利用微生物轉化生產糖苷類化合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物轉化技術領域，具體涉及一種利用微生物轉化生產糖苷類化合物的方法。方法是平板培養(yǎng)，種子培養(yǎng)，微生物轉化試驗，糖苷化轉化產物的提取。本發(fā)明的方法是微生物發(fā)酵培養(yǎng)到一定時間，添加一定濃度的降苦參酮溶液，微生物自身產生的酶對底物進行了結構修飾，發(fā)生了糖苷化反應，產生了高活性、低毒性的糖苷化轉化產物；首次提出了利用微生物轉化手段制備黃酮糖苷類天然產物，還獲得了4個新的黃酮糖苷化產物。
【專利說明】
利用微生物轉化生產糖昔類化合物的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物轉化技術領域，具體設及一種利用微生物轉化生產糖巧類化合 物的方法。
【背景技術】
[0002] 生物轉化，是利用生物體系（包括植物、微生物或動物組織的培養(yǎng)體系）或生物體 系的相關酶制劑對外源有機底物某一特定部位或功能基團進行特異性的結構修飾W獲得 有價值產物的生理、生化反應。其本質是利用生物體系自身所產生的酶對外源物質進行催 化反應，具有高效、高選擇性、反應清潔、產物單純、易分離純化、能耗低等優(yōu)點，符合現(xiàn)代科 學發(fā)展綠色環(huán)保的要求。
[0003] 很多菌種都能使多種化合物發(fā)生不同的反應，運些菌種主要是霉菌、酵母菌和細 菌，其中又W霉菌在文獻中特別常見。微生物轉化已經設及到了徑基化、環(huán)氧化、脫氨、加氨 等氧化還原反應，水解、醋化、脫水、脫簇、酷化、胺化、異構化等各類化學反應。微生物轉化 中較為常見的反應類型是徑基化、水解、環(huán)氧化和甲基化反應。而糖巧化反應在微生物轉化 中很少被觀察到。
[0004] 降苦參酬是黃酬類化合物，是植物代謝過程中產生的一類重要天然有機化合物， 具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗過敏等活性，具有很高的藥用價值和醫(yī)用價值，也因此 受到了越來越來多的關注。但是，大多數黃酬類化合物有溶解度低、在極性和非極性溶液中 穩(wěn)定性都很差的特點，運大大限制了它的推廣使用。提高黃酬類化合物的親水性和穩(wěn)定性， 可W通過化學法和酶法進行結構修飾。酶法具有化學法無法比擬的優(yōu)點，條件溫和，化學、 區(qū)域和立體選擇性高，操作簡便，環(huán)境友好等特點而發(fā)展非常迅速。微生物法是酶法的一 種，依靠微生物自身產生的酶發(fā)揮作用，在黃酬類化合物的結構修飾上是一種有效的方式。 同時微生物轉化還可W發(fā)現(xiàn)新的活性化合物，獲得高活性、低毒性的衍生物，運為新藥開發(fā) 提供一條有效途徑。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種利用微生物轉化生產糖巧類化合物的方法，通過微生物 轉化將降苦參酬進行結構修飾，獲得新的高活性、低毒性物質。
[0006] 本發(fā)明所述的利用微生物轉化生產糖巧類化合物的方法，步驟如下：
[0007] (1)平板培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取短刺小克銀漢霉的菌絲體在PDA平板上劃線，于恒溫 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4Γ保存，得到短刺小克銀漢霉菌株平板；
[000引（2)種子培養(yǎng):從短刺小克銀漢霉菌株平板中用接種環(huán)挑取一環(huán)菌絲體，接種到有 種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，用棉塞封口后震蕩培養(yǎng)，得種子液；
[0009] (3)微生物轉化試驗:量取種子液加入到裝有PDA培養(yǎng)基的無菌錐形瓶中，用棉塞 封口后放于生物搖床中進行振蕩培養(yǎng)，36小時后將降苦參酬丙酬溶液加入到PDA培養(yǎng)基中， 繼續(xù)培養(yǎng)，得發(fā)酵培養(yǎng)液；
[0010] (4)糖巧化轉化產物的提取:過濾發(fā)酵培養(yǎng)液，濾液用等體積的乙酸乙醋萃取，合 并萃取有機相，真空減壓濃縮至干，得轉化殘渣;將殘渣溶解于丙酬，與硅膠拌樣，W硅膠柱 分離，氯仿-丙酬梯度洗脫，收集饋分;該饋分W甲醇-水為流動相，利用制備型高效液相分 離得到轉化產物2'甲氧基-6"徑基-降苦參酬-7-Ο-β-Ο-葡萄糖巧（I)和降苦參酬7-0-β-0- 葡萄糖巧（Π );饋分再進一步利用乙臘-水系統(tǒng)分離得到轉化產物6"徑基-降苦參酬-7-0- β-D-葡萄糖巧（虹）和7"-徑基-2'-甲氧基-降苦參酬-7-0-β-0-葡萄糖巧(IV)。
[0011] 步驟(1)中所述的恒溫培養(yǎng)箱的溫度為28°C，培養(yǎng)時間為3-5天。
[0012] 步驟(2)中所述的震蕩培養(yǎng)條件為28°C，180巧m，培養(yǎng)時間24小時。
[0013] 步驟(3)中所述的振蕩培養(yǎng)條件為18化pm、28°C。
[0014] 步驟(3)中所述的降苦參酬丙酬溶液的濃度為lOmg/ml。
[0015] 步驟(3)中所述的降苦參酬丙酬溶液的加入量為50-200ml。
[0016] 步驟(3)中所述的繼續(xù)培養(yǎng)時間為5天。
[0017] 步驟(4)中所述的甲醇與水的體積比為55:45。
[001引步驟(4)中所述的乙臘與水的體積比為50:50。
[0019] 本發(fā)明所述的利用微生物轉化生產糖巧類化合物的方法，具體步驟如下：
[0020] (1)平板培養(yǎng):取去皮馬鈴馨20g，加入200ml去離子水煮沸并保持20min;冷卻后過 濾，取過濾后的清液加2g葡萄糖和2g瓊脂，常壓加熱使瓊脂全部溶解后，加去離子水定容至 100ml;115°C下滅菌30min，待培養(yǎng)基冷卻至50°C左右后，按無菌操作法倒平板(每皿約倒 15ml)，平置，待凝后制得PDA平板;用接種環(huán)挑取短刺小克銀漢霉的菌絲體在PDA平板上劃 線，于28 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天，4 °C保存；
[0021] (2)種子培養(yǎng):取去皮馬鈴馨200g，加入1000ml去離子水煮沸并保持20min;冷卻后 過濾，取過濾后的清液加20g葡萄糖，葡萄糖全部溶解后，加去離子水定容至1000ml，分裝于 250ml錐形瓶中，115°C下滅菌30min，得種子培養(yǎng)基;從短刺小克銀漢霉菌株平板中用接種 環(huán)挑取一環(huán)菌絲體，接種到有100ml的種子培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，用棉塞封口后放于28 °C，180巧m條件下震蕩培養(yǎng)24小時，得種子液；
[0022] (3)微生物轉化試驗：量取30ml左右的種子液（接種量為20%)加入到裝有350ml PDA培養(yǎng)基的無菌、lOOOmL的錐形瓶中，用棉塞封口后放于18化pm、28°C的生物搖床中進行 振蕩培養(yǎng)，36小時后將50-200ml、lOmg/ml降苦參酬丙酬溶液加入到PDA培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng) 5天；
[0023] (4)糖巧化轉化產物的提取:過濾發(fā)酵培養(yǎng)液，濾液用等體積的乙酸乙醋萃取5次。 合并萃取有機相，真空減壓濃縮至干，得轉化殘渣。將殘渣溶解于少量丙酬，與兩倍量硅膠 (200-300目）拌樣，W-根30倍于樣品量的硅膠柱分離(4X5cm)，氯仿-丙酬梯度洗脫（100: 5-1:1)，收集饋分，可獲得糖巧降苦參酬糖巧化產物。該饋分W甲醇-水(55:45)為流動相， 利用制備型高效液相分離得到轉化產物2'甲氧基-6"徑基-降苦參酬-7-Ο-β-Ο-葡萄糖巧 6mg(I)和降苦參酬7-0-β-0-葡萄糖巧（Π );饋分再進一步利用乙臘-水系統(tǒng)(50:50)分離得 到轉化產物6"徑基-降苦參酬-7-0-β-0-葡萄糖巧（虹）和7"-徑基-2 甲氧基-降苦參酬-7- Ο-β-D-葡萄糖巧(IV)。
[0024] (5)糖巧類化合物的鑒定:對上述轉化產物（Ι)(Π )(虹）（IV)經過UV、IR、MS、NMR等 儀器方法進行了結構鑒定確定為降苦參酬的糖巧化轉化產物。
[0025] (6)抗腫瘤活性測定:選用人宮頸癌細胞化eLa)、人黑色素瘤細胞(A375)為受試對 象，降苦參酬及其相應的4個糖巧化微生物轉化產物進行抗腫瘤活性的測定。
[0026] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下有益效果：
[0027] 本發(fā)明的方法是微生物發(fā)酵培養(yǎng)到一定時間，添加一定濃度的降苦參酬溶液，微 生物自身產生的酶對底物進行了結構修飾，發(fā)生了糖巧化反應，產生了高活性、低毒性的糖 巧化轉化產物。根據文獻報道，糖巧化在微生物轉化中極少被觀察到，而本發(fā)明首次提出了 利用微生物轉化手段制備黃酬糖巧類天然產物，本發(fā)明還獲得了 4個新的黃酬糖巧化產物。
【附圖說明】
[0028] 圖1是本發(fā)明的工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0029] W下結合實施例對本發(fā)明做進一步描述。
[0030] 實施例1
[0031] (1)平板培養(yǎng):取去皮馬鈴馨20g，加入200ml去離子水煮沸并保持20min;冷卻后過 濾，取過濾后的清液加2g葡萄糖和2g瓊脂，常壓加熱使瓊脂全部溶解后，加去離子水定容至 100ml;115°C下滅菌30min，待培養(yǎng)基冷卻至50°C左右后，按無菌操作法倒平板(每皿約倒 15ml)，平置，待凝后制得PDA平板;用接種環(huán)挑取短刺小克銀漢霉的菌絲體在PDA平板上劃 線，于28 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，4 °C保存；
[0032] (2)種子培養(yǎng):取去皮馬鈴馨200g，加入1000ml去離子水煮沸并保持20min;冷卻后 過濾，取過濾后的清液加20g葡萄糖，葡萄糖全部溶解后，加去離子水定容至1000ml，分裝于 250ml錐形瓶中，115°C下滅菌30min，得種子培養(yǎng)基;從短刺小克銀漢霉菌株平板中用接種 環(huán)挑取一環(huán)菌絲體，接種到有100ml的種子培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，用棉塞封口后放于28 °C，180巧m條件下震蕩培養(yǎng)24小時，得種子液；
[0033] (3)微生物轉化試驗：量取30ml左右的種子液（接種量為20%)加入到裝有350ml PDA培養(yǎng)基的無菌、lOOOmL的錐形瓶中，用棉塞封口后放于18化pm、28°C的生物搖床中進行 振蕩培養(yǎng)，36小時后將50ml、10mg/ml降苦參酬丙酬溶液加入至帆Μ培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)5天。
[0034] (4)糖巧化轉化產物的提取:過濾發(fā)酵培養(yǎng)液，濾液用等體積的乙酸乙醋萃取5次。 合并萃取有機相，真空減壓濃縮至干，得轉化殘渣1.67g。將轉化殘渣溶于少量丙酬，與兩倍 量硅膠(200-300目）拌樣，W-根30倍于樣品量的硅膠柱分離(4X5cm)，氯仿-丙酬梯度洗 脫（100:5-1:1)，收集第五個饋分，可獲得214mg。該饋分W甲醇-水(55:45)為流動相，利用 制備型高效液相分離得到轉化產物（1)2.8111旨，（11)3.39111旨;饋分再進一步利用乙臘-水系統(tǒng) (50:50)分離得到轉化產物（虹）4.5mg，（ IV) 5.45mg。
[0035] (5)糖巧類化合物的鑒定:對上述轉化產物經過1^、13、15、醒1?等儀器方法進行了 結構鑒定確定為：（I)2 ' -甲氧基-6"徑基-降苦參酬-7-0-β-0-葡萄糖巧，（Π )降苦參酬7-0- β-D-葡萄糖巧，（虹）6"-徑基-降苦參酬-7-Ο-β-Ο-葡萄糖巧9mg，（IV)7"-徑基-2'-甲氧基- 降苦參酬-7-0-β-0-葡萄糖巧。
[0036] 實施例2
[0037] (1)平板培養(yǎng):取去皮馬鈴馨20g，加入200ml去離子水煮沸并保持20min;冷卻后過 濾，取過濾后的清液加2g葡萄糖和2g瓊脂，常壓加熱使瓊脂全部溶解后，加去離子水定容至 100ml;115°C下滅菌30min，待培養(yǎng)基冷卻至50°C左右后，按無菌操作法倒平板(每皿約倒 15ml)，平置，待凝后制得PDA平板;用接種環(huán)挑取短刺小克銀漢霉的菌絲體在PDA平板上劃 線，于28 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，4 °C保存；
[0038] (2)種子培養(yǎng):取去皮馬鈴馨200g，加入1000ml去離子水煮沸并保持20min;冷卻后 過濾，取過濾后的清液加20g葡萄糖，葡萄糖全部溶解后，加去離子水定容至1000ml，分裝于 250ml錐形瓶中，115°C下滅菌30min，得種子培養(yǎng)基;從短刺小克銀漢霉菌株平板中用接種 環(huán)挑取一環(huán)菌絲體，接種到有100ml的種子培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，用棉塞封口后放于28 °C，180巧m條件下震蕩培養(yǎng)24小時，得種子液；
[0039] (3)微生物轉化試驗：量取30ml左右的種子液（接種量為20%)加入到裝有350ml PDA培養(yǎng)基的無菌、lOOOmL的錐形瓶中，用棉塞封口后放于18化pm、28°C的生物搖床中進行 振蕩培養(yǎng)，36小時后將100ml、10mg/ml降苦參酬丙酬溶液加入至化DA培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)5 天。
[0040] (4)糖巧化轉化產物的提取:過濾發(fā)酵培養(yǎng)液，濾液用等體積的乙酸乙醋萃取5次。 合并萃取有機相，真空減壓濃縮至干，得轉化殘渣3.5g。將轉化殘渣溶于少量丙酬，與兩倍 量硅膠(200-300目）拌樣，W-根30倍于樣品量的硅膠柱分離(4X5cm)，氯仿-丙酬梯度洗 脫（100:5-1:1)，收集第五個饋分，可獲得460mg。該饋分W甲醇-水(55:45)為流動相，利用 制備型高效液相分離得到轉化產物（I)6mg，（n)7mg;饋分再進一步利用乙臘-水系統(tǒng)(50: 50)分離得到轉化產物（虹)9mg，（ IV) 1 Img。
[0041] (5)糖巧類化合物的鑒定:對上述轉化產物經過1^、13、15、醒1?等儀器方法進行了 結構鑒定確定為：（I)2 ' -甲氧基-6"徑基-降苦參酬-7-0-β-0-葡萄糖巧，（Π )降苦參酬7-0- β-D-葡萄糖巧，（虹）6"-徑基-降苦參酬-7-Ο-β-Ο-葡萄糖巧9mg，（IV)7"-徑基-2'-甲氧基- 降苦參酬-7-0-β-0-葡萄糖巧。
[0042] 實施例3
[0043] (1)平板培養(yǎng):取去皮馬鈴馨20g，加入200ml去離子水煮沸并保持20min;冷卻后過 濾，取過濾后的清液加2g葡萄糖和2g瓊脂，常壓加熱使瓊脂全部溶解后，加去離子水定容至 100ml;115°C下滅菌30min，待培養(yǎng)基冷卻至50°C左右后，按無菌操作法倒平板(每皿約倒 15ml)，平置，待凝后制得PDA平板;用接種環(huán)挑取短刺小克銀漢霉的菌絲體在PDA平板上劃 線，于28 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，4 °C保存；
[0044] (2)種子培養(yǎng):取去皮馬鈴馨200g，加入1000ml去離子水煮沸并保持20min;冷卻后 過濾，取過濾后的清液加20g葡萄糖，葡萄糖全部溶解后，加去離子水定容至1000ml，分裝于 250ml錐形瓶中，115°C下滅菌30min，得種子培養(yǎng)基;從短刺小克銀漢霉菌株平板中用接種 環(huán)挑取一環(huán)菌絲體，接種到有100ml的種子培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，用棉塞封口后放于28 °C，180巧m條件下震蕩培養(yǎng)24小時，得種子液；
[0045] (3)微生物轉化試驗：量取30ml左右的種子液（接種量為20%)加入到裝有350ml PDA培養(yǎng)基的無菌、lOOOmL的錐形瓶中，用棉塞封口后放于18化pm、28°C的生物搖床中進行 振蕩培養(yǎng)，36小時后將200ml、10mg/ml降苦參酬丙酬溶液加入至化DA培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)5 天；
[0046] (4)糖巧化轉化產物的提取:過濾發(fā)酵培養(yǎng)液，濾液用等體積的乙酸乙醋萃取5次。 合并萃取有機相，真空減壓濃縮至干，得轉化殘渣7.2g。將轉化殘渣溶于少量丙酬，與兩倍 量硅膠(200-300目）拌樣，W-根30倍于樣品量的硅膠柱分離(4X5cm)，氯仿-丙酬梯度洗 脫（100:5-1:1)，收集第五個饋分，可獲得930mg。該饋分W甲醇-水(55:45)為流動相，利用 制備型高效液相分離得到轉化產物（I) 13. Img，（ Π ) 14.5mg;饋分再進一步利用乙臘-水系 統(tǒng)（50:50)分離得到轉化產物（虹）17.6mg，（ IV) 23.6mg。
[0047] (5)糖巧類化合物的鑒定:對上述轉化產物經過1^、13、15、醒1?等儀器方法進行了 結構鑒定確定為：（I)2 ' -甲氧基-6"徑基-降苦參酬-7-0-β-0-葡萄糖巧，（Π )降苦參酬7-0- β-D-葡萄糖巧，（虹）6"-徑基-降苦參酬-7-Ο-β-Ο-葡萄糖巧9mg，（IV)7"-徑基-2'-甲氧基- 降苦參酬-7-0-β-0-葡萄糖巧。
[0048] 抗腫瘤活性測定：降苦參酬及其相應的4個糖巧化微生物轉化產物(實施例1、2、3 獲得的轉化產物分別進行合并)進行抗腫瘤活性的測定，選用人宮頸癌細胞化eLa)、人黑色 素瘤細胞(A375)為受試對象，結果顯示結構中引入葡萄糖單元，不僅可明顯增加其水溶性 同時抗腫瘤活性顯著提高。降苦參酬及其相應的4個糖巧化微生物轉化產物的體外細胞毒 活性篩選結果見表1。
[0049] 表1降苦參酬及其相應的4個糖巧化微生物轉化產物的體外細胞毒活性篩選結果
[(K)加]
【主權項】
1. 一種利用微生物轉化生產糖苷類化合物的方法，其特征在于步驟如下： (1) 平板培養(yǎng)：用接種環(huán)挑取短刺小克銀漢霉的菌絲體在PDA平板上劃線，于恒溫培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)，4°C保存，得到短刺小克銀漢霉菌株平板； (2) 種子培養(yǎng):從短刺小克銀漢霉菌株平板中用接種環(huán)挑取一環(huán)菌絲體，接種到有種子 培養(yǎng)基的錐形瓶中，用棉塞封口后震蕩培養(yǎng)，得種子液； (3) 微生物轉化試驗:量取種子液加入到裝有PDA培養(yǎng)基的無菌錐形瓶中，用棉塞封口 后放于生物搖床中進行振蕩培養(yǎng)，36小時后將降苦參酮丙酮溶液加入到PDA培養(yǎng)基中，繼續(xù) 培養(yǎng)，得發(fā)酵培養(yǎng)液； (4) 糖苷化轉化產物的提取:過濾發(fā)酵培養(yǎng)液，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取，合并萃 取有機相，真空減壓濃縮至干，得轉化殘渣；將殘渣溶解于丙酮，與硅膠拌樣，以硅膠柱分 離，氯仿-丙酮梯度洗脫，收集餾分;該餾分以甲醇-水為流動相，利用制備型高效液相分離 得到轉化產物2'甲氧基-6〃羥基-降苦參酮-7-〇-i3-D-葡萄糖苷（I)和降苦參酮7-〇-i3-D-葡 萄糖苷（Π );餾分再進一步利用乙腈-水系統(tǒng)分離得到轉化產物6〃羥基-降苦參酮-7-0-β-D-葡萄糖苷(ΙΠ )和7〃-羥基-2'-甲氧基-降苦參酮-7-(H3-D-葡萄糖苷(IV)。2. 根據權利要求1所述的利用微生物轉化生產糖苷類化合物的方法，其特征在于步驟 (1) 中所述的恒溫培養(yǎng)箱的溫度為28°C，培養(yǎng)時間為3-5天。3. 根據權利要求1所述的利用微生物轉化生產糖苷類化合物的方法，其特征在于步驟 (2) 中所述的震蕩培養(yǎng)條件為28 °C，180rpm，培養(yǎng)時間24小時。4. 根據權利要求1所述的利用微生物轉化生產糖苷類化合物的方法，其特征在于步驟 (3) 中所述的振蕩培養(yǎng)條件為180rpm、28 °C。5. 根據權利要求1所述的利用微生物轉化生產糖苷類化合物的方法，其特征在于步驟 (3)中所述的降苦參酮丙酮溶液的濃度為10mg/ml。6. 根據權利要求1所述的利用微生物轉化生產糖苷類化合物的方法，其特征在于步驟 (3)中所述的降苦參酮丙酮溶液的加入量為50-200ml。7. 根據權利要求1所述的利用微生物轉化生產糖苷類化合物的方法，其特征在于步驟 (3) 中所述的繼續(xù)培養(yǎng)時間為5天。8. 根據權利要求1所述的利用微生物轉化生產糖苷類化合物的方法，其特征在于步驟 (4) 中所述的甲醇與水的體積比為55:45。9. 根據權利要求1所述的利用微生物轉化生產糖苷類化合物的方法，其特征在于步驟 (4)中所述的乙腈與水的體積比為50:50。
【文檔編號】C12P19/60GK106011202SQ201610344664
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月21日
【發(fā)明人】師艷秋, 梁寶東, 彭浩, 趙強, 王曉強, 袁其朋
【申請人】濟寧學院