乳酸濃度、糖 濃度、乳酸的對糖收率的結(jié)果示于表2。
[0331] (實(shí)施例8)
[0332] 除了回收率變成9.9% W外，其余與實(shí)施例6同樣方式進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。
[0333] 圖17中示出了測定的膜間差壓的推移。自運(yùn)轉(zhuǎn)開始經(jīng)過550小時(shí)，膜間差壓穩(wěn)定， 即使在回收率9.9%，也可W實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定地通過連續(xù)培養(yǎng)制造心乳酸。此外，連續(xù)培養(yǎng)完成時(shí) 測定并計(jì)算的培養(yǎng)槽中酵母濁度、作為透過液中的生產(chǎn)物質(zhì)的乳酸濃度、糖濃度、乳酸的對 糖收率的結(jié)果示于表2。
[0334] (實(shí)施例9)
[0335] 除了回收率變成12.0% W外，其余與實(shí)施例6同樣方式進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。
[0336] 圖17中示出了測定的膜間差壓的推移。自運(yùn)轉(zhuǎn)開始100小時(shí)時(shí)，膜間差壓急劇上 升，膜細(xì)孔關(guān)閉。此外，連續(xù)培養(yǎng)完成時(shí)測定并計(jì)算的培養(yǎng)槽中酵母濁度、作為透過液中的 生產(chǎn)物質(zhì)的乳酸濃度、糖濃度、乳酸的對糖收率的結(jié)果示于表2。在進(jìn)行100小時(shí)連續(xù)培養(yǎng)后 的培養(yǎng)槽中的乳酸濃度為45g/L。而且，酵母濁度增加到0D600為100,乳酸的對糖收率為 80%。
[0337] 然而，過濾變困難了，超過100小時(shí)，難W通過連續(xù)培養(yǎng)繼續(xù)制造心乳酸。
[0338] W上，根據(jù)實(shí)施例6~9的結(jié)果，可W確認(rèn)，通過W將回收率調(diào)節(jié)到10% W下的方式 進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)運(yùn)轉(zhuǎn)，可W進(jìn)行長時(shí)間（500小時(shí)W上）的連續(xù)培養(yǎng)運(yùn)轉(zhuǎn)的運(yùn)種無法預(yù)料的顯 著效果。
[0339] [表 2] 「(mol
[0341] (實(shí)施例10)
[0342] 使用特開2004-222569號公報(bào)所述的谷氨酸棒桿菌TR-CADl株，通過圖2所示的連 續(xù)培養(yǎng)裝置進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，制造尸胺。而且，使用表3所示組成的尸胺生產(chǎn)培養(yǎng)基作為培養(yǎng) 基。該尸胺生產(chǎn)培養(yǎng)基于12rC的溫度高壓(2個(gè)大氣壓)蒸汽滅菌處理15分鐘后再使用。分 離膜元件材料使用不誘鋼和聚諷樹脂樹脂的成型品，分離膜使用參考例2制作的多孔性平 膜。使用隔膜式累"A化S-20"(夕夕；十社)作為送液管17內(nèi)的累5,使用蠕動(dòng)累作為用于從膜 分離槽中取出透過液的累4。
[0；343][表 3]
[0344] 尸胺生產(chǎn)培養(yǎng)基
[0345]
[0346] 而且實(shí)施例中的條件如下。
[0347] 培養(yǎng)槽容量:20 (L)
[0348] 使用分離膜:PVDF過濾膜(參考例2中制作）
[0349] 膜分離槽容量:5化）
[0350] 膜分離元件有效過濾面積:4000cm2 [0；351]溫度調(diào)節(jié)：3〇rC)
[0352] 培養(yǎng)槽通氣量:空氣3(L/分鐘）
[0353] 培養(yǎng)槽攬拌速度：100(巧m)pH調(diào)節(jié):用3M肥巧日3M氨水調(diào)節(jié)到抑7.0
[0354] 培養(yǎng)基供給速度:用培養(yǎng)裝置內(nèi)的液面水位感應(yīng)器可變控制
[03W]滅菌:膜分離槽、培養(yǎng)槽和使用培養(yǎng)基都采用121°(：、0.21?3、20分鐘的加壓蒸汽滅 菌
[0356] 累4的流量:3L/小時(shí)
[0巧7] 送液管15、17的最大內(nèi)徑:50mm
[035引累5的輸出：5L/分鐘
[Ο%9 ] 送液管15，17的線流速:4.2cm/秒
[0360] 濾過流量:0.180m/天
[0361] 回收率:非控制（1%W下）。
[0362] 于是，作為前培養(yǎng)，在試管中用添加了5ml卡那霉素（2扣g/ml)的尸胺生產(chǎn)培養(yǎng)基 振蕩培養(yǎng)TR-CAD1株一晚(前前前培養(yǎng)）。在50ml新鮮的添加了卡那霉素(2扣g/ml)的尸胺 生產(chǎn)培養(yǎng)基中接種獲得的培養(yǎng)液，用500ml容坂口燒瓶，在30°C的溫度，W振幅30cm、在 18化pm的條件下，培養(yǎng)24小時(shí)（前前培養(yǎng)）。將獲得的培養(yǎng)液接種在1000ml新鮮的尸胺生產(chǎn) 培養(yǎng)基中，用3000ml容坂口燒瓶，3(TC振蕩培養(yǎng)24小時(shí)(前培養(yǎng)）。將該前培養(yǎng)液接種在培養(yǎng) 槽1和膜分離槽2內(nèi)的總計(jì)20L的尸胺生產(chǎn)培養(yǎng)基中，用附帶的攬拌機(jī)攬拌培養(yǎng)槽內(nèi)，進(jìn)行通 氣量的調(diào)節(jié)、溫度調(diào)節(jié)、抑調(diào)節(jié)，在進(jìn)行50小時(shí)培養(yǎng)后，使累4運(yùn)轉(zhuǎn)，取出含有尸胺的透過液。
[0363] 此時(shí)，一天一次測定向膜分離槽2流入的培養(yǎng)液的壓力，調(diào)節(jié)設(shè)置在旁通管26中的 流量控制裝置25(蝶閥），使得計(jì)示壓力達(dá)到O.lMPa。
[0364] 進(jìn)行250小時(shí)培養(yǎng)，測定培養(yǎng)槽中的酵母濁度、作為透過液中的生產(chǎn)物質(zhì)的尸胺濃 度、糖濃度，再計(jì)算尸胺的對糖收率。其結(jié)果示于圖18、表4中。尸胺濃度為3.5g/L。此外，棒 桿菌濁度通過用光度計(jì)在600nm的吸光來測定。尸胺的對糖收率為3%。
[0365] 而且，尸胺濃度用W下方法測定。
[0366] [通過HPLC進(jìn)行的尸胺濃度的分析方法]
[0367] ?使用柱：CAPCE化PAK C18(資生堂）
[036引 ?移動(dòng)相:0.1 % (w/w)憐酸水溶液：乙臘=4.5:5.5
[0369] ?檢測：UV360nm
[0370] ?試樣前處理：在25μ1分析試樣中，作為內(nèi)標(biāo)，添加混合25μ1 1,4-二氨基下燒 (0.03Μ)，150μ1的碳酸氨鋼(0.075Μ)，和2,4-二硝基氣苯(0.21)的乙醇溶液，于37°(：的溫度 保溫1小時(shí)。
[0371] 將上述的反應(yīng)溶液50μ1溶解于1ml的乙臘后，m〇,〇〇〇巧m離屯、5分鐘后，對10μ1的 其上清進(jìn)行HPLC分析。
[0372] (比較例5)
[0373] 除了使用圖9所示的裝置W外，其余與實(shí)施例10-樣的方式進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，測定棒 桿菌濁度、作為生產(chǎn)物質(zhì)的尸胺濃度。并且，除圖9所示的裝置不設(shè)置旁通管26、流量控制裝 置25和膜分離槽閥開關(guān)27、28W外，其余與圖2所示裝置的構(gòu)成一樣。
[0374] 結(jié)果示于圖19、表4。并且，對連續(xù)培養(yǎng)中向膜分離槽供給的培養(yǎng)液的壓力測定的 結(jié)果不于圖20。
[0375][表 4] 「03761
~由于比較例5中不控制向膜分離槽供給的培養(yǎng)液的壓力，因此如圖20所示，連續(xù)培 養(yǎng)中壓力變化，在培養(yǎng)開始后的225小時(shí)時(shí)達(dá)到IMPaW上。而且，棒桿菌濁度、尸胺濃度均低 于實(shí)施例10。而且，尸胺的對糖收率為1.0%。
[0378] 由W上可W確認(rèn)，由于用旁通管26和設(shè)置在其中的流量控制裝置25調(diào)節(jié)培養(yǎng)液向 膜分離槽的流入，棒桿菌的高密度培養(yǎng)、尸胺(化學(xué)品）濃度提高且尸胺的對糖收率提高運(yùn) 些無法預(yù)想的效果。
[0379] (實(shí)施例11)
[0380] 使用特開2008-212138號公報(bào)所述的谷氨酸棒桿菌Δ-Η0Μ株，通過圖2所示的連續(xù) 培養(yǎng)裝置進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，制造 k賴氨酸。而且，使用表5所示組成的k賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基作 為培養(yǎng)基。該k賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基于12rC的溫度高壓(2個(gè)大氣壓)蒸汽滅菌處理15分鐘后 再使用。分離膜元件材料使用不誘鋼和聚諷樹脂的成型品，分離膜使用參考例2制作的多孔 性平膜。使用隔膜式累"APLS-20"(夕夕；十社)作為送液管17內(nèi)的累5,使用蠕動(dòng)累作為用于 從膜分離槽中取出透過液的累4。
[0381] [表 5]
[0382] k賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基
[0383]
[0384] 而且實(shí)施例中的條件如下。
[0385] 培養(yǎng)槽容量:20(L)
[0386] 使用分離膜:PVDF過濾膜(參考例2中制作）
[0387] 膜分離裝置液量:5化）
[0388] 膜分離元件有效過濾面積:4000cm2
[0389] 溫度調(diào)節(jié)：30(。〇
[0390] 培養(yǎng)槽通氣量:空氣5(L/分鐘）
[0391] 培養(yǎng)槽攬拌速度:300(巧m)pH調(diào)節(jié):用3M肥巧日3M氨水調(diào)節(jié)到抑7.3
[0392] 培養(yǎng)基供給速度:用培養(yǎng)裝置內(nèi)的液面水位感應(yīng)器可變控制
[0393] 滅菌:膜分離槽、培養(yǎng)槽和使用培養(yǎng)基都采用121°(：、0.21?3、20分鐘的加壓蒸汽滅 菌
[0394] 累4的流量:3L/小時(shí)
[0395] 送液管15、17的最大內(nèi)徑:50mm
[0396] 累5的輸出：5L/分鐘
[0397] 送液管15，17的線流速:4.2 cm/秒
[0398] 濾過流量:0.180m/天
[0399] 回收率:非控制（1%W下）。
[0400] 于是，作為前培養(yǎng)，在試管中用5ml的BY培養(yǎng)基(0.5 %酵母提取物、0.7 %肉膏、1 % 蛋白腺、0.3%氯化鋼)振蕩培養(yǎng)Δ-Η0Μ株一晚(前前前培養(yǎng)）。將獲得的培養(yǎng)液接種在50ml 的心賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基中，用500ml容坂口燒瓶，在30°C的溫度，W振幅30cm、在18化pm的條 件下，培養(yǎng)24小時(shí)(前前培養(yǎng)）。將獲得的培養(yǎng)液接種在1000ml新鮮的k賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基 中，用3000ml容坂口燒瓶，3(TC振蕩培養(yǎng)24小時(shí)(前培養(yǎng)）。將該前培養(yǎng)液接種在培養(yǎng)槽1和 膜分離槽內(nèi)的2化的心賴氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基中，用附帶的攬拌機(jī)攬拌培養(yǎng)槽內(nèi)，進(jìn)行通氣量的 調(diào)節(jié)、溫度調(diào)節(jié)、抑調(diào)節(jié)，在進(jìn)行50小時(shí)培養(yǎng)后，使累4運(yùn)轉(zhuǎn)，取出含有k賴氨酸的透過液。
[0401] 此時(shí)，一天一次測定向膜分離槽2流入的培養(yǎng)液的壓力，調(diào)節(jié)設(shè)置在旁通管26中的 流量控制裝置25(蝶閥），使得計(jì)示壓力達(dá)到O.lMPa。
[0402] 進(jìn)行250小時(shí)培養(yǎng)，測定培養(yǎng)槽中的棒桿菌濁度、作為透過液中的生產(chǎn)物質(zhì)的心賴 氨酸濃度、糖濃度，再計(jì)算心賴氨酸濃度的對糖收率。其結(jié)果示于圖21、表6。心賴氨酸濃度 為6.0g/L。此外，棒桿菌濁度通過用光度計(jì)在600nm的吸光來測定。心賴氨酸的對糖收率為 5.5%。此外，k賴氨酸濃度按與尸胺濃度的測定法相同的方法測定。
[0403] (比較例6)
[0404] 除了使用圖9所示的裝置W外，其余與實(shí)施例11同樣的方式進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，測定棒 桿菌濁度、作為生產(chǎn)物質(zhì)的k賴氨酸濃度。并且，除圖9所示的裝置不設(shè)置旁通管26、流量控 制裝置25和膜分離槽閥開關(guān)27、28W外，其余與圖2所示裝置的構(gòu)成一樣。
[0405] 結(jié)果示于圖22、表6。并且，對連續(xù)培養(yǎng)中向膜分離槽供給的培養(yǎng)液的壓力測定的 結(jié)果不于圖23。
[0406] [表6]
[0407] _
~由于比較例6中不控制向膜分離槽供給的培養(yǎng)液的壓力，因此如圖23所示，連續(xù)培~ 養(yǎng)中壓力變化，在培養(yǎng)開始后的225小時(shí)時(shí)達(dá)到IMPaW上。而且，棒桿菌濁度賴氨酸濃度 均低于實(shí)施例11。而且，k賴氨酸的對糖收率為1.1 %。
[0409] 由W上可W確認(rèn)，由于用旁通管26和設(shè)置在其中的流量控制裝置25調(diào)節(jié)培養(yǎng)液向 膜分離槽的流入，產(chǎn)生棒桿菌的高密度培養(yǎng)α-賴氨酸(化學(xué)品）濃度提高且k賴氨酸的對 糖收率提高運(yùn)些無法預(yù)想的效果。
[0410] 工業(yè)實(shí)用性
[0411] 本發(fā)明能夠合適地用于醇、有機(jī)酸、氨基酸、核酸、酶、抗生素、重組蛋白質(zhì)等通過 微生物培養(yǎng)可w獲得的各種化學(xué)品的生產(chǎn)。
[0412] 符號說明 [041引 1.培養(yǎng)槽
[0414] 2、2'.膜分離槽
[041引3、3'.分離膜
[0416] 4.過濾累
[0417] 5.累
[041引6.培養(yǎng)基供給累
[0419] 7.攬拌軸
[0420] 8.氣體供給管
[0421] 9. pH 傳感器
[0422] 10.中和劑累
[042；3] 11.溫度調(diào)節(jié)器
[0424] 12.水位感應(yīng)器
[04巧]13.大氣壓開放部 [04%] 14A.匯合點(diǎn)
[0427] 14B.分支點(diǎn)
[0428] 15.送液管(未過濾培養(yǎng)液向培養(yǎng)槽返回）
[04 巧]16.累
[0430] 17.送液管
[0431] 18.支持板
[0432] 19.流路材料
[043；3] 20.分離膜
[0434] 21.凹部
[043引22.集液管
[0436] 23.上部樹脂密封層
[0437] 24.下部樹脂密封層
[0438] 25.流量控制裝置
[0439] 26.旁通管
[0440] 27、27' .膜分離槽開閉閥(培養(yǎng)液供給側(cè)）
[0441] 28、28' .膜分離槽開閉閥(未過濾培養(yǎng)液排出側(cè)）
[04創(chuàng) 29.壓力計(jì)
[0443] 30.流量計(jì)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 使由培養(yǎng)槽送液的培養(yǎng)液的一部分，根據(jù)膜分離槽的培養(yǎng)液流入側(cè)壓力，繞過膜分 離槽的化學(xué)品的制造方法，該方法是在培養(yǎng)槽中培養(yǎng)微生物或培養(yǎng)細(xì)胞，由培養(yǎng)槽向膜分 離槽輸送培養(yǎng)液，再用分離膜過濾，從透過液中回收作為化學(xué)品的發(fā)酵生產(chǎn)物，同時(shí)使未經(jīng) 過濾的未過濾培養(yǎng)液以與膜分離槽上游側(cè)的培養(yǎng)液匯合的方式回流。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)品的制造方法，其以膜分離槽的培養(yǎng)液流入側(cè)的計(jì)示壓 力為IMPa以下那樣，控制繞過膜分離槽的培養(yǎng)液的流量。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的化學(xué)品的制造方法，其使未過濾培養(yǎng)液的一部分以與培養(yǎng) 槽內(nèi)的培養(yǎng)液匯合的方式回流，同時(shí)使未過濾培養(yǎng)液的其余部分以與培養(yǎng)槽至膜分離槽之 間的培養(yǎng)液匯合的方式回流。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化學(xué)品的制造方法，其相互獨(dú)立地控制以與培養(yǎng)槽至膜分離 槽之間的培養(yǎng)液匯合方式回流的未過濾培養(yǎng)液的流量，和以與培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液匯合方式 回流的未過濾培養(yǎng)液的流量。5. 權(quán)利要求3或4所述的化學(xué)品的制造方法，以與培養(yǎng)槽內(nèi)的培養(yǎng)液匯合方式回流的未 過濾培養(yǎng)液的流量相對于以與培養(yǎng)槽至膜分離槽之間的培養(yǎng)液匯合方式回流的未過濾培 養(yǎng)液的流量之比在1以下。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的化學(xué)品的制造方法，由培養(yǎng)槽向膜分離槽輸送的培 養(yǎng)液的線流速、以由膜分離槽向該膜分離槽上游側(cè)的培養(yǎng)液匯合的方式回流的未過濾培養(yǎng) 液的線流速、以及繞過膜分離槽的培養(yǎng)液的線流速都在2.5cm/秒以上。7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述的化學(xué)品的制造方法，調(diào)節(jié)流入膜分離槽的培養(yǎng)液量 和/或自分離膜的透過液量，以便自分離膜的透過液量相對于流入膜分離槽的培養(yǎng)液量的 回收率為10.0%以下。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述的化學(xué)品的制造方法，培養(yǎng)槽中培養(yǎng)液體積與膜分離 槽中培養(yǎng)液體積之比為4以上100以下。9. 具備膜分離槽的旁通管、膜分離槽的培養(yǎng)液流入側(cè)壓力的檢測裝置、和設(shè)置在旁通 管的流量控制裝置的連續(xù)培養(yǎng)裝置，該連續(xù)培養(yǎng)裝置具備用于培養(yǎng)微生物或培養(yǎng)細(xì)胞的培 養(yǎng)槽，具備用于回收來自培養(yǎng)槽的培養(yǎng)液中生產(chǎn)的發(fā)酵生產(chǎn)物的分離膜的膜分離槽，連接 培養(yǎng)槽與膜分離槽并在將培養(yǎng)液輸送到前述膜分離槽的同時(shí)使未經(jīng)分離膜過濾的未過濾 培養(yǎng)液以與膜分離槽上游側(cè)的培養(yǎng)液匯合的方式回流的循環(huán)管，和設(shè)置在循環(huán)管的培養(yǎng)液 送液裝置。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的連續(xù)培養(yǎng)裝置，所述流量控制裝置是由檢測裝置的結(jié)果聯(lián)動(dòng) 而運(yùn)轉(zhuǎn)的。11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的連續(xù)培養(yǎng)裝置，其具備循環(huán)管的線流速檢測裝置，流量 控制裝置和/或前述培養(yǎng)液送液裝置是根據(jù)該線流速檢測裝置的結(jié)果而運(yùn)轉(zhuǎn)的。12. 根據(jù)權(quán)利要求9~11任一項(xiàng)所述的連續(xù)培養(yǎng)裝置，所述膜分離槽安裝在具有與前述 培養(yǎng)液送液裝置不同的送液裝置、且與培養(yǎng)槽獨(dú)立的循環(huán)回路內(nèi)。13. 根據(jù)權(quán)利要求9~12任一項(xiàng)所述的連續(xù)培養(yǎng)裝置，循環(huán)管在浸漬于培養(yǎng)槽中存留的 培養(yǎng)液中的位置開口。14. 根據(jù)權(quán)利要求9~13任一項(xiàng)所述的連續(xù)培養(yǎng)裝置，培養(yǎng)槽體積與膜分離槽體積之比 在4以上100以下。
【文檔編號】C12P21/02GK106011187SQ201610340983
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2009年9月16日
【發(fā)明人】耳冢孝, 石井健太郎, 守田健, 日笠雅史, 澤井健司, 澤井秀樹, 山田勝成, 峰岸進(jìn), 峰岸進(jìn)一
【申請人】東麗株式會(huì)社